HPLC仪器梯度鬼峰故障分析

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1、鬼峰产生的原因是多种多样的，根据本人的经验以及文献报道，将原因归纳为以下几个方面：1、流动相、样品稀释液、仪器或是容器中存在杂质，当梯度开始时由于有机相比例不高，洗脱能力 不强，杂质在色谱柱柱头富集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富集的杂质被洗脱，从而形成 鬼峰。2、流动相脱气不完全。空气在有机相和水中的溶解度不同，当水和有机相混合时，气泡就产生了3、操作问题原因 1主要有以下几种情况1、试剂问题a) 有机溶剂甲醇制备工艺相对乙腈来说较为简单，杂质含量也较少。但是由于甲醇紫外吸收范围比乙腈广，所以 当使用紫外检测器时，尤其是波长较低时，尽量使用乙腈作为有 机相，用甲醇的话漂移太大。而用 作

2、梯度色谱的乙腈质量要求较高，一般用进口梯度色谱专用乙腈能够很好的减少鬼峰的出现。b) 水 很多单位用自制蒸馏水作为水相，但是结果并不是很好。原因就是一些低沸点的有机杂质并不能够通 过蒸馏除掉。有条件的尽量用HPLC级的纯水，没有条件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替，但是 如果色谱条件比较严格也是有可能出问题的。c) 其它试剂缓冲盐、TFA、EDTA等试剂也会对流动相造成很大的影响，尽量用纯度高的试剂配制流动相。2、仪器问题a) 液相的流动相管路被污染。长时间的使用含水量较高的流动相(尤其是加入缓冲盐的)，细菌就容易在管路中滋生，细菌的代谢 产物或是细胞碎片能造成鬼峰。b) 输送泵故障，造成系统

3、压力不稳，从而产生鬼峰。c) 单向阀堵塞，造成系统压力不稳，从而产生鬼峰。早期岛津的液相单向阀貌似不能用纯乙腈作为 流动相，现在应该已经得到改进。原因 2主要有以下几种情况1、 在线脱气机脱气不完全。2、两种流动相的有机相比例相差太大。例如A为100%水，B为100%乙腈。在梯度条件允许的情况 下尽量减少两中流动相之间的差距，降低空气在两中流动相中溶解度的差异，从而减少气泡的产生。3、流动相配置好后预先超声脱气。原因 3主要有以下几种情况1、流动相配置过程中受到污染a) 盛放流动相的容器或是量具受到污染。这种污染可能来自于洗涤剂、铬酸洗液或是其他实验人员用完后的残留杂质。流动相容器的清洗一般

4、用干净的水+有机溶剂涮洗就行，过多的清洗步骤反而可能造成二次污染。有时流动相容器的塑料盖 碎片都有可能是杂质的来源。b) pH 计。很多pH计以聚碳酸酯作为外壳，然而聚碳酸酯是可以溶于有机溶剂的，所以尽量使用玻璃pH计来 测量流动相的 pH。c) 滤膜。 劣质的或者型号错误的滤膜往往是鬼峰出现的原因。d) 放置时间过长。流动相在空气中暴露时间过长，就可能吸收空气中的有机杂质，有时流动相中的添加剂，例如 TFA， 时间长了会氧化从而产生杂质。2、样品稀释液与流动相极性或者 pH 相差太大。这也是导致鬼峰的原因之一，这种问题很有可能导致样品分为两个不同的阶段出峰，从而产生双峰或 者多峰。以上就是本

5、人的一点经验，希望大家指正批评。高效液相色谱级乙腈的质量评价2009-11-01 21:19:451 分类：HPLC液相色谱| 标签：液色迷人液相色谱专家 |字号订阅高效液相色谱级乙腈的质量评价信息来源：液色迷人摘要:高效液相色谱（HPLC）分析中，流动相溶剂的纯度和质量对分析结果和仪器本 身都有重要影响。溶剂中的各种痕量杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性 定量分析结果，而且可能会污染分离柱和堵塞系统，造成仪器出现故障。了解HPLC溶剂 规格和相关的测试方法，可以帮助HPLC用户评价和筛选HPLC溶剂，减少溶剂杂质对应用 造成的负面影响。本文介绍了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度确

