人参二醇组皂苷具有与地塞米松类似的改善LPS处理小鼠肾功能的作用

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1、人参二醇组皂苷具有与地塞米松类似的改善 LPS 处理小鼠肾功能的作用陈燕;杜艳伟;王晓琴;付双;刘莲勤;于淇;方圆;高品;杨光【摘要】目的:研究人参二醇组皂苷(PDS)和地塞米松(DEX)是否具有类似的减轻 LPS诱导的小鼠急性肾损伤(AKI)的作用，并探讨它们的作用机制方法:C57BL/6小 鼠随机分为4组，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余3组均经腹腔注射LPS 10 mg/kg,PDS组和DEX组小鼠在LPS注射前1h分别经腹腔注射PDS(25.0 mg/ks) 或DEX(2.5 mg/kg).12 h后麻醉下取血和肾脏组织备生物化学与免疫印迹检测结 果LPS组小鼠血尿素氮和肌酐含量显著高

2、于对照组(P v 0.01),而PDS组和DEX组 则明显低于LPS组(P v 0.05);PDS和DEX上调LPS处理的小鼠肾组织IkB蛋白的 表达，抑制NF-kB信号通路的活化，进而减少TNF-a和IL-6的产生;PDS和DEX均 能下调LPS处理的小鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，上调肾组织锰过氧 化物歧化酶的表达，减轻肾脏的氧化应激损伤此外,PDS和DEX均明显上调LPS处 理的小鼠肾脏组织细胞核糖皮质激素受体蛋白的含量.结论:人参二醇组皂苷具有与 DEX相类似的减轻LPS诱导的小鼠AKI的作用，而且，它们的作用机制相似，但PDS 的药效学是否也通过糖皮质受体介导还需进一步

3、研究.期刊名称】 中国病理生理杂志年(卷),期】 2014(030)005【总页数】6页(P864-869)关键词】 脂多糖类;急性肾损伤;人参二醇组皂苷;地塞米松;小鼠作 者】 陈燕;杜艳伟;王晓琴;付双;刘莲勤;于淇;方圆;高品;杨光【作者单位】吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春 130021;吉林大学 第一医院肾病科,吉林长春 130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长 春 130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春 130021;吉林大学基 础医学院病理生理学教研室,吉林长春 130021;吉林大学基础医学院病理生理学教 研室,吉林长春 1300

4、21;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春 130021; 吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长春 130021;吉林大学基础医学院病 理生理学教研室,吉林长春 130021;吉林大学基础医学院病理生理学教研室,吉林长 春 130021【正文语种】中文【中图分类】R329.21内毒素血症诱发的失控性全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是导致多器官功能衰竭的重要原因，而急性肾损伤 (acute kidney injury，AKI)是其中最严重的并发症，致死率极高1。Annane2 认为脓毒症诱发的SIRS中

5、，致炎细胞因子如肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor a, TNF-a)等释放又可导致炎症细胞进一步激活形成炎症因子“瀑布”反应， 患者处于危急状态时外源性糖皮质激素能逆转这种状态，使心血管系统恢复稳态， 各器官的功能恢复，从而挽救了患者的生命。2013年Choi等3认为糖皮质激素 可通过减轻线粒体损伤和凋亡，起到治疗脓毒性AKI的作用。实际上，糖皮质激 素抢救危症和多种难治性疾病的功能很强大。尽管如此，糖皮质激素的副作用不容 忽视, 譬如，胃肠道应激性出血可成为各种危症患者的隐形杀手4。此外，肥胖、 骨质疏松症和胰岛素抵抗等副作用难以防治5。因此，临床急需有与糖皮质激

6、素 类似疗效的而无糖皮质激素样副作用的药物。自古以来，人参汤有 “起死回生” 之功效。为用现代技术揭示其中的奥秘，本研究组通过系列研究发现，人参二醇组 皂苷(panaxadiol saponins , PDS)有地塞米松(dexamethasone, DEX)相类似的 改善失血性休克犬心肺微循环、逆转心肺功能等作用6。而且，PDS没有DEX相 类似的副作用。然而，PDS是否同DEX-样能够减轻脓毒症诱导的AKI,尚缺乏实 验证据。因此，本研究拟在建立LPS诱导的AKI小鼠模型的基础上，对比研究 PDS和DEX对LPS诱导的AKI的影响及其分子机制。材料和方法1小鼠AKI模型复制与分组C57BL

