基因表达载体构建实验方法

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1、基因表达载体构建实验方法基因表达载体构建实验目的较为官方的解释为：使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。通过这 种手段，我们就可以将众多的目的基因进行异源性的表达，因此能够快速并且大量的富集到对应的目的蛋白；此外，我们还能够以农杆菌 为目的基因的载体，通过植物侵染的方式，将目的基因转入到植物中， 从而形成特殊的遗传材料，进行特定的课题研究。基因表达载体构建实验原理通俗点来理解，就是我们将一个感兴趣的基因，通过一种手段将 其放到一个表达载体上，这个表达载体一般为细菌细胞内特有的一种 环状双链DNA分子，称为质粒。将目标基因连接到质粒上之后，

2、得到 的就是一个人为拼接后的重组质粒，我们称之为表达载体。接下来我 们就可以通过转化的方法，将这个重组质粒转化到感受态细菌中，例如trans5a,DH5a, DB3101等等菌株中。将转化成功的细菌克隆进 行培养繁殖，得到的菌液就可以进行长时间冷冻保存了。待需要使用 时，只需要将菌种从-80弋取出，进行复苏并培养，然后进行质粒提取， 就可以再次拿到大量的目的基因表达载体，供后续实验使用。基因表达载体构建实验步骤设计引物，PCR扩增目的基因片段，切胶回收 目的基因加A,体系：10 X easy buffer 1uldATP0.8 ulTaq 酶O.lul回收产物8ul72C 40minXcml

3、酶切 En-ccdB ( 50ul )En-ccdB 质粒(200ng/ul)50ul (lug)10X NE buffer50ulH2O38ulXcmI 酶2ul10U37C 1h , 65C 20min 热失活，跑胶回收（约 2600bp ）加A后的产物与酶切的pEntry-T连接摩尔比1:15:1 （10ul体 系）加A的回收产物ul酶切后的En-Tul5XT4 buffer 1ulT4 ligase 0.5 ulH2O补齐22C 1h转化DH5a,涂LB固体培养基（kana）,筛选阳性克隆后进行测 序验证碱基序列。自此一个基因表达载体正式构建完成，可以根据需要进行后续的 进一步研究实验了。