6、定HPLC级乙腈纯度和质 量的两种规范方法及其对HPLC分析的意义，并探讨了这两种方法的实际应用。乙腈区别于其他HPLC溶剂的独特性质（中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确 的色谱峰、低粘度、相对于醇类和酯类有较低的UV吸收）1,使其成为最常用的有机 流动相组分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种 很少量的杂质，例如丙烯腈、a（B）-甲基丙烯腈、顺/反式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、 乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、恶唑和乙酸2-4。经过复杂的纯化过程，痕量 的上述杂质可能仍然存在于HPLC级乙腈中。其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰， 进而影响定性定量分

7、析，而且会污染分析柱、堵塞系统，导致仪器出现故障。作为美国分析试剂标准测试方法的权威，美国化学学会（ACS）分析试剂委员会在试 剂化学品（第9版）中明确定义了 HPLC级乙腈的技术说明，包括通用的说明和HPLC 的适用说明。通用的说明包括气相色谱（GC）纯度、水、滴定酸或碱、以及挥发残留物。 HPLC的适用说明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脱基线5。本文详细介绍了乙腈的两种适用于HPLC的规范方法及其对HPLC应用的意义，并通过 详尽的实验数据讨论了操作中的注意事项以及影响测试结果的因素。1实验 1.1仪器本文中使用了两种HPLC系统，其特定条件介绍如下：Agilent 1100 HPLC

8、系统由脱 气机(G1379A)、四元泵(G1311A)、自动进样器(G1315A)和二极管阵列检测器(DAD) (G1315B) (Agilent Technologies, Wilmington, DE)组成，并用该系统获得图 1 和 图2的结果。其他色谱图由Alliance 2695 HPLC系统和2996光电二极管阵列(PDA)检 测器(Waters, Milford, MA)获得。ZORBAXC18 柱由 Agilent 提供；B&J C8 柱从 Honeywell Burdick & Jackson 获得。厨 1 btcnftW&H 瞬 K 脚 S*J )不冋阳牌乙鼎雍門5也巾址梯厦

9、冼脱蛊线z -8iJ AC Si. ffiSW A, KffiM 0 , 供应商匚= 鱼询果* BfiJ C8桂 11SO irm x Mnim LL S Jr 池陈 疏.lOfilB:捕盘(min.e% h 1 aOhf2O4 100)301 1DO|(35| 常片啊釦 规站明2： Sts it水戲污與更空口HJtt恍鵠牆睨的鬆响；-BKJ捕至HLG己睛 AGM k, TtlS面T的価娄MFLGACN, F庄肯T脚懈裳H=RLC*匚叫.色站时尽阿I.UV 光谱使用 Cary 4000 UV-VIS 分光光度计(Varian, Palo Al to, CA)。参比池为1 cm石英池，样品池为1

10、 cm或5 cm石英池。1.2药品和试剂HPLC级乙腈来自Honeywell Burdick & Jackson及其他HPLC溶剂供应商。高纯水由Milli-Q 超纯水系统(Millipore, Bedford, MA)和 Honeywell Burdick & Jackson供应。乙酸(AR)由 Sigma (St. Louis, M0)提供。2结果和讨论 2.1 HPLC级乙腈UV吸收规范的意义UV吸收背景对HPLC乙腈的关键性源于两个原因。首先，大部分有机杂质都会产生UV 吸收。乙腈的UV吸收越小意味着其中杂质含量越少。第二，HPLC仪器最常用的检测模式 就是UV检测。因此乙腈的UV吸收

11、越小，色谱的基线背景越低；从而灵敏度越高，检测限 越低。图3是来自不同供应商的HPLC级乙腈的UV光谱,尤其是在短波长范围（300190 nm） 并不相同。这可能是由于乙腈中难以去除的杂质因各溶剂供应商使用的纯化技术不同而不 同。鉴于使用UV检测器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下检测，因此大部分溶 剂供应商在上述波长范围内设立UV吸收规范。:11： cm fct色皿即科的环冋肘1商朗HFLCiJSZ：睛霍革舄注柝处的收1哄离纯座冰世辛b2.2影响UV吸收测量值的因素在测试实验中，很多因素会影响UV吸收的测量值：（1）光路距离（比色皿长）。在0.20.8AU范围内，吸光率（A）的测

12、量值误差最 小，否则吸光率的测量误差会相对大些。如使用1 cm比色皿，即使在250210 nm的短 波长范围内，乙腈的吸光率也远小于0.2 AU,因此可能产生很大的误差。根据比尔定律， 溶剂的吸光率和样品的光路距离成正比，因此增加样品池长度会使溶剂吸光率增加，使其 值进入0.20.8 AU范围内，从而减小测量误差。使用5 cm比色皿，在400190 nm扫描 范围内得到不同乙腈样品的UV光谱（如图4所示）。从图4中曲线可以发现，使用5 cm 比色皿可使乙腈在低波长的大部分UV吸光率进入0.20.8 AU范围，从而显示出数据的准 确度更高。而且，不同乙腈样品的UV吸光率的差别与使用1 cm比色皿