7、/6小鼠随机分为盐水对照(control)组、LPS模型组(LPS组)、PDS+LPS组 和DEX+LPS组(共计32只，n=8)。对照组经腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.5 mL,其余3组分别经腹腔注射LPS 10 mg/kg。PDS+LPS组、DEX+LPS组小鼠 在LPS注射前1 h分别经腹腔注射PDS(25.0 mg/kg)或DEX(2.5 mg/kg)。LPS 处理12 h后，麻醉下取肾脏组织冻存或固定，备蛋白检测与形态学观察；采集血 液，血液在室温下离心(3 000 r/min)10 min制备血清样本，应用全自动生物化学 分析仪检测小鼠血清肌酐(creatinine , CREA

8、)和血尿素氮(blood urea nitrogen , BUN)的含量。2酶联免疫法检测血清TNF-a和IL-6 含量 取小鼠血清，用酶联免疫法(试剂盒购自上海科敏生物技术有限公司)测定血清 TNF-a和IL-6的水平。酶标仪为Bio-Tek，型号ELX800。TNF-a和IL-6的血清 浓度用ng/L表示。3应用免疫印迹(Western blotting)检测蛋白的表达3.1肾组织蛋白提取总蛋白、细胞质和细胞核蛋白的提取：将100 mg肾组织用 液氮研磨成粉末，并移至EP管中，再加入500 800 pL组织裂解液RIPA(含 PMSF和蛋白酶抑制剂)于冰上孵育10 min，室温放置10 m

9、in ,4 C、12 000 r/min，离心20 min。吸取上清分装，保存于-80 C。细胞核蛋白(n-pro)与细胞 浆蛋白(c-pro)的提取：按NE-PER核蛋白-胞浆蛋白提取试剂盒(Thermo Scientific Pierce)的说明书操作，分别提取出这2种蛋白。3.2免疫印迹法检测胞质和胞核提取物及总蛋白浓度通过BCA法测定。按常规方 法配制聚丙烯酰胺凝胶，依次进行SDS-PAGE、转膜、封闭、抗体孵育、ECL显 色。抗体包括锰超氧化物歧化酶(manganese superoxid dismutase,Mn-SOD)、 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric o

10、xide synthase,iNOS)、糖皮质激素受体 (glycocorticoid receptor,GR)、 p-IkB、IkB、 p50、 p65、 lamin B1 (Abcam)和 P-actin (Proteintech Group)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG 口抗购自 Proteintech Group(稀释度为 1:10 000)。3.3结果分析特异性条带的表达丰度用上海天能科技有限公司GIS凝胶图像分析 系统进行灰度扫描。以P-actin或Lamin B1作为内参照，各蛋白表达水平的组间 比较用统计学软件分析。4 肾组织一氧化氮(nitric oxide ,

11、 NO)和丙二醛(malondialdehyde , MDA)含量的 检测肾组织NO含量检测，采用硝酸还原酶法测定；肾组织MDA检测，应用硫代巴 比妥酸法。所用检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。5 统计学处理数据用均数士标准误(mean士SEM)表示。组间差异采用SPSS 17.0统计软件进行 单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P0.05为差异有统计学意义。结果1 LPS成功建立AKI小鼠模型，PDS和DEX均能减轻LPS诱导的AKILPS组肾脏指数明显增加,LPS组肾脏相对重量(0.00730.0004)显著高于对照组 (0.00560.0005)(Pv0.01)。然而

12、,PDS 和 DEX 组肾脏相对重量(0.00640.0001 和 0.00650.0001)明显低于 LPS 组(PvO.O5)。BUN 含量 LPS 组为(32.311.76) mmol/L,对照组为(11.830.99)mmol/L,LPS组显著高于对照组(PvO.01)。然而，PDS+LPS组的BUN含量为 (24.952.61)mmol/L，与 DEX+LPS 组的 BUN 含量(24.902.41) mmol/L接近， 均显著低于LPS组(PvO.05)。血清CREA含量,LPS组为最高 (44.152.87)pmol/L,与对照组(16.161.43)pmol/L比较差异显著(P

