《分子生物学与临床》PPT课件

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1、分 子 生 物 学 与 临 床天 津 市 第 三 中 心 医 院刘 树 业 随 着 分 子 生 物 学 技 术 的 发 展 ， 聚 合 酶 链 反 应 （ PCR）技 术 已 逐 渐 应 用 于 遗 传 性 疾 病 、 肿 瘤 及 感 染 性 疾 病 等 方面 的 诊 断 。 1 . 检 测 临 床 标 本 中 病 原 体 核 酸 序 列 。 2 . 肿 瘤 基 因 突 变 情 况 。 3 . 遗 传 性 疾 病 的 基 因 序 列 。 4 . 人 类 白 细 胞 表 面 抗 原 （ HLA） 配 型 。 5 . 法 医 学 方 面 的 鉴 定 工 作 。PCR技 术 在 临 床 实 验 室

2、应 用 的 价 值 1. 灵 敏 度 高 ， 理 论 上 ， 只 要 标 本 中 含 有 一 个 分 子 的 DNA或 RNA就可 以 作 出 诊 断 。 2. 特 异 性 强 ， 对 于 一 个 19核 苷 酸 的 引 物 来 说 ， 非 特 异 性 配 对 的概 率 为 419 = 2.75*1011这 表 示 要 与 这 19个 碱 基 的 排 列 顺 序 完 全 相同 时 需 要 的 基 因 组 DNA片 段 的 最 小 长 度 ， 而 人 的 基 因 组 长 度 为3*109碱 基 对 ， 以 克 服 血 清 学 诊 断 有 交 叉 反 应 的 缺 陷 。 3. 可 以 早 期 诊

3、断 ， 如 在 HCV的 感 染 中 ， 第 一 周 内 就 可 以 检 测 出HCV RNA， 而 抗 体 的 产 生 一 般 在 第 二 周 以 后 。PCR在 诊 断 病 原 体 感 染 时 的 优 缺 点 4. 对 于 体 液 免 疫 力 低 下 或 使 用 免 疫 抑 制 剂 而 无抗 体 产 生 者 ， PCR却 可 以 作 出 明 确 诊 断 。5. 可 以 对 病 原 体 作 定 量 分 析 ， 反 映 病 原 体 在 机体 的 复 制 及 动 力 学 变 化 情 况 。6. 可 对 病 原 体 进 行 基 因 分 型 。 指 导 临 床 治 疗 。 不 足 之 处 : 1.操

4、 作 复 杂 ， 技 术 不 易 被 熟 练 掌 握 。 2.价 格 昂 贵 。 3.出 于 敏 感 性 太 高 ， 操 作 步 骤 多 而 复 杂 ， 即 使 有 极 少量 的 污 染 也 会 造 成 假 阳 性 。 4.由 于 操 作 复 杂 ， 对 试 剂 及 实 验 条 件 要 求 严 格 ， 稍 有差 错 就 会 出 现 假 阴 性 。 几 点 认 识一 .今 后 仪 器 和 试 剂 的 发 展 方 向 ： 封 管 、 定 量 及 自 动 化 ；二 .样 品 采 集 方 式 对 PCR很 重 要 ， 比 操 作 更 重 要 。三 .内 标 作 用 ： 操 作 过 程 的 监 控 、

5、控 制 假 阴 性 。四 .从 核 酸 提 取 、 扩 增 到 检 测 ， 对 照 与 待 测 标 本 同 步 进 行 ； 五 .禁 用 产 物 的 电 泳 分 析 技 术 。六 .探 针 杂 交 技 术 和 防 污 染 技 术 的 采 用 是 一 大 进 步 。 一 .标 本 的 采 集 常 用 于 基 因 扩 增 检 测 的 临 床 标 本 包 括 EDTA或 枸 橼 酸 钠 抗 凝 全 血或 骨 髓 、 血 清 或 血 浆 、 痰 、 脑 脊 液 、 尿 及 分 泌 物 等 。 采 血 液 等 样本 时 ， 应 使 用 一 次 性 密 闭 容 器 ， 如 真 空 采 血 管 。 当 使

6、用 非 密 闭 采样 系 统 时 ， 如 尿 、 分 泌 物 和 骨 髓 的 采 样 ， 必 须 注 意 防 止 来 自 采 样者 皮 屑 或 分 泌 物 的 污 染 。 采 样 时 必 须 戴 一 次 性 手 套 。 玻 璃 器 皿 在 使 用 前 应 高 压 处 理 ， 因 为 玻 璃 器 皿 常 含 有 不 易 失 活 的RNA酶 。 最 好 是 热 灭 菌 ， 250 烘 烤 4小 时 以 上 可 使 RNA酶 永 久 性失 活 。 全 血 和 骨 髓 标 本 必 须 进 行 抗 凝 处 理 。 EDTA和 枸 橼 酸 盐 是 首 选 的抗 凝 剂 。 不 能 使 用 肝 素 抗 凝

