流式细胞的原理及临床应用

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1、流 式 的 原 理 及 临 床 应 用 什 么 是 流 式 细 胞 仪 ？ 检 测 流 动 中 细 胞 （ 颗 粒 ） 的 仪 器 目 标 物 可 以 是 细 胞 、 细 菌 或 各 种 微 粒0.5um50um范 围 内 流 式 细 胞 仪 原 理 介 绍 流式细胞仪基本原理示意图 流 式 细 胞 仪 检 测 什 么 信 号 ？细 胞 抗 原 抗 体 荧 光 激 光 束 通 过 流 式 细 胞 仪 我 们 可 以 得 到 以 下 信 息 - 相 对 细 胞 颗 粒 密 度 和 内 部 复 杂 度 (SSC) - 相 对 细 胞 大 小 (FSC) - 染 色 过 细 胞 的 相 对 荧 光

2、强 度 流 式 细 胞 仪 标 本 准 备染 色 的 一 般 原 则 及 方 法 标 本 来 源 ： 外 周 血 、 骨 髓 、 组 织 块 、 培 养 细 胞 、 脱 落细 胞 及 其 他 。 以 及 血 清 或 各 类 体 液 样 本 。 抗 体 染 色 一 般 方 法 外 周 血 白 细 胞 分 析 ： 100ul全 血 血 小 板 分 析 ： 15ul全 血 （ 根 据 样 本 血 小 板 数 量 ） 红 细 胞 分 析 ： 1ul全 血 （ 根 据 样 本 中 红 细 胞 数 稀 释 后 使 用 ） 骨 髓 ： 100ul 其 他 样 本 ， 计 数 后 决 定 使 用 体 积目 标

3、 细 胞 数 量 及 检 测 终 浓 度 ： 1 106/ml 孵 育 、 溶 血 、 固 定 抗 体 孵 育 ： 室 温 下 避 光 15分 钟 （ 某 些 情 况 下 如 ： 细 胞内 因 子 检 测 需 冰 育 ） 溶 血 ： 如 样 本 含 中 有 红 细 胞 需 溶 血 样 本 溶 血 后 离 心 上 机 检 测 （ 固 定 后 可 放 置 较 长 时 间 ） 流 式 细 胞 仪 分 析 报 告 及 图 谱 SS（ 侧 向 散 射 光 ） -反 应 细 胞 内 物质 的 多 少 FS（ 前 向 散 射 光 ） -反 应 细 胞 大 小 设 门 ： 选 择 要 分 析 的 细 胞 群

4、体 设 定 阴 性 、 阳 性 范 围 目 前 流 式 细 胞 仪 临 床 检 测 项 目 流 式 细 胞 仪 的 临 床 应 用=HIV免 疫 分 型 ， CD4绝 对 计 数=白 血 病 和 淋 巴 瘤 的 免 疫 分 型=肿 瘤 的 细 胞 周 期 和 倍 体 分 析=网 织 红 细 胞 计 数=细 胞 移 植 的 交 叉 配 型 和 免 疫 状 态 监 测=干 细 胞 计 数=残 量 白 血 病 细 胞 检 查=HLA-B27检 查=血 小 板 功 能 及 相 关 疾 病 1、 HLA-B27的 检 测 强 直 性 脊 柱 炎 （ ankylosing spondylistis） 意

5、为 弯 曲 的 脊 柱 。 它 是和 种 慢 性 、 进 行 性 和 炎 性 疾 病 ， 主 要累 及 骶 骼 关 节 、 脊 柱 、 脊 柱 骨 软 组 织及 四 肢 关 节 ， 表 现 为 椎 间 盘 维 环 和 纤维 环 附 近 结 缔 组 织 的 骨 化 ， 椎 间 动 关节 和 四 肢 关 节 滑 膜 的 炎 症 和 增 生 ， 严重 者 可 失 去 劳 动 能 力 。 强 直 性 脊 柱 炎是 血 清 阴 性 脊 柱 关 节 病 中 具 有 代 表 性的 疾 病 ， 临 床 上 曾 长 期 把 AS 误 认 为 是类 风 湿 性 关 节 炎 的 一 个 亚 型 ， 60 年 代以