13、vO.01);PDS+LPS 组(32.602.80)pmol/L和 DEX+LPS 组(31.774.60)pmol/L接近， 均明显低于LPS组(Pv0.05)，见表1。这些结果表明腹腔注射10 mg/kg LPS , 12 h后能成功复制LPS诱导的AKI小鼠早期动物模型，并且PDS具有与DEX相 类似的改善AKI小鼠肾功能的效应。表1 PDS对LPS所致急性肾损伤小鼠肾脏指数、血清CREA和BUN的影响Table 1. Effects of PDS and DEX on kidney index, serum CREA and BUN inLPS-induced AKI mice(Me

14、anSD.n=8).*Pv0.05, *Pv0.01 vs control;#Pv0.05 vs LPS group. GroupKidney index(g/g)CREA(pmol/L)BUN(mmol/L)Control0.00560.0005 16.161.4311.830.99LPS0.00730.0004*44.152.87* 32.311.76 * PDS+LPS0.00640.0001#32.602.80#24.952.6 1#DEX+LPS0.00650.0001#31.774.60#24.902.41#2 PDS和DEX 改善LPS诱导的AKI小鼠肾功能的作用机制2.1 PD

15、S和DEX均能抑制LPS诱导AKI小鼠TNF-a和IL-6的产生如图1所示，LPS组血清TNF-a和IL-6含量显著高于对照组(Pv0.05 , Pv0.01)。PDS组TNF- a和IL-6含量明显低于LPS组(Pv0.05) , DEX组与LPS组比较，TNF-a有下降 趋势,IL-6显著降低(Pv0.05)。Figure 1. PDS and DEX inhibited TNF-a (A) and IL-6 (B) production in LPS-induced AKI mice. MeanSEM. n=8.*P0.05, *P0.01 vs control；#P0.05vs LPS

16、.图1 PDS和DEX抑制LPS诱导AKI小鼠TNF-a和IL-6的产生2.2 PDS和DEX均能抑制LPS诱导AKI小鼠NF-kB信号通路的活化如图2所示， LPS组磷酸化IkB(p-IkB)蛋白表达水平与对照组比较明显增高(PvO.01) , PDS组 P-IkB蛋白表达水平明显低于LPS组(PvO.05) , DEX组的p-IkB表达水平与LPS 组比较也有降低趋势。LPS组的核NF-kB p65和p50的表达水平与对照组比较显著增高(PvO.05)。然而，与LPS组比较，PDS组和DEX组核内NF-kB p65和 p50表达水平显著下调(PvO.05)。可见，PDS和DEX抑制了 Ik

17、B蛋白的磷酸化水 平，进而抑制了 NF-kB信号通路活化，减少炎症因子产生与释放，逆转LPS诱导 AKI的肾功能。2.3 PDS和DEX均能抑制LPS处理小鼠肾脏iNOS的表达和NO含量的升高LPS 组肾脏组织iNOS蛋白表达水平和NO含量与对照组比较均显著增高(PvO.05)。 然而，PDS组和DEX组肾脏组织iNOS蛋白表达水平和NO含量均显著低于LPS 组(Pv0.05)，见图 3。Figure 2. PDS and DEX suppressed NF-kappa B signaling pathway activation in the kidney of LPS-induced AK

18、I mice.MeanSEM. n=8.*Pv0.05 vs control ; #Pv0.05 vs LPS.图 2 PDS 和 DEX 抑制 LPS 诱导 AKI 小鼠 NF-kB 信号通路的活化Figure 3. PDS and DEX reduced renal nitric oxide (NO) production (A) and inducible notric oxide snythase (iNOS) expression (B) in LPS-treated mice.Mean士SEM. n=8.*Pv0.01 vs control ; #Pv0.05 vs LPS.图 3

