基因工程使用CRISPR

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1、基因工程使用 CRISPR-Cas9 system目标核酸酶是强大的工具对于高精度调节基因组。来自微生物适应性免疫系统(crispr)的指导 RNA cas9核酸酶可以被用来促进高效的真核细胞基因组工程，通过在其指导rna内指定一 个 20-nt 目标序列。在这里,我们描述一组用来基因组编辑工具cas9-mediated,通过(NHEJ)或(HDR)在哺乳动物细胞中，以及 下游功能研究代转基因细胞系。为了减少非目标分裂，我们进一步描述double-nicking策略使 用用配对的指导rna的cas9 nickase突变。这个协议提供了实验结果为指导的目标选择，分裂 效率的评价和分析非目标活动。

2、目标设计、基因修改可以在短短1-2 周实现，修改克隆细胞 株2-3周内可生成。introduction控制生物系统能力，在基础科学生物、药学和生物技术拥有巨大的应用潜力。可编程具体序 列核酸酶、促进内源性基因位点的精确编辑现在可以实现系统基因组功能的讯问和在广泛的 物种基因变异，包括那些以前没有基因易处理的。最近几年出现了大量的基因组编辑技术，包 括(ZFNs),(Talens)和crispr。前两种技术使用了限制核酸内切酶催化域来模块化DNA结合蛋 白质的策略包括诱导DNA双链断裂(DSB)。相比之下,Cas9是小rna引导下的核酸酶,通过与 沃森克里克目标 DNA 碱基配对，代表系统明显更

3、容易设计，非常具体、高效、很好的高产适 应度和对于多种类型的细胞和生物体有多路复用基因编辑。使用工程核酸酶的基因组精确编辑和ZFNs和talens很像,Cas9通过刺激在目标基因位点DSB促进基因组编辑。通常根据Cas9 分裂,目标位点进行DNA损伤修复的两个主要途径之一(图2):容易出错NHEJ或高保真HDR 途径，两者都可以用来实现所需的编辑结果。缺乏修复模板情况下，DSB通过NHEJ重新捆 绑，使缺口发生插入/删除(indel)的突变。NHEJ可以被用来调节基因淘汰,indels发生在编码外 显子会导致移码突变和过早地停止密码子。多个DSB另外可以用来调解更大的基因组中删 除。HDR是另

4、一个主要的DNA修复途径。尽管HDR通常发生在比NHEJ更低，频率更多样的 情况下，它可用于在外在的引入修复模板存在的情况下在目标位点生成精确明确修改。修复 模板的形式可以是使用同源臂侧面插入序列的传统双链DNA目标结构,或单链DNA寡核苷 酸(ssODNs)。后者提供了一种有效而简单的方法使小编辑基因组中，如探索随机的基因变异 的单核苷酸突变。与NHEJ不一样,HDR通常只在细胞分裂活跃,和它的效率差别很大取决于 细胞类型和状态,以及基因位点和修复模板。Cas9: 对于基因组编辑的 RNA 引导核苷酸Crispr-cas 是用 RNA 引导核苷酸来分开外来基因元素的微生物适应性免疫系统。三种

5、类型 (1-3)CRISPR 系统已经被确认在广泛的宿主细菌和古细菌存在,其中每个系统由一群CRISPR-associated(Cas)基因,非编码rna和一系列独特的重复元素(直接重复)。这些重复被隔 开通过短的多样的来自外源DNA序列目标(称为protospacers)，和他们一起构成了 CRISPR RNA(crRNA)排列。在 DNA 目标内，每个 protospacer 总是与 protospacer adjacent motif (PAM) 相连，可多样化依赖于特定的CRISPR系统。II型CRISPR系统是一个最好的特点的、，由核酸酶Cas9,crRNA排列编码指导rna和必需的

6、、 辅助的、促进crRNA排列变成离散单元的进程的trans-activating crRNA(tracrRNA)。然后每 个crRNA单元包含一个20-nt指导序列和部分直接重复，前者指导Cas9变成20-bp DNA目 标通过沃森克里克配对(图1)。在来自酿脓链球菌和CRISPR-Cas system中，(该协议中使DNA（例如人类EMX1位点）通过一个20-nt引导序列（蓝色）和支架（红色） 组成的sgRNA。引导序列（蓝色栏上链）在直接上游的必需的 5-NGG（PAM粉色）与DNA目标配对Cas9在上游的PAM（红色三角形）。 协调DSB3bp。而其他Cas9直接同源可能有不同的PAM