6、来 人 们 才 认 识 到 期 无 论 从 病 因 学 、遗 传 学 、 流 行 病 学 和 临 床 表 现 特 点 等诸 多 方 面 来 看 ， AS 都 是 一 种 不 同 于 类风 湿 性 关 节 炎 的 独 立 疾 病 。 就 目 前 的 研 究 文 献 而 言 ， HLA-B27 与AS 并 非 绝 对 相 关 ， 有 些 AS 患 者 表 现为 HLA-B27阴 性 ， 而 且 并 非 所 有 HLA-B27 阳 性 者 均 出 现 AS 症 状 。 B27与 强 直 性 脊 柱 炎 HLA-B27诊 断 的 临 床 意 义 强 直 性 脊 柱 炎 90-100% 的 强 直 性

7、脊 柱 炎 患 者 HLA B27为 阳 性 。 但是 HLA-B27阳 性 的 人 群 中 只 有 8 20 是 强 直 性 脊 柱 炎 。 瑞 特 综 合 征 65 90 瑞 特 综 合 症 患 者 HLA-B27为 阳 性 。 如 果HLAB27+个 体 是 非 淋 菌 性 尿 道 炎 ， 那 么 有 20-25%的 可 能 性 发 展 为 瑞特 综 合 症 ， 只 有 1 的 可 能 性 正 常 。 HLA B27不 是 该 疾 病 发 生 的 必 要条 件 ， 但 是 却 与 病 程 发 展 有 紧 密 联 系 。 “ 反 应 性 关 节 炎 ” 是 一 种 自 身 限 制 的 少

8、关 节 型 关 节 炎 伴 随 着 革 兰 氏阴 性 细 菌 如 杆 菌 性 痢 疾 ， 沙 门 氏 菌 ， 弧 形 杆 菌 ， 耶 尔 森 氏 菌 和 至 贺 氏菌 引 起 的 胃 肠 感 染 。 银 屑 病 关 节 炎 - 90%的 银 屑 病 关 节 炎 联 合 荐 肠 关 节 炎 和 脊 椎 炎 患 者HLA B27阳 性 。 急 性 前 葡 萄 膜 炎 通 常 表 现 为 疼 痛 ， 畏 光 和 流 泪 。 可 能 是 虹 膜 感 染 或结 合 了 睫 状 体 或 视 网 膜 萎 缩 。 青 少 年 风 湿 症 /慢 性 关 节 炎 II 这 些 儿 童 中 75 为 HLA B27

9、+。 相 反 ，青 少 年 风 湿 症 /慢 性 关 节 炎 I， 同 样 也 是 少 关 节 性 的 ， 但 是 更 常 见 于 女孩 ， 与 慢 性 虹 膜 睫 状 体 炎 (30%)， 阳 性 的 ANA (80%)和 HLA DR5关 联 ，却 不 是 B27。 HLA-B27的 临 床 检 测 HLA-B27属 于 1型 MHC基 因 。 基 本 上 表 达 在 机 体 所 有 有 核 细胞 上 ， 特 别 是 淋 巴 细 胞 表 面 有 丰 富 的 含 量 。 使 用 荧 光 定 量 标准 微 球 ， 校 正 HLA-B27实 验 条 件 后 ， 测 定 样 本 中 T淋 巴 细

10、胞HLA-B27表 达 水 平 。 若 HLA-B27表 达 水 平 大 于 标 准 微 球 设 定MARK， 则 为 阳 性 结 果 ； 若 HLA-B27表 达 水 平 低 于 标 准 微 球设 定 MARK， 则 为 阴 性 结 果 。 Anti-HLA-B27 Kit(美 国 BD Biosciences公 司 ； CAT:340183)， 其 中 包 括 ： 1、 Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE 2、 HLA-B27 Calibration beads 3、 FACS Lysing Solution HLA-B27流 式 细 胞 仪 检 测 2、 淋 巴 细 胞 亚