13、时相比更明显。鉴 于这一点，Honeywell Burdick & Jackson等一些生产商使用1 cm和5 cm两种比色皿建 立UV吸收规范。壬卜|1比色生产fflMHPLC迦年睛在（2）仪器参数。由于乙腈的吸光率非常低，仪器参数的设定要保证最佳的灵敏度和 准确度。双光路模式可以克服单光路模式中光源能量随时间变化的缺点，并且可以更方便 地扫描UV全波长范围。使用分光光度计的基线校正功能，可以去除由光源、检测器和样 品池等引入的仪器变化6。由于仪器噪声随着扫描速度的提高而增大，因此推荐使用最 大扫描速度的一半。（3）参比物。用于溶剂UV吸收测定的参比物有两种可能。试剂化学品（第9 版）使用水

14、作为参比；而中国药典使用空气作为参比。使用空气作为参比时测定的乙 腈UV吸收值低于使用水作为参比时测定的值，而且在400250 nm波长的范围内通常为负 值。这是由于空气中氧和二氧化碳的贡献使其UV吸收强于水。如图5中所示，由于参比 不同造成的UV吸收有显著不同，高达0.03 AU,所以当我们阅读供应商提供的分析报告 证书时需要了解究竟是使用水还是使用空气作为参比。用新鲜的水或者实验 统制得的超 比物。直得注 验室超纯水 新鲜水常常 气泡,这些气 验前去除，否 据的准确度。3 5用窃叼业朮作拘*tt牌到的HPucazmw UUiBl收由述门申比芭皿1推荐使HPLC级瓶装 室超纯水系 纯水作为参

15、 意的是，实 系统制得的 含有大量的 泡需要在实 则会影响数（4）氮气喷雾。为了延长溶剂的保存时间，一些HPLC溶剂供应商将惰性氮气充入溶剂。作者研究了氮气对乙腈UV吸收的影响（图6）。结果发现经过氮气喷雾，乙腈在250200 nm范围内的UV吸收显著降低。200 nm处的吸光率为0.012，是氮气喷射前的四 分之一。其原因可能是氮气在乙腈中的溶解度远小于氧气和二氧化碳。氮气喷雾减少了氧 气和二氧化碳对乙腈UV吸收的贡献。（注意：也可能是由于氧气和溶剂形成了电荷传递复合物导致了 UV吸收。） 推荐在实验中用聚四氟乙烯（PTFE）盖子将这两个池都盖住。的挥发性。由于 发性溶剂，如果 池在测试过程

16、 么样品池中的 会进入样品室 造成吸光率读ftl-S 6ltl HPLC的 UVWfifiaUcm 比色 Mb（5）溶剂乙腈是一种挥样品池和参比中是敞开的，那乙腈蒸汽可能或参比池，结果数偏低。因此，2.3 HPLC级乙腈空白梯度洗脱规范的意义如果溶剂中的杂质水平 低于1 ppm，简单的UV光谱通常检测不到其存在1。然而, 这些痕量杂质可能在有机相和水相比例较低时在柱上富集并保留，然后当梯度过程中流动 相洗脱能力增强时被洗脱下来，从而形成鬼峰7。因此，HPLC空白梯度洗脱基线上的鬼 峰高低，是评价HPLC级乙腈质量的关键规范方法。它清楚地表明了乙腈中是否含有影响 梯度洗脱模式下HPLC分析的痕量

17、的杂质。试剂化学品（第9版）明确规定214 nm处HPLC空白梯度洗脱基线的最大峰高应 低于5 mAU。具体的测定方法如下：C18柱（250 mmX4.6 mm .，5 um）；梯度：0 min， 80%水（溶剂A），20%乙腈（溶剂B），保持30 min；在50 min时达到100% B，保持 10 min；流速2 mL/min。样品运行3次，并去掉第1次运行的结果5。图7比较了 B&J ACS/HPLC和几种国内色谱级乙腈样品的ACS空白梯度洗脱基线。结果表明，一些本地产色 谱级乙腈样品在254 nm时会产生高达20 mAU的鬼峰。这说明即使在254 nm处，这些国 产试剂也可能在HPLC