7、需求，如S. thermophilus （5-NNAGAA for CRISPR1 和 5-NGGNG for CRISPR3）和脑膜炎双球菌（5-NNNNGATT）。CRISPR-Cas的RNA引导的核酸酶的作用是通过不同表达人类最优密码子的Cas9和必要的 RNA来组成重组在哺乳动物细胞上。此外, crRNA和tracrRNA融合在一起来创建一个嵌合， 单引导的RNA（sgRNA）（图1）。Cas9因此可以通过改变sgRNA在内的20-nt引导序列在最接 近的PAM序列上重新定向到几乎所有的兴趣目标。由于其易于实现和多路复用能力,Cas9 直用于通过NHEJ和HDR生成带着特定突变工程真

8、核细胞型。直接注入sgRNA和信使rna编码Cas9成胚胎在多个等位基因修改上使转基因小 鼠快速传代。这些结果编辑生物的巨大前景，否则基因棘手。Cas9核酸酶利用保守的HNH和RuvC核酸酶域进行特定断裂分裂，这可以突变和利用额外 的功能。aspartate-to-alanine（D10A）突变在RuvC催化域下允许Cas9切口酶突变（Cas9n） 而不是分裂DNA单链断裂，后续优先修理通过HDR可以潜在地从off-target的DSBs减少 不必要的indel突变的频率。适当的补偿sgRNA可以指导Cas9n同时刻痕于目标位点来调节 DSB,从而有效地增加目标识别的特异性。此外Cas9突变与

9、DNA-cleaving催化残基突变已 经适应了在大肠杆菌启用转录调控，证明构建Cas9的潜力对于不同的应用程序，如荧光蛋白 标签的补偿或染色质一一修改特定基因位点酶报告或调节基因功能。这里我们详细解释如何使用人类的密码子优化、细胞核定位侧面的序列野生型（WT）Cas9核 酸酶或突变Cas9切口酶促进真核基因编辑。我们描述设计20-nt引导序列的原因，和快速建 设和功能验证sgRNAs协议，最后使用Cas9核酸酶来调解NHEJ-based和HDR-based基因组 修改（HEK 293英尺）和人类干细胞（HUES9）线（图3）。Cas9系统同样可以应用到其他类型的 细胞和生物体，包括人类，小鼠

10、、斑马鱼、果蝇和线虫。比较与其他基因组编辑技术像其他核酸酶技术，如ZFNs和talents,Cas9可以促进目标DNADSB针对哺乳动物基因组特定 位点（interest）,刺激基因组编辑通过NHEJ或HDR。Cas9通过ZFNS and TALENs提供了几 种潜在的优势和取得，包括定制的缓解，更高的目标效率和促进多元基因组编辑的能力。因为 自定义ZFNs通常很难设计，我们将主要比较Cas9和TALEN。易于定制。分裂模式。RNADSBHDRNHEJGenomic 5 - .J DNA - 即FI呻ir htemplate SPrecise gmnm editingPremature*sto

11、pIn日rrutation afxfen图2 IDSB修复促进基因编辑。Cas9（黄色）引起的DSB可以以两种方式中的一种修复。容易出错NHEJ通路,结尾的DSB被内源性DNA修复 机械处理过和被重新加入,这会导致接口处随机indel突变。Indel突变发 生在一个基因的编码区可能导致转移（碱基的）和创建一个过早终止密 码子,导致基因敲除。另外，质粒形式的修复模板或ssODN可以利用HDR 通路，使得高保真和精确的编辑。单链DNA也能导致HDR缺口。ml別峑凸U.EI.盞1MEHEHJUHrlr图 3 |时间轴和实验的概述。对试剂的步骤设计、施行、验证和 细胞系扩张进行描述。为每个目标自定义的