11、 群 分 析 淋 巴 细 胞 亚 群 基 础 知 识 T淋 巴 细 胞 ： 主 要 杀 伤 病 原 体 感 染 细 胞 及 肿 瘤 细 胞 。 表 面 标 志 物 ： CD3， 与 TCR形 成 复 合 体 ， 是 T细 胞 识别 抗 原 和 转 导 信 号 的 主 要 单 位 。 CD3+/CD4+： 辅 助 性 T细 胞 CD3+/CD8+： 杀 伤 性 T细 胞 CD8+T细 胞 又 称 细 胞 毒 性 T细 胞 ， Tc或 CTL， 它 在 T细 胞 免疫 应 答 中 发 挥 重 要 功 能 。 Tc细 胞 识 别 抗 原 活 化 后 释 放 胞 浆 内 颗 粒 毒 素 ： 穿 孔 素

12、perforin和 颗 粒 酶 granzyme， 杀 伤 靶 细 胞 。 B淋 巴 细 胞 B淋 巴 细 胞 是 免 疫 系 统 中 的 抗 体 产 生 细 胞 。 1， 产 生 的 抗 体 可 与 抗 原 起 特 异 性 的 结 合 ， 如 中和 细 菌 的 外 毒 素 使 其 失 去 毒 性 作 用 ； 2， 抗 体 与 抗 原 结 合 后 形 成 的 复 合 物 易 被 吞 噬 细胞 清 除 ； 3， 抗 体 与 抗 原 结 合 后 再 结 合 补 体 清 除 病 原 体 。 B细 胞 特 异 性 标 志 物 ： CD19 NK细 胞 NK自 然 杀 伤 细 胞 ： 识 别 病 毒 感

13、 染 细 胞 表 面 表达 的 相 应 配 体 ， NK细 胞 一 经 识 别 病 毒 感 染 细胞 后 即 对 之 施 加 杀 伤 作 用 。 NK细 胞 表 面 标 志 物 ： CD3-/CD16+CD56+ 通 过 淋 巴 细 胞 亚 群 的 检 测 可 了 解 在 不 同 情 况 下 体 内免 疫 功 能 状 态 ， 辅 助 临 床 疾 病 的 诊 断 ， 探 索 疾 病 发病 机 理 、 病 程 、 预 后 ， 监 测 、 指 导 临 床 治 疗 方 案 。淋 巴 细 胞 亚 群 的 临 床 检 测 总 T和 总 B判 断 某 些 免 疫 缺 陷 和 自 身 免 疫 性 疾 病 T-

14、淋 巴 细 胞 上 升 多 见 于 ： 慢 性 活 动 性 肝 炎 或 慢 性 迁 延 性 肝炎 ； 器 官 移 植 排 斥 反 应 ； 重 症 肌 无 力 ； 甲 亢 与 甲 状 腺 炎 患者 ； 何 杰 金 病 T-淋 巴 细 胞 下 降 多 见 于 ： 恶 性 肿 瘤 ； 自 身 免 疫 性 疾 病 ， 如系 统 性 红 斑 狼 疮 、 类 风 湿 关 节 炎 等 ； 原 发 性 免 疫 缺 陷 病 ，如 生 天 性 胸 腺 发 育 不 全 等 、 艾 滋 病 ； 接 受 放 疗 、 化 疗 或 者使 用 肾 上 腺 皮 质 激 素 等 免 疫 抑 制 剂 B-淋 巴 细 胞 上 升 多

15、 见 于 ： 多 发 性 骨 髓 瘤 ； 巨 球 蛋 白 血 症 ；淋 巴 瘤 ； 艾 滋 病 B-淋 巴 细 胞 下 降 多 见 于 ： 原 发 性 免 疫 缺 陷 病 ， 如 性 联 无 丙种 球 蛋 白 血 症 等 、 恶 性 肿 瘤 T-淋 巴 细 胞 与 B-淋 巴 细 胞 同 时 下 降 多 见 于 ： 联 合 免 疫 缺 陷病 ， 如 重 症 状 联 合 免 疫 缺 陷 病 等 CD4+和 CD8+T细 胞 有 助 于 监 测 患 有 免 疫 缺 陷 疾病 （ 如 SCID、 AIDS的 病 人 体 内 CD4+细 胞 亚 群 的百 分 率 相 对 降 低 ， 而 CD8+群 体