18、常规分析中产生干扰。实际应用中，往往 使用梯度洗脱模式 的HPLC分析，因此 梯度洗脱规范提出 了满足高灵敏HPLC 溶剂供应商也生产 这种乙腈不同于用SMnm#不同晶陶 ACS/HPLC萍地供驰便仁一#堆供直裔享锲应便3,舟厲箫忡：Anllflflt C1B性i好mm l.d. x 50*fi比卅:ffiJK fmjn報如 Irak応遜阳.20）,tTO,龜在HPLC的一些 需要在更低波长处 以实现高灵敏度 对乙腈的HPLC空白 了更高的要求。为 应用的要求，一些 梯度级HPLC乙腈。 于等度洗脱HPLC分析的乙腈，它们可以满足更严格的梯度洗脱规范。例如，Honeywell Burdick

19、& Jackson 的空白梯度洗脱基线规格为：254 nm时低于1 mAU，215 nm时低于5 mAU。图1中，在215nm下，不同供应商的梯度级乙腈的梯度洗脱基线不同，说明它们用于低波长梯度洗脱模式 痕量HPLC分析的质量不同。2.4影响空白梯度洗脱基线测定的因素由于操作和HPLC系统本身的复杂性，系统中的任何部分都可能成为梯度洗脱基线鬼 峰的来源，因此在实验过程中应十分注意降低HPLC系统和水相的干扰。（1）HPLC系统污染和流动相添加剂的影响。梯度洗脱过程中，任何有UV吸收的杂 质都可能产生鬼峰。除了 HPLC进样系统和色谱柱的污染，样品溶剂和流动相的不匹配 也会产生鬼峰。图8为当10

20、0%乙腈样品进入系统中，乙腈和水梯度运行色谱图中开始处可 能产生正或负的鬼峰。因此进行空白梯度洗脱基线测定时，为了去除可能来自进样系统 的干扰而不予以进样。测试前色谱柱应彻底洗净，或者使用一根专门用来做这个实验的色 谱柱来避免来源于色谱柱的交叉污染。的实际应用中， 加入一些添加 和峰形。然而， 可能成为梯度的来源。图9中 入乙酸会导致样品寒剂对哲诸用轧AC hi ACN:*=S0:10fv；v,无碎酣中色诲条存：AniCIa Ux 5l mni, 5 仍谨：0-B mUniln：桧禺逋底：363 nmi漁谜桓九 水.讽动掏E : Nflh拂 虞 fElin (O ID J1(J, lOl.MS

21、h 3Q 梧邑60)446, 101,(50, TQhHPLC分析常向流动相中 剂来改善分离 这些添加剂也 洗脱基线鬼峰 可见，水相中加 梯度洗脱基线中有鬼峰。因此，乙腈空白梯度洗脱基线测定操作中，只用水和乙腈作为流动相而不加添 加剂。(2)HPLC系统中气泡的影响。溶剂中的气泡经W过HPLC系统也可能产生A. E U U U -LL鬼峰（图10）。这种鬼59瞬刖相中的乙醯时烹自禅虞的帝啤口无峰和典型的杂质峰不同，样品诅样门乩前柚矶一乙帼水涪町nM*3i庇它们是鱼翅动柜创Zflfi境ALfeirtft.追11和妬锻同圍乩形：其前边缘很锐，然后几乎线性下降至基线。在线压力监测系统显示，鬼峰形成时

22、有很快的系统压力降（图11）, 更进一步证明这些鬼峰的形成是由于系统压力的瞬间快速降低而不是由于杂质的存在。 参考文献7 和8详细解释了气泡如何导致了这种鬼峰的生成。因此，当进行空白梯rniV度洗脱测试时，需要确保*HPLC系统中M的气泡完全阳10 st功掲中的V諭对室白棍Jft的翼单h 第一古毎舒；除净、脱气机正常工作并一鼻二次図行1 一集三冼進行口色琥若件同胸九且流动相充分脱气，从而保证系统中没有气泡。（3）流动相中水的影响。水相也是空白梯度洗脱基线中Sit S110中系览圧外时誇阔酌曲劣匕e饵一鬼峰的一个3匕重要来源。实际上，空白基线洗脱基线中的大部分鬼峰来源于水相9。在消费者处进行的一

