一种改进的丛枝菌根染色方法

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1、一种改进的丛枝菌根染色方法杨亚宁;巴雷;白晓楠;张立朝;王德利【摘要】研究改进了 Vierheilig等描述的AM菌根染色法:将根样于20%KOH溶 液中60工水浴透明40-120 min,5%醋酸酸化5min后，用5%醋酸墨水染色液(派 克纯黑书写墨水Quink),于60C水浴染色30 min,清水浸泡脱色(14h)后即可镜检. 根皮层细胞内AM真菌的丛枝结构清晰可见,并且能够明确地分辨AM真菌与其它 未知真菌此外,Quink初染后，再经过Sudan IV复染(60C、60 min),70%乙醇脱色 5min,暗隔真菌的透明菌丝内所积聚的脂类颗粒被Sudan V染上鲜红色，在复式显 微镜下能

2、够观察剑此类透明菌丝在根皮层组织内的存在状况.采用甘油明胶为封固 剂制片,根的染色效果可以保存长久.此项技术可以对同一种植物的多个根样进行同 步的透明和染色处理,而且操作简便、低毒性、成本低廉、染色效果极佳,适用于野 生和栽培草本植物AM菌根的染色和制片观察.期刊名称】 生态学报年(卷),期】 2010(030)003【总页数】6页(P774-779)【关键词】 从枝菌根;醋酸墨水;暗隔真菌【作 者】 杨亚宁;巴雷;白晓楠;张立朝;王德利【作者单位】 东北师范大学草地科学研究所,植被生态科学教育部重点实验室,长春,130024;东北师范大学草地科学研究所,植被生态科学教育部重点实验室,长春,1

3、30024;东北师范大学草地科学研究所,植被生态科学教育部重点实验室,长春,130024;东北师范大学草地科学研究所,植被生态科学教育部重点实验室,长 春,130024;东北师范大学草地科学研究所,植被生态科学教育部重点实验室,长 春,130024【正文语种】中 文Phillips和Hayman和Kormanik等分别报道了台盼蓝和酸性品红染色法1- 2。 这两种染色方法的染色效果可靠而稳定，但也有不足之处，即除了 AM真菌被染 色外，根皮层组织也被染上相同而略浅的颜色，AM真菌与根皮层组织之间的颜色 反差不明显，不利于对AM真菌细微结构(如丛枝)的显微拍照。Brundrett等采用 氯唑黑E

4、(chlorazol black E)染色法3，并结合使用诺马斯基微分干涉差显微镜 (DIC)观察和拍摄AM真菌在根皮层组织内的侵染状态，获得了极佳的染色与反差 效果，Brundrett等的照片对丛枝结构表现清晰细致，因而被广为引用。Vierheilig等指出台盼蓝、酸性品红和氯唑黑E都是致癌疑似物，对长期使用者的 健康可能有害4。并且，随着菌根研究逐渐受到重视，研究者日众，各类染色剂 使用量相应增加，出于环境安全考虑，也应当减少此类有害化学物质的使用和排放 4- 5。据此，Vierheilig等提出了醋酸墨水染色法。染色液配方中，仅仅使用书 写墨水(钢笔水)和醋酸，价格更为低廉。与台盼蓝染色

5、和酸性品红染色相比，经过 醋酸墨水染色后，AM真菌的菌丝、泡囊和丛枝等着色牢固、耐脱色，与背景的颜 色反差很好，更适于镜检观察和拍照。暗隔真菌(dark septate endophytes, DSE)是一类常见的根系内生真菌6。DSE 与AM真菌经常同时侵染同一植物的根系，但DSE生理与生态作用以及DSE与 AM真菌的相互关系还存在争议7- 8。在松嫩草原进行AM调查时，发现多种常 见植物根系里均有AM真菌和DSE的双重侵染。DSE的典型结构是根表面及皮层 细胞间的褐色有隔菌丝，以及皮层细胞间和细胞内褐色的微菌核。根段经过KOH 透明处理后，此二者不必染色就能轻易观察到。当植物处于生理活跃期

6、，DSE在 根皮层内可发育出大量的透明菌丝。Barrow和Aaltonen采用台盼蓝初染和 Sudan IV复染显示，DSE的透明菌丝内所积聚的脂类颗粒可以被Sudan IV染为红 色，借助DIC显微镜能够清晰地观察到DSE的透明菌丝9。但国内教学与科研机 构目前很少有DIC配置，对DSE的深入研究受到限制。染色后的根段常需要装片保存，国内多采用聚乙烯醇乳酸甘油(polyvinyl-lacto- glycerol , PVLG)为封固剂。PVLG室温下为粘稠液体，制片后，PVLG的干燥过 程缓慢，易受外力挤压而从盖玻片下溢出，造成污染和玻片之间的粘连。因此，储 存玻片标本前，要确认PVLG已经

