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1、1.第一代 DNA 核酸酶编辑系统 ZFNsFok I 酶的収现促迚了 ZFNs 的出现1996 年，美国约翰霍普金斯大学环境卫生科学系 Chandrasegaran团队构建了基于Fok I酶和锌指蛋白融合的ZFNs技术尽管 ZFNs 技术在多个物种中成功进行了基因编辑，但是锌指蛋白的设计费时费力，成 本较高，限制了该方法的大规模应用。2.第二代 TALENs2009年，发现了来自植物致病黄单胞菌属的转录激活效应蛋白(transcription-activator-like effector, TALE)和DNA的相互作用。相对于 ZFNs 来说， TALENs 的设计变得容易，对任意 的 D
2、NA 序列理论上都可以设计 和构建一个特异的TALEN核酸酶。但是目标序列的每个碱基都需要一个TALE识别模块， 因此TALENs的构建过程工作量较大。此外，TALENs在人类细胞中的细胞毒性较低。第 一次使用TALENs在人类细胞中对NTF3和CCR5基因进行编辑，证明了 TALEN核酸酶对 内源靶向基因的调节和修饰作用。3.第三代 CRISPR/Cas9 系统CRISPR/Cas9系统来源于细菌和古细菌的天然获得性免疫系统，通过CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合体抵御外源性DNA 的入侵。相比较
3、 ZFNs 和 TALENs， CRISPR/Cas9 通过一段与目标 DNA 片段匹配的向导 RNA 引导核酸酶识别靶向位点，提高了 Cas9 核酸酶的特异性；同时， Cas9 在 sgRNA 的引导 下以单体蛋白的形式发挥功能，不像ZFNs和TALENs的Fok I酶只有二聚化才具有切割 靶向 DNA 的活性，因此 CRISPR/Cas9 也避免了精细复杂的蛋白质设计或组装的需要。但 是，由于 CRISPR/Cas9 来自于原核生物天然获得性免疫系统抵御外来遗传物质的防御系 统， Cas9 核酸酶可能继承了序列特异性低的特点，使其非特异性切割的几率增加，造成脱 靶效应增多。最新进展：不同的
4、科研团队提出了不同的斱法修饰或编辑Cas9和sgRNA以降低脱靶效应。如将 Cas9蛋白与Fok I核酸酶、锌指蛋白或者TALE蛋白结合提高Cas9的特异性；用失活的 Cas9蛋白和Fok I区域融合形成新的核酸酶，使其只有在核酸酶二聚化时才具有活性； Fatih等将锌指蛋白或者TALE蛋白与Cas9蛋白变异体融合增强核酸酶的特异性。另一种 降低脱靶效应的斱法是使用切口酶代替核酸酶，产生单链断裂而不是双链断裂，单链断裂不 能诱导NHEJ的修复，仍然可以激活HR的精确修复。单链断裂可以使脱靶效应降低，但修 复效率也降低，因此有人提出了使用双切口酶的斱法，既提高了基因编辑的特异性也提高了 编辑的效
5、率。4.2016年最新技术-BE技术ZFNs、 TALENs 和 CRISPR/Cas9 技术都依赖于在靶位点诱导双链断裂迚而激活 DNA 的 NHEJ 和 HDR。 NHEJ 容易引起随机插入和缺失，造成移码突变，迚而影响靶基因的功 能; HDR尽管精确性高于NHEJ，但是其在细胞中的同源重组修复效率低，约为0.1%5%。 BE 技术的出现有效地改善了以上问题。该技术不需要 DNA 双链断裂也不需要同源模板即可进行单碱基转换的基因编辑技术。 从而显著提高了单碱基基因编辑的靶向范围。图 1JALL CKLSFR/( isy和 DM* 断裂惟复类璽Fig. 1 The strut tun; uf
6、 ZFN, TlLEM ftSPEl/(. as9 and the repair fpes uf DNA DSBsLWtiZFN 的体外黔遅刊対11依便用2帕氐 k.HJCusQ布人歩圳咆进厅TA.ENs -l 人处细n人晏细o&进斤基囲神4胞进H里因SSitP”早因JliM障血bn临2年我用ZF?册理轉工胁年，找用了如12歼，CR幅PlNb船20 4 &年.炬MTALE褲白皿11Ml*閱给棵擅术出琛网團2基因集辑技术的雄尿和应甲Develnpnu-nll dintii ilppliFltinn nf 胃rilernL” rditiin (terhnnhiiirH表 I ZFM緘 fALEs, LklSlK/Cixy 和 HE 技术的比较 Tbk l 匚ompurhuik bFZFN, TALEN, CRISPRJCjill站合曲启岛； 核幅皤设讣戍功林凸足1前怜逋嗾宰低；审疑痒列可惟适戒It:林斥11剪切；CHispRA vfJ编辑杭牢更們：WM41 -成亭低； 4 IS F 无限;H脫把氓率较局： IE砸比蛆敢犖低BE小龍进和聲除令1禺小辄点醤近的血紀甸的*毗的出昇5.技术的应用领域5.1 在疾病动物模型构建及疾病治疗中的应用5.2 在肿瘤免疫治疗中的应用5.3 在人胚胎编辑中的应用5.4 在临床诊断上的应用
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