《基因工程PCR》PPT课件

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1、第 四 节 DNA聚 合 酶 链 式 反 应PCR技 术 是 一 种 模 拟 DNA体 内 复 制 过 程 的 体 外DNA复 制 过 程 ， 在 一 个 离 心 管 的 缓 冲 液 体 系 中 ，加 入 DNA模 板 ， dNTPs, 引 物 和 DNA聚 合 酶 ， 然 后 通 过 变 性 、 退 火 、延 伸 三 个 温 度 的 不 断 循 环 ， 使 得 目 标 DNA得 到 快速 大 量 的 复 制 。 PCR技 术 已 经 广 泛 应 用 于 科 学 研 究 和 医 疗 事业 ， 比 如 DNA的 克 隆 ， 序 列 分 析 ， 医 学 诊 断 以 及生 物 系 统 发 生 科 学

2、 的 研 究 等 。 反 应 需 要 两 条 合 成 的 寡 核 苷 酸 片 段 和 耐 热 的 DNA聚 合 酶 。 一 般 用 Taq DNA聚 合 酶 ， 是 从 栖 热 水 生 菌（ Thermus aquaticus ） 中 提 取 出 来 的 。 两 条 引 物 分 别 和 正 义 链 和 反 义 链 的 3 端 结 合 ，然 后 朝 着 彼 此 的 3 -OH 方 向 延 伸 。Polymerase Chain Reaction（ PCR） Polymerase Chain Reaction（ PCR） 94 7256 反 应 的 第 一 步 是 加 热 DNA 到 95C 进

3、行 变 性 （ denature） 使 双 链 解 离 为单 链 ， 解 除 变 性 条 件 后 在 较 低 的 温 度 50C下 引 物 退 火 （ annealed） 结 合 到 目标 序 列 上 ， 然 后 在 72C下 ， 在 dNTPs存 在 的 情 况 下 ， DNA 聚 合 酶 运 用 使 引物 序 列 延 伸 （ extends ） 。 热 稳 定 的 酶 不 仅 可 以 使 DNA快 速 合 成 , 而 且 在 较宽 的 温 度 范 围 内 都 能 催 化 DNA合 成 。 三 个 步 骤 ： 变 性 , 退 火 和 延 伸 PCR循 环 : 一 般 25-40 个 循环 .

4、 每 个 循 环 都 使 目标 序 列 翻 倍 从 而PCR可 以 快 速 扩 增 Polymerase Chain Reaction（ PCR） PCR 扩 增 过 程 中 片 段 增 殖 的 计 算 随 着 扩 增 循 环 数 的 增 加 ， 长 链 目 标 片 段 增 加 的 值 为 2(n+1), 而 短 链 目 标片 段 则 以 几 何 倍 数 增 加 值 为 2(n+1) 2(n+1)。 20个 循 环 后 , 目 标 片 段 大 约 增 加 1 百 万 倍 。 PCR 使 用 的 引 物 需 特 异 性 与 目 标 序 列 匹 配 ， 如 果 引 物 与 DNA分 子 的 其他

5、部 位 结 合 , 非 特 异 扩 增 将 产 生 。 引 物 与 目 标 序 列 的 特 异 性 结 合 取 决 于 温 度 , 每 对 引 物 最 适 的 温 度 要 通 过 实 验 获 得 。 寡 核 苷 酸 引 物 的 长 度 一 般 为 20-25 个 碱 基 ， GC 含 量 一 般 为 50% 左 右 ，这 样 退 火 温 度 在 52-58C之 间 。 很 长 的 寡 核 苷 酸 引 物 或 高 的 GC含 量 需 要 很 高的 温 度 ， 而 短 的 寡 核 苷 酸 引 物 或 低 的 GC含 量 则 需 要 较 低 的 温 度 。 对 于 17-25 个碱 基 的 引 物

6、, Tm的 计 算 为 : 最 适 的 退 火 温 度 一 般 比 T m低 3-5C。 Primer design and cycle optimization 1、 所 设 计 引 物 长 度 范 围 为 18-27碱 基 ， 最 长 不 超 过 38， 因为 过 长 会 导 致 延 伸 温 度 大 于 74 ， 不 适 于 TaqDNA聚 合 酶 进 行反 应 。 2、 引 物 序 列 在 模 板 内 应 当 没 有 相 似 性 较 高 ， 尤 其 是 3端 相似 性 较 高 的 序 列 ， 否 则 会 容 易 导 致 错 配 。 引 物 3端 出 现 3个 以 上的 连 续 碱 基 ，

7、 如 GGG或 CCC， 也 会 使 错 误 引 发 率 增 加 。 引 物 退火 温 度 在 50-70 之 间 ， 上 下 引 物 之 间 退 火 温 度 相 差 不 超 过 5 。 3、 GC含 量 在 40-60%之 间 ， 过 高 或 过 低 都 不 利 于 引 发 反 应 。上 下 游 引 物 的 GC含 量 不 能 相 差 太 大 。 4、 3末 端 最 好 不 是 A， 3末 端 为 A的 错 配 效 率 明 显 高 于 其 它三 个 碱 基 。 引 物 设 计 原 则 PCR反 应 体 系 的 确 立Water Buffer（ 10 ） Mg+（ 25mM） dNTPs（ 1

8、0mM） Primer1（ 10uM） Primer2（ 10uM） Taq（ 5U/uL） Templets12.8 2 1.6 0.4 1 1 0.2 1128 20 16 4 10 10 2 20uL反 应 体 系 中 各 成 分 的 母 液 浓 度 及 加 入 量PCR扩 增 程 序 举 例Tem. 94 94 56 72 72Time 00:08:00 00:00:30 00:00:40 00:01:00 00:07:00Cycles 35 PCR反 应 的 应 用 广 泛 应 用 于 科 研 和 实 际 检 测 中 ，用 于 DNA 研 究 、 序 列 分 析 、 基 因 表 达测

9、 定 、 从 cDNA库 放 大 特 定 克 隆 、 构建 基 因 图 、 进 化 分 析 、 生 物 证 据 分 析 、医 学 研 究 与 临 床 检 验 、 性 别 控 制 、 转基 因 生 物 检 测 等 。 PCR扩 增 结 果 分 析 举 例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control. 思 考 题 ：1.名 词 解 释 ： PCR 2.简 述 PCR反 应 的 基 本 原 理 和 引 物 设 计 的原 则 是 什 么 ？