19、 PDS 和 DEX抑制LPS诱导AKI小鼠肾脏组织iNOS表达和NO含量的升高2.4 PDS和DEX均能降低LPS处理小鼠肾脏MDA的含量，上调肾组织Mn-SOD 蛋白的表达LPS组肾组织MDA含量与对照组比较明显增高(Pv0.05),而清除氧自 由基酶Mn-SOD的蛋白表达水平明显下降(PvO.05)，见图4。LPS诱导的氧化应 激加重AKI小鼠的肾脏功能障碍。然而，PDS和DEX则通过抗氧化应激作用减轻 LPS诱导的AKI。Figure 4. PDS and DEX up-regulated renal Mn-SOD expression (B) and decreased MDA co

20、ntent (A) in LPS-treated mice.MeanSEM. n=8.*Pv0.05, *P0.01 vs control ; #P0.05 vs LPS.图 4 PDS 和 DEX 上调 AKI 小鼠肾脏 Mn-SOD蛋白表达并减少MDA的含量3 PDS与DEX均能增加LPS处理小鼠肾脏细胞核GR(nuclear GR, n-GR)的含量 总GR(total GR , t-GR)除对照组表达最低，其余3组t-GR表达水平均明显增高， 组间没有显著差异。LPS组n-GR水平与对照组比较明显降低(PvO.05),PDS+LPS组和DEX+LPS组n-GR表达水平相似，均明显高于L

21、PS组(Pv0.05), 见图5。这些结果提示，PDS有可能是GR的功能配体。Figure 5. PDS and DEX increased nuclear glucocorticoid receptor (n-GR) content in the kidney from LPS-treated mice. MeanSEM. n=8.*Pv0.05 vs control ; #P0.05 vs LPS.图5 PDS和DEX增加LPS诱导AKI小鼠肾脏细胞核 糖皮质激素受体的含量讨论脓毒症诱发的失控性SIRS是导致多器官功能衰竭的重要原因，AKI是其中最严重 的并发症，致死率极高7。本研究组用L

22、PS 10 mg/kg腹腔注射，12 h已经成功 地用LPS诱导出早期AKI小鼠模型。LPS组血清BUN含量显著高于对照组；血清 肌酐含量LPS组同样显著高于对照组。重要的是，PDS和DEX均能明显地改善 LPS诱导AKI小鼠的肾功能，这些结果显示PDS预处理具有DEX相似的效果，均 能减轻LPS诱导的AKI。为探讨PDS和DEX减轻LPS诱导的AKI的机制，我们 进行了进一步研究。AKI的发病源于对促炎因子的反应，包括细胞因子分泌和活性氮氧自由基的作用8。譬如，TNF-a不仅仅是具有杀灭肿瘤细胞作用的细胞因子，而且，TNF-a与 2个不同的受体结合，能激活不同的和重叠的信号转导通路。血管内皮

23、细胞受 TNF-a攻击后，通过接受大量的促炎信号，可增加白细胞黏附、血管渗漏和血栓形 成等。因此,TNF在炎症性疾病的发病机制中起关键作用9-10。本研究发现， LPS组血清TNF-a和IL-6含量与对照组比较明显升高。而PDS和DEX均明显抑 制LPS诱导的TNF-a和IL-6的产生。SIRS的发生与NF-kB信号通路的活化相关。在静息时抑制性蛋白IkB与NF-kB 以二聚体的形式结合，以无活性的形式存在于胞浆中。然而，当细胞接受TNF-a 等炎症因子刺激时，会激活IkB激酶9，促使IkB磷酸化，导致IkB发生泛素化 和蛋白酶体降解，从而释放NF-kB,使其解离成p65和p50转入核内调节多

24、种基 因产生与释放炎症因子，诱发失控性SIRS，进而导致多器官功能损伤。本研究结 果表明,LPS组p-IkB蛋白表达水平与对照组比较明显增高(PV0.01)，必然促进 NF-kB的释放，核p65和p50的蛋白表达LPS组明显高于对照组(P0.05)。p50 和p65启动多种细胞因子的产生与释放，进而加重LPS诱导的AKI的肾功能损伤。 而PDS+LPS组p-IkB蛋白表达水平明显低于LPS组(Pv0.05) , DEX组的p-lKB 表达水平与LPS组比较也有降低趋势。而且，与LPS组比较，PDS组和DEX组 核内NF-kB p65和p50表达水平显著下调。可见，PDS和DEX均能抑制肾脏组