12、sgRNAs(浅蓝色)，以 及 pcr 引物, 在电脑中通过 CRISPR 设计工具设计(网站 ) 。 sgRNA 引导序列克隆到表达质粒轴承sgRNA脚手架骨干(BB)和Cas9 pSpCas9(BB)。由此产生的质粒被标注为pSpCas9(sgRNA)。完成 并序列证实的pSpCas9(sgRNA)质粒和可选为促进HDR的修复模 被转染到细胞和测验它们的调解有针对性的分裂的能力。最后， 转染细胞可以无性繁殖系地扩大以在特定突变下推导出同基因的细胞系。编辑效率。SpCas9和TALENS对于多种细胞类型和生物有促进基因组编辑的效率。然而,由 于目标的难易程度,CAS9同时可用于针对多个基因位

13、点，通过合传递sgRNAs的组合到细胞 行列中。Cas9系统的局限性Cas9可以通过20-nt sgRNA引导序列针对特定基因位点。选择Cas9目标位置的唯一要求是 存在一个PAM序列直接3 20bp目标序列。每个Cas9直接同源序列有一个独特的PAM;例 如,SpCas9需要5 -NGG PAM序列。这个PAM要求不严重限制SpCas9的目标范围一-在人类 基因组内，这样的目标位置可以在平均每8C12 bp内找到（参考文献。22,51）。除了目标范 围,另一个可能限制是潜在的脱靶诱变;详情请见盒 1 和 2 和在最小脱靶的修改策略。注 意,PAM序列需要立即跟随tar - DNA位点，但这并

14、不是一个在sgRNA 20-nt引导序列的一部 分。实验设计sgRNA的目标选择。Cas9核酸酶的特异性是由sgRNA中的20-nt引导序列。对于链球菌系 统，目标序列必须立即领先（如。5 -GTC ACCTCCAATGACTAGGG-3）（也就是5 TO）于5-NGG PAM,然后有相反链的20-nt引导序列碱基对来调解Cas9分裂 3bp的PAM的上游（图1和 4）。请注意,PAM序列需要立即跟随目标DNA位点，但它不是一个在sgRNA的20-nt引导序列 的一部分。因此,有两个主要因素的选择目标基因的20-nt引导序列：（i）5 -NGGPAM对于链球菌Cas9 和（ii）最小化的脱靶活

15、动。我们提供在线CRISPR设计工具（http:/ tools.genome-engineering.org）需要一个基因序列的行列和确定合适的目标位点。为实验 评估每个sgRNA脱靶基因的修改，我们也提供计算预测脱靶位置（一个详细的讨论，见盒1）对 于每个目标，排名根据我们定量特异性分析对于碱基配对不匹配的影响，地位和分布。增加针 对特异性,另外一个可选择的策略使用D10A Cas9 （Cas9n）的（DNA）切口酶-突变体带着一对 sgRNAs可能被采用。这样sgRNA对的方向和间距的设计标准在盒2中描述。CRISPR设计工具提供序列寡核苷酸和必要的引物对于（i）准备sgRNA所必需的结构

16、，（2）分析 目标修改效率（3）评估在潜在的脱靶位点的分裂。值得的注意是,因为被用来表达 sgRNAIII U6 RNA聚合酶启动子倾向鸟嘌吟（G）核苷酸作为它转录第一碱基，额外的G附加在sgRNA的 5 上，这里的20-nt引导序列不从G开始（图4 b,c）。在极少数情况下，某些sgRNAs可能 不起作用原因未知,因此我们建议对于每个位点设计至少两个sgRNAs和在目标细胞类型测 试他们的效率。sgRNA构建和传递的方法。根据所需的应用程序,sgRNAs可以被传递成PCR表达包含盒扩增 子（图4 b）或者sgRNA-expressing质粒（图4 c）。pcr基础的sgRNA的传递附加上自定义 sgRNA序列到用于放大U6子模板反向PCR引物（图4 b）。得到的扩增子可以用被转染通过 Cas9表达质粒pSpCas9。这个方法是最优的快速筛选候选sgRNAs,细胞转染功能测试获得后 不久就可以执行sgRNA-encoding引物。因为这简单的方法消除需要plasmid-based克隆和 序列验证,它非常适合测试或转染大量sgRNAs生成大量淘汰函数或其他规模-敏感的应用程 序。注意，sgRNA-encoding 引物