7、， 因 为 肝 素 是 Taq酶 的 强 抑 制 剂 ， 而且 在 其 后 的 核 酸 提 取 步 骤 中 很 难 去 除 。 临 床 用 于 RNA（ 如 HCV RNA） 扩 增 检 测 的 血 标 本 建 议 进 行 抗 凝处 理 ， 并 尽 快 （ 3小 时 以 内 ） 分 离 血 浆 ， 以 避 免 RNA的 降 解 。 如未 作 抗 凝 处 理 ， 则 抽 血 后 ， 必 须 在 1小 时 内 分 离 血 清 。 二 .标 本 的 稳 定 化 处 理 用 于 DNA扩 增 检 测 的 标 本 ， 采 集 后 一 般 不 需 特 殊 的 稳 定 化 处 理 ，但 标 本 应 及 时

8、送 至 实 验 室 。 由 于 RNA易 受 RNA酶 的 降 解 ， 因 此 用 于 RNA测 定 的 标 本 有 时 必 须进 行 稳 定 化 处 理 ， 如 流 行 病 学 调 查 的 现 场 采 样 。 异 硫 氰 酸 胍 盐（ Guanidine thiocyanate,GITC） 可 使 DNA酶 和 RNA酶 立 即 失 活 ，因 此 在 采 集 标 本 时 ， 可 将 标 本 材 料 如 血 清 或 血 浆 按 1 4的 比 例 加至 含 有 5mol/L GITC的 试 管 内 中 ， 从 而 使 血 清 （ 浆 ） 中 的 RNA酶不 可 逆 失 活 。 经 上 述 稳 定

9、 化 处 理 后 ， 标 本 一 般 不 需 要 冷 藏 即 可 邮寄 。 对 于 特 定 的 检 测 项 目 ， 上 述 稳 定 化 处 理 方 法 的 效 果 究 竟 如 何 ，要 使 用 相 应 的 逆 转 录 PCR测 定 方 法 来 评 价 。 三 .标 本 的 运 送 标 本 采 集 后 必 须 尽 快 送 至 实 验 室 。 经 过 适 当 稳 定 化 处 理 的标 本 可 在 常 温 下 通 过 邮 寄 运 送 。 如 用 于 DNA扩 增 检 测 的EDTA抗 凝 全 血 标 本 及 用 于 RNA扩 增 检 测 的 经 GITC稳 定 化处 理 的 标 本 ， 通 常 在

10、运 送 时 ， 应 采 用 不 易 破 碎 的 容 器 装 载标 本 。 用 于 RNA检 测 的 标 本 ， 如 果 未 经 稳 定 化 处 理 ， 则 必须 速 冻 后 ， 放 在 干 冰 中 运 送 。 四 .标 本 的 贮 存 临 床 体 液 标 本 如 血 清 /血 浆 等 可 于 -70 下 长 时 间 贮 存 。 用于 DNA测 定 的 已 纯 化 核 酸 样 本 可 在 10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓 冲 液 （ pH 7.5-8.0） 中 4 保 存 ， 用 于 RNA测 定 的 已 纯 化 核 酸 样 本 应 在 缓 冲 液 中 -80 或 液

11、氮 中 贮 存 。用 乙 醇 沉 淀 的 核 酸 样 本 贮 存 在 -20 即 可 。 用 GITC处 理 的RNA标 本 在 室 温 可 保 存 7天 。 五 .标 本 的 处 理 （ 核 酸 提 取 ） 标 本 处 理 即 核 酸 提 取 纯 化 是 决 定 扩 增 检 测 成 败 的 关 键 性 步 骤 ， 在使 用 商 品 核 酸 提 取 试 剂 提 取 临 床 标 本 中 的 核 酸 模 板 前 ， 应 对 其 进行 充 分 评 价 以 验 证 其 提 取 的 有 效 性 。 通 常 ， 核 酸 制 备 质 量 不 高 是由 于 抑 制 物 去 除 不 完 全 所 致 ， 抑 制

12、物 可 能 来 源 于 标 本 本 身 （ 如 血红 素 及 其 前 体 或 降 解 产 物 ） 或 核 酸 提 取 过 程 中 残 留 的 有 机 溶 剂（ 如 酚 、 氯 仿 等 ） ， 这 些 物 质 对 其 后 的 Taq酶 扩 增 反 应 步 骤 具 有 强烈 的 抑 制 作 用 ， 从 而 影 响 靶 核 酸 的 扩 增 测 定 。 当 标 本 为 痰 时 ， 则 必 须 先 进 行 液 化 处 理 ， 再 提 取 核 酸 。 需 注 意 的是 ， 液 化 时 不 能 加 热 ， 液 化 时 间 不 能 过 长 。 此 外 ， 当 靶 核 酸 为RNA时 ， 逆 转 录 PCR测

13、定 失 败 的 常 见 原 因 是 标 本 在 运 送 前 未 经 充分 的 稳 定 化 处 理 (血 清 或 血 浆 按 1 4的 比 例 加 至 含 有 5mol/L GITC的 试 管内 中 ， 从 而 使 血 清 （ 浆 ） 中 的 RNA酶 不 可 逆 失 活 )及 核 酸 提 取 试 剂 的RNA酶 的 污 染 。 对 于 前 者 ， 要 核 查 测 定 分 析 前 的 步 骤 ， 如 果 发 现有 RNA降 解 的 证 据 ， 实 验 室 则 应 拒 绝 接 受 标 本 ， 要 求 重 新 采 取 标 本 ， 并 对 运 送 者 给 以 详 细 的 指 导 。 对 于 后 者 ，