7、晾干，储存时，玻片标本还应当水平摆放和间 隔放置，由此占用了较多的空间10- 11。Widden提出了以甘油明胶为封固剂的 AM菌根永久制片法，制片完成后，甘油明胶在室温下迅速干燥，玻片标本可以重 叠存放12。Widden比较了采用台盼蓝、酸性品红和氯唑黑E这3类染色剂染色 后相应根段的永久制片效果，观察到台盼蓝和氯唑黑E染色的根段可以保存很久 而不褪色，而酸性品红染色的根段在制片后仍持续褪色。Widden进而提出， Vierheilig等的醋酸墨水染色技术，也应当能够与此种永久制片法兼容。 本研究旨在：(1)筛选出适宜的国产墨水，便于国内学者应用；(2)尝试将醋酸墨水 染色与Sudan IV

8、复染结合，并应用于AM真菌和DSE研究中；(3)比较和评价醋 酸墨水染色+甘油明胶永久制片，以及醋酸墨水染色+Sudan IV复染+甘油明胶永 久制片的显微观察和显微拍照效果，验证Widden的推断，即，醋酸墨水染色技 术与甘油明胶永久制片法可以在AM染色制片中结合使用。1 实验材料与方法1.1 植物材料本实验采用4种吉林省西部草甸草原常见的野生植物：羊草(Leymus chinensis)、 全叶马兰(Kalimeris integrifolia)、芦苇(Phragmites commnis)、蒙古韭(Allium mongolicum），以及2种栽培植物，紫花苜蓿（Medicago sat

9、iva）和大葱（A. fistulosum）为实验材料。2007年6月初，将草甸草原上羊草和全叶马兰带土移栽各10盆（容积约3.5 L）。 同时，把紫花苜蓿种子浅播在10盆移栽有35株全叶马兰的盆中，待紫花苜蓿 出苗5叶期后，剪去全叶马兰地上部分。所有植物均露天摆放在平整的裸地上， 每周适量浇水两次，人工去除杂草， 9月底收获根系。 2007年9月初，在草甸草 原蒙古韭单优斑块和地势低洼湿润的芦苇单优群落，分别挖取蒙古韭和芦苇根系。 2007年10月初，大葱须根采集于农贸市场。上述植物根样均用清水洗净，剔除 老根和粗根，各取鲜重约500 g幼嫩的细根（直径S2 mm）,用70%乙醇保存备用。1

10、.2 染色剂本实验采用以下15种常见品牌墨水与Vierheilig使用的Shaeffer（原文如此）黑色 墨水进行比较。1.3 染色步骤取上述6种植物的根样，流水洗去乙醇。剪为3 cm长的根段，再分别称取等量鲜 重（2.5 g）若干份，然后按照以下方法进行透明、酸化、染色、脱色和复染处理。表1实验中使用墨水的制造商、品牌、颜色与用途Table 1 Manufacturer, brand, color and application of the inks used in the experiment 制造商 Manufacturer 品牌 Brand 颜色 Color 用途 Applicati

11、on 美国犀飞利（Sheaffer）公 司Sheaffer*黑色书写墨水普特（香港）国际有限公司Pot黑色喷墨打印机专用墨水 贵州博士文化体育用品有限公司英克斯9930纯蓝书写墨水老板牌853纯蓝书写 墨水英克斯9910黑色碳素墨水鸵鸟312纯蓝书写墨水天津市鸵鸟墨水有限公司 鸵鸟313蓝黑书写墨水鸵鸟881黑色书写墨水亚马逊鳄鱼818黑色书写墨水上海 羽龙文化用品有限公司亚马逊鳄鱼红色书写墨水元昌201红色书写墨水上海元昌 文化用品有限公司英雄202蓝黑书写墨水上海墨水厂英雄203纯蓝书写墨水英雄204-A黑色书写墨水沪光黑色绘图墨水上海派克笔有限公司Quink纯黑书写墨水 *Sheaffe

12、r牌黑色书写墨水（Sheaffer black ink）购自于美国波士顿，经Vierheilig 确认，与Vierheilig等使用的为同一种墨水透明1000 ml烧杯内装有20% KOH 600 ml，放入电热水浴锅内60C水浴，再 将盛有根样的容器（100 ml的瓶壁和瓶底布满透水孔的乳白色半透明聚乙烯塑料广 口瓶，孑L径约为0.5 mm）浸于KOH溶液中。透明处理时间分别为蒙古韭40 min、 大葱50 min、全叶马兰60 min ;羊草100 min、芦苇110 min、紫花苜蓿120 min。根样经过透明处理后，再按照下述步骤依次进行。酸化流水冲洗5 min，再用5%乙酸酸化5 m