16、 的 百 分 率 相 对 升高 ） ， 自 身 免 疫 性 疾 病 （ 如 在 SLE病 人 中 ， CD8+淋 巴 细 胞 的 相 对 百 分 比 往 往 会 降 低 ， 但 当 使 用 类固 醇 药 物 治 疗 时 ， 也 可 能 上 升 。 在 急 性 GVHD和移 植 排 斥 中 ， CD8+淋 巴 细 胞 所 占 的 比 例 有 可 能 在正 常 人 的 范 围 之 外 ） Th和 Ts淋 巴 细 胞 的 百 分 数 CD4+/CD8+的 比 值 ： 评 价 那 些 自 身 免 疫 失 调 或 被怀 疑 是 免 疫 失 调 或 已 知 患 有 免 疫 缺 陷 的 病 人 的 免疫 状

17、 态 ， 此 外 ， 这 一 比 值 还 可 用 来 监 测 骨 髓 移 植病 人 以 免 受 到 急 性 GVHD的 攻 击 CD4/CD8 升 高 ： 自 身 免 疫 性 疾 病 ， 如 类 风 湿性 关 节 炎 、 SLE。 CD4/CD8 降 低 ： 病 毒 感 染 、 恶 性 肿 瘤 、 再 生障 碍 性 贫 血 等 。 Th/Ts比 值 自 然 杀 伤 细 胞 （ NK） NK细 胞 增 高 常 见 于 ： 某 些 病 毒 感 染 性 疾 病 的早 期 ； 长 期 使 用 干 扰 素 或 使 用 干 扰 素 的 诱 导 物 ；骨 髓 移 植 后 ； 习 惯 性 流 产 。 NK细

18、胞 降 低 常 见 于 ： 恶 性 肿 瘤 ， 特 别 是 中 晚期 或 伴 有 转 移 的 肿 瘤 ； 免 疫 缺 陷 病 及 使 用 肾 上 腺激 素 等 免 疫 抑 制 剂 。 部 分 病 毒 感 染 、 细 菌 感 染 及真 菌 感 染 ； 某 些 白 血 病 及 白 血 病 前 期 。 恶 性 肿 瘤 患 者 T 细 胞 亚 群 和 SIL22R 的 变 化 及 意 义 卢 香 兰 1 ,李霞 1 ,王 萍 萍 1 ,李 玲 2 ,李 艳 1 3 4 2 中 国 医 科 大 学 学 报 J Chin Med Univ 第 33 卷 第 3 期 2004 年 6 月 疾 病 T 细 胞

19、 亚 群 CD4+/CD8+ CD4+ CD8+ 类 风 关 （ 活 动 期 ） SLE - 或 （ 活 动 期 ） Sjogren综 合 症 多 发 性 硬 化 症 重 症 肌 无 力 膜 型 肾 小 球 肾 炎 胰 岛 素 依 赖 性 糖 尿 病 乙 型 肝 炎 自 身 溶 血 性 贫 血 上 呼 吸 道 感 染 传 染 性 单 核 细 胞 增 多 症 （ 急 性 期 ） 巨 细 胞 病 毒 感 染 乙 肝 （ 急 性 期 /慢 性 肝 炎 ） 结 核 （ 胸 水 /重 症 外 周 血 ） 麻 风 疟 疾 血 吸 虫 病 AIDS CD4+/CD8+ CD3+ CD4+ CD8+ 肿 瘤 再 障 及 粒 细 胞 减 少 症 巨 细 胞 病 毒 感 染 血 小 板 减 少 活 动 性 特 应 性 皮 炎 过 敏 性 皮 炎 BD四 色 淋 巴 亚 群 检 测 试 剂 盒 ：MultiTEST CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC MultiTEST CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC Q&A