25、织IkB蛋白的磷酸化，进而抑制肾脏NF-kB信号通路的活化。本研究还发现，PDS和DEX均能下调LPS诱导的小鼠肾组织iNOS表达，并上 调Mn-SOD蛋白表达。Holthoff等11 研究表明，白藜芦醇通过抑制活性氮自由 基的活性实现了减轻脓毒症性AKI的作用。Wu等12研究显示选择性iNOS抑制 剂L-N6-(1-iminoethyl)-lysine减轻了肾小管的氧化应激，并纠正了微循环的异 常。本研究发现PDS和DEX有同样的下调LPS诱导的AKI小鼠肾脏iNOS和NO含量的作用。Kruzel等13研究显示,LPS诱导的氧爆发起源于线粒体，ROS 是从呼吸链的复合体皿中释放的。有研究发现

26、人参二醇组皂苷Rb1（含4个葡萄糖） 可以直接与羟自由基（OH）相互作用，保护局部缺血神经元14。本研究表明在 LPS组线粒体特异的捕捉氧自由基的酶Mn-SOD表达水平与对照组相比明显降低。 然而，PDS+LPS组和DEX+LPS组的Mn-SOD蛋白表达水平与LPS组比较被明 显上调。可见，PDS和DEX均能抑制氧化应激减轻LPS诱导的AKI。众所周知，DEX通过GR发挥功能作用。DEX作为配体与GR结合导致GR活化， 活化的GR以同源二聚体形式转移到核内，再与正调节的GRE结合后，能够诱导一 些抗炎蛋白等表达。本研究发现PDS与DEX十分相似，均能增加肾脏组织细胞 n-GR蛋白的含量。然而，

27、PDS是否与DEX 样也会作为功能配体与GR结合导 致GR活化，以配体-GR复合物的形式转入细胞核并能诱导GR的转录活性呢？ 我们的分析认为，PDS作为GR的功能配体可能性较大，PDS由Rb1、Rb2、Rc 和Rd等组成，都在同一位置上含有糖链，在酸性环境下糖链被水解掉就会与受体 相互作用，发挥甾醇的多种生理功能。Lee等15已经证明人参单体Rg1是核内 糖皮质激素受体的功能性配体。另一种可能就是PDS可能作为一种激活剂促进糖 皮质激素与GR结合，然后，以二聚体形式入核发挥作用。（致 谢：人参二醇组皂苷由吉林大学天然药物研究室提供，是从人参茎叶中提取的 专利产品，专利号： ZL 98 1 00

28、070.3。发明人：马兴元、陈燕萍等。专利权人： 吉林大学。）参 考文 献1Venkatachalam MA, Weinberg JM. The tubule pathology of septic acute kidney injury: a neglected area of research comes of ageJ. KidneyInt,2012,81(4):338-340.2 Annane D. Corticosteroids for severe sepsis: an evidence-based guide for physiciansJ. Ann Intensive Care

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30、e adverse effects of glucocorticoids on fuel metabolismJ. J Clin Invest, 2012,122(11):4172-4189.6 刘喜春，李璐，于振香，等人参二醇皂苷对LPS休克大鼠肺组织AQP1表达 的影响几中国病理生理杂志,2006 , 22(8):1562-1565.7 Venkatachalam MA, Weinberg JM. The tubule pathology of septic acute kidney injury: a neglected area of research comes of ageJ. K

31、idney Int, 2012,81(4):338-340.8 Wu L, Mayeux PR. Effects of the inducible nitric-oxide synthase inhibitorL-N6-(1-iminoethyl)-lysine on microcirculation and reactive nitrogen species generation in the kidney following lipopolysaccharide administration in miceJ. J Pharmacol Exp Ther, 2007,320(3):1061-

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