13、in。染色使用5%醋酸墨水染色液（5%的冰醋酸95 ml ,墨水5 ml） ,60C水浴，染色 30 min。脱色清水浸泡脱色。普通国产墨水染色的根样脱色10 min2 h;Pot、Sheaffer 和Quink染色的根样脱色12 h以上。复染Sudan IV（天津市光复精细化工研究所）染色液（Sudan IV 3 g, 70%乙醇1000 ml） ,60C水浴染色60 min，而后清水冲洗3 min，再用70%乙醇脱色5 min。1.4 制片与显微观察 挑取脱色处理后的根段于载玻片上，每片平行摆放6个根段，滴加适量的甘油明 胶封固剂（明胶10 g，百草酚0.25 g，蒸馏水60 ml，甘油7

14、0 ml），盖上24 mmx50 mm盖玻片，用手指将根段稍用力压扁。每种植物根样初染后制片3张， Sudan IV复染后制片3张，使用Nikon 80i正置显微镜观察和拍照。2 结果与分析 各种颜色和品牌墨水的染色效果有很大差别（表2）。国产红色书写墨水都不能使根 内的AM真菌结构着色，4种纯蓝色书写墨水均能够使泡囊很好地着色（图1: 6）, 但是，丛枝的细微结构模糊难辨，蓝黑色书写墨水仅能够使泡囊着色，但极为模糊 普通黑色书写墨水（鸵鸟881、亚马逊鳄鱼818）、英克斯碳素书写墨水9910和沪 光黑色绘图墨水都不能使AM真菌菌丝、泡囊和丛枝着色。Quink和Sheaffer黑 色书写墨水对

15、AM真菌菌丝、泡囊和丛枝着色的染色牢固。Quink与Sheaffer黑 色书写墨水相比较，单染时，Quink对羊草（图1: 1,）、紫花苜蓿（图1: 4）和芦苇的 细根染色效果更佳；Sheaffer对蒙古韭（图1: 7）、全叶马兰和大葱的细根（皮层组 织饱满）染色的表现力更细致；但是Quink+Sudan IV复染效果要优于 Sheaffer+Sudan V, DSE的透明菌丝着色更明晰可辨（图1: 2）。在所有的供试墨 水中，黑色打印墨水Pot对AM真菌丛枝结构染色的表现力最为细致（图1: 8）。 上述可以使AM真菌着色的墨水中，不同颜色墨水对真菌菌丝的着色力也有强弱 之别，脱色（在清水中浸

16、泡）的适宜时间分别为：4种纯蓝色书写墨水0.5 h，Quink 和Sheaffer黑色书写墨水以及Pot黑色打印墨水（1%）14 h , 5% Pot染色后需要 脱色48 h。表2不同墨水对AM菌根染色效果比较Table 2 Comparison of different inks for staining arbuscular mycorrhiza in the cortex of roots 颜色 Color 品牌 Brand染色结果Stainingresult评论Comments红色亚马逊鳄鱼AM真菌未着 色不适用上海元昌AM真菌未着色不适用纯蓝英克斯9930泡囊清晰、丛枝细微 结构难辨

17、适用范围有限老板牌853泡囊清晰、丛枝细微结构难辨适用范围有限鸵 鸟312泡囊清晰、丛枝细微结构难辨适用范围有限英雄203泡囊清晰、丛枝细微 结构难辨适用范围有限蓝黑鸵鸟313泡囊着色很浅,丛枝未着色不适用英雄202泡 囊着色很浅，丛枝未着色不适用黑色英克斯碳素墨水9910AM真菌未着色不适用鸵 鸟881AM真菌未着色不适用亚马逊鳄鱼818AM真菌未着色不适用英雄204- AAM真菌未着色不适用沪光黑色绘图墨水AM真菌未着色不适用派克标准墨水纯 黑QuinkAM真菌着色，菌丝、泡囊、丛枝深蓝色，皮层淡粉色;反差好适用SheafferAM 真菌着色,菌丝、泡囊、丛枝深蓝色,皮层淡绿至淡粉色（不同

18、植物）;反 差好适用Pot打印墨水AM真菌着色，菌丝、泡囊、丛枝蓝黑色，皮层淡棕色;反差 好适用3 结论和讨论Koske和Gemma对Phillips和Hayman的台盼蓝染色法的染色液配方做出了重 要改进，除掉了苯酚和乳酸，但同时强调，为了使染色剂在真菌菌丝上均匀沉积， 甘油是不可缺少的13。Vierheilig等没有明确显示经过醋酸墨水染色后AM菌根 丛枝的形态细节，本文研究表明，仅使用醋酸和墨水配制的染色液，即可以清晰地 区别丛枝的类型，如羊草的P型和全叶马兰的A型（图1:1, 8）。诚然，在醋酸墨 水染色液配方中加入甘油后，根的皮层组织和根内真菌菌丝的形态会显得更加光泽 饱满（图片未显