23、次HPLC 梯度洗脱基线操作中发现使用不同品牌的乙腈时，17.5 min处都有一个很高的鬼峰，说明 这是由消费者的水净化系统引起的（图2）。许多分析实验室常使用商品化饮用水或蒸馏水作为HPLC分析的流动相。实际上，水的塑料容器常会促进细菌的生长，容器中的添加 剂也可能会溶入水中，从而导致梯度洗脱模式中出现鬼峰。因此，推荐使用由HPLC溶剂 供应商提供的商品化瓶装HPLC级水，或超纯水系统制备的用于HPLC的水。图12表明新 鲜的B&J ACS/HPLC水和来自Milli-Q系统的超纯水都能满足高灵敏度HPLC梯度洗脱测试 规格。但应该注意的是，空气中的污染物也可能进入到瓶装HPLC水中，一旦盖

24、子打开一段 时间后可能会长菌。图12显示，开瓶一周的棕色瓶装HPLC水的梯度洗脱 基线严重漂移， 并且相比于新鲜HPLC水，其峰的数量和峰高都显著增加。因此，瓶装HPLC级水一旦打开， 最好在两天内使用。至于Milli-Q超纯水，应注意的是超纯水系统中的柱子和UV灯是消 耗品，当到达使用寿命时需要更换;否则水中的总有机碳（TOC）可能显著增加，从而在梯 度洗脱测试中产生干扰9。为避免柱内的流动相“疏水性洗脱中初始塌陷”，梯度流动相组成不使用100%水，而使用较水相比例（根1515 ?1Snm空佛展St朋戛劣的壽响：UIIII-0AJ AC&HPLC色溝脈件同屈九低的有机相/据不同的HPLC溶剂

25、供10%30% 乙腈）。应商,通常为 如果鬼峰是由流动相造成的，峰高会随着初始有机相7水相比例的持续时间而变大。为了进一步确定鬼峰是来自乙腈或水，可以改变初始有机相的比例。如果鬼 峰随着初始有机相比例增大而增大，那么其来源应为乙腈；反之则来源于水。图13中, 鬼峰高随着平衡时间增加，所以这些鬼峰全部来自于流动相。如果考察不同初始有机相 比例的两个梯度洗脱基线，当初始有机相比例从20%增至30%时，4852min范围内的鬼峰 增多，4046 min范围内的鬼峰消失。这说明前一个来源是乙腈而后一个是水。(4)过滤造成的流 为了避免流 存在的颗粒 系统堵塞， 应商通常推 进行微过滤。定販廿田于SkS

26、L西中的筆滋三一却昭隔帆D = 30网.ttttafHSO min；和曲- BOiSD, 粧3*间 30 mii; ACR/HflO = M特孕时風 90rrtn口芭IS案盖同用动相污染。动相中可能造成HPLCHPLC仪器供荐对流动相然而，操作3结论UV吸收和 洗脱基线是HPLC 键规格。由于UV 收很低，推荐使 基线校正和适当不小心或者微过滤装置本身都可能会向流动相中引入杂质。一方面，商品化过滤膜的质 量差别很大，并且（尤其是用尼龙或高密度聚乙烯制作的）过滤膜本身可能引入更多颗粒 或含有可被乙腈萃取的物质；另一方面，一般的实验室条件下，很难保证过滤过程中过滤 装置的玻璃器皿部分完全没有颗粒。

27、使用0.45 m尼龙支撑的的疏水PTFE膜过滤乙腈, 空白梯度洗脱基线中45 min处会出现高达50 mAU的鬼峰（图14）。尽管污染的来源还需 要进一步确认，这仍可说明实验室中微过滤操作引起污染的风险很高。因此，推荐在HPLC 梯度洗脱评价测试中直 接使用由生产商提供的原装瓶里的乙腈，而不增加其他处理操作。- HPLC空白梯度- 级乙腈的两个关！UIUlBHUlIH的柑U唬引谜的诃卑对空削基陕苗超咱二TfttT区域内乙腈的吸-nijtflw的邑睛幻色摘棗怜同si九用双光路模式、 增加比色皿长度来获得更加准确的结果。另外，参比物质、溶剂是否经过氮气喷射以及溶剂本身的挥发 性也可能影响测试结果。相比于UV吸收，HPLC空白梯度洗脱基线评价可以为应用于HPLC 梯度的乙腈质量提供更加精确和实用的评价。测试中需要考虑多种实际方面来确保获得准确可靠的测试结果；来自于HPLC系统、流动相添加剂和水相的污染，以及附加的过滤操作都需要避免；系统中的气泡也要除净。