19、示）。英雄203等4种纯蓝墨水对泡囊着色效果好，对丛枝的表现模糊。因此，此类墨 水仅适用于对AM菌根的初级观察（如AM真菌存在与否的初步判定和普通的教学 演示等），不适用于研究性实验。虽然Pot黑色打印墨水对AM菌根的丛枝结构的 表现力比Sheaffer和Quink更为细致，但是脱色后，皮层组织呈淡棕色，致使 DSE 的暗隔菌丝不易辨认。曾试用过的其他品牌的喷墨打印机专用墨水，包括黑 色和红色的、水溶性和脂溶性的墨水，对AM菌根的染色效果皆好。由于目前国 内打印墨水市场竞争激烈，缺少一个持久知名的品牌，且打印墨水对人体的毒性不 清楚。因此 AM 菌根染色应用中应慎用。现代书写墨水的发展趋势是尽

20、量减少配方中的有毒和腐蚀性成分14。如果按照规 定配方生产，并且依照一套细则来实施监督，供学生使用的书写墨水应当是无毒性 或毒性很低的。Quink与Sheaffer都是国际知名品牌的书写墨水，墨水中使用的 染料均为无毒安全的食用色素15。因此，在醋酸墨水染色法中使用Quink黑色 墨水为染色剂，可以兼顾到好的染色效果和低毒性两个方面。以AM真菌为目标进行染色时，会有其他种类真菌同时被染色。其中，个别种类 真菌的菌丝形态与着色程度与AM真菌近似（图1:3），当采用酸性品红或台盼蓝染 色时，很容易与AM真菌混淆16。采用Quink等黑色墨水染色时，菌丝着色十 分牢固，经过清水长时间浸泡脱色后，根皮

21、层组织可以接近完全脱色，然而真菌的 菌丝仍然保持鲜明的蓝色，可以通过形态特征的比较，区分 AM 真菌与其他真菌。 与此相比，酸性品红和台盼蓝染色后，在脱色阶段，皮层组织与真菌是同步脱色的， 当皮层组织脱色至无色透明时，真菌菌丝的形态亦不再可辨。因此，醋酸墨水染色 法对于区分AM真菌与其他真菌更有效，在统计根系中AM真菌的侵染率时，可 以减少误差。图1墨水染色的根Fig.1 Roots stained with inks图15是Quink黑色墨水染 色的根；1.羊草根，示P型丛枝（红色箭头）;2.羊草根,Sudan IV复染,丛枝和 DSE的透明菌丝（红色箭头）;3.全叶马兰根，一种未定名真菌，

22、菌丝形态近似于 AM真菌；4.紫花苜蓿根，示侵入点和丛枝；5.大葱根，示胞间菌丝和丛枝;图6. 全叶马兰根，英雄牌纯蓝墨水染色，示泡囊；图7. 蒙古韭根，黑色书写墨水 Sheaffer染色，示丛枝（红色箭头）;图8.全叶马兰根，黑色打印墨水Pot染色，示 A型丛枝在中温透明处理过程中，由于使用可透水的100 ml塑料瓶，使随后的冲洗、酸化、 染色、脱色等操作过程同步、便捷，有利于同时处理某种特定植物的多个根样，实 现批量染色。本实验采用的6种植物的根皆是乳黄色至乳白色的，仅使用KOH溶 液透明处理即可。但有些植物的根是黑色或棕色的，KOH溶液处理后，根的颜色 依然较深，此际可以采用Koske和

23、Gemma推荐的方法对根样加以漂白处理，比 如使用容易购买的过氧化氢（H2O2，分析纯，有效含量不少于30%），稀释10倍 后，漂白根样530 min。另外值得注意的是，当采用Sudan V复染时，由于 Sudan V对聚乙烯塑料制品有极强的附着力，复染时宜换用玻璃容器（如锥形瓶等）。 使用PVLG为封固剂，制成后的玻片标本通常能保存23个月(实验观察现象)。 检查以往保存时间长于6个月的染色的片子发现：以PVLG为封固剂的片子大部 分已经干透，有整体及局部观察价值的片子，不到原保留片子的十分之一 (38/475)。使用甘油明胶为封固剂，甘油明胶制片在保存510个月后检查，所 有玻片标本依然完

24、好，尤其是Quink染色根段的染色效果不变。Widden报道， 用甘油明胶制片，染色效果已经保持 5a 以上。此外，在压片时，甘油明胶会溢出， 此时可以暂不处理，搁置10 min以上，然后在流水中用毛刷洗去片上溢出甘油明 胶，晾至半干，用糙白纸等擦净，使盖玻片和载玻片的表面光洁如新，写好标注后 即可以分类叠放保存。References:1 Phillips J M, Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular- arbuscular mycorrhizal fun

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