14、 建 议 使 用 高 质 量 的商 品 核 酸 提 取 试 剂 。 一 .内 源 性 物 质 (影 响 因 子 ） 1.类 风 湿 因 子 2. 补 体 3.嗜 异 性 抗 体 4.嗜 靶 抗 原 的 自 身 抗 体 5.医 源 性 诱 导 的 抗 鼠 Ig(s)抗 体 6.交 叉 反 应 物 质 7.标 本 中 其 它 成 分 的 影 响 二 .外 源 性 物 质 1.标 本 溶 血 2.标 本 受 细 菌 污 染 3.标 本 保 存 不 当 4.标 本 凝 集 不 全 5.标 本 管 中 添 加 物 质 的 影 响 PCR测 定 的 临 床 应 用 及测 定 结 果 的 临 床 意 义结

15、核 分 支 杆 菌病 原 学 ： 结 核 分 支 杆 菌 复 合 群 （ MTBC） ： 人型 结 核 分 支 杆 菌 、 牛 型 结 核 分 支 杆 菌 、 非 洲 型 结核 分 支 杆 菌 和 田 鼠 型 结 核 分 支 杆 菌 ， 后 者 无 致 病性 。 对 人 有 致 病 性 的 主 要 是 人 型 结 核 分 支 杆 菌 ，牛 型 引 起 人 类 发 病 已 很 少 见 。 此 外 分 支 杆 菌 报 道有 100余 种 ， 1994年 国 际 公 认 有 56种 ， 常 用 非 结 核分 支 杆 菌 （ NTM） 或 其 他 分 支 杆 菌 （ MOTT） 的名 称 。培 养 ：

16、 15-20小 时 一 代 ， 2-4周 看 到 培 养 基 上 的 菌落 。 抗 菌 治 疗 后 需 4-8周 或 20周 才 出 现 菌 落 。 引 物 设 计 ： 结 核 分 支 杆 菌 共 有 的 靶 序 列 ： 65KD 人 型 结 核 分 支 杆 菌 特 异 的 靶 序 列 mpt40 MTBC特 有 的 靶 序 列 ， 如 IS6110插 入 序 列 rRNA序 列 ， 以 16S-rRNA为 模 板 cDNA扩 增 ， 高度 保 守 ， TB有 高 达 1000-10000拷 贝 数 ， 具 很 高 的 灵 敏度 和 特 异 性 。 注 意 问 题 ： 标 本 处 理 痰 、

17、胸 腹 水 ： 液 化 剂 ， 红 细 胞 裂 解 液 临 床 应 用 评 价 ：1. Tb 与 其 他 分 支 杆 菌 区 别 ： AIDS 鸟 分 支 杆 菌 ， 龟 分 支杆 菌2. TB 耐 药 基 因3. 含 菌 量 较 低 标 本 分 离 TB 敏 感 性 ： 远 高 于 直 接 涂 片 和 培 养 涂 片 镜 检 ： 10000-100000菌 /ml， 培 养 ： 10-100个 活 菌 PCR： 1-20 个 结 核 杆 菌 ， 但 不 能 鉴 别 死 菌 和 活 菌 ， 不能 反 映 抗 结 核 治 疗 的 效 果 ； 还 可 见 临 床 无 结 核 病 证 据 涂片 和

18、培 养 均 阴 性 而 PCR阳 性 的 情 况 ， 这 在 理 论 上 可 诊 断结 核 ， 但 临 床 上 很 难 被 医 师 认 同 ， 这 涉 及 所 谓 金 标 准 的问 题 ， 目 前 还 远 不 能 就 此 情 况 下 PCR阳 性 的 生 物 学 意 义和 价 值 作 出 评 价 。 沙 眼 衣 原 体 Chlamydea trachomatis Ct病 原 学 ： 三 个 生 物 变 种 ： 沙 眼 生 物 变 种 A-K12个 血 清 型 性 病 淋 巴 肉 牙 肿 变 种 LGV3个 血 清 型 ， 人 是 天 然宿 主 鼠 生 物 变 种 鼠 是 天 然 宿 主 ， 不

19、 侵 犯 人 ， 与 鼠 肺炎 有 关 病 原 学 检 验 ： 涂 片 、 抗 原 抗 体 检 测 、 核 酸 检 测 四 种 衣 原 体 的 性 状 比 较 PCR： 16SrRNA基 因 高 度 保 守 衣 原 体 属 特 异 引 物 7.5kD 质 粒 及 MOMP(主 要 外 膜 蛋 白 )基 因 适 于 构 建 种 或 型特 异 性 引 物 根 据 沙 眼 衣 原 体 内 源 性 质 粒 序 列 设 计 合 成 的 一 对 引 物 : 1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG. 扩 增 片 段 517,可 扩 增 15个 已 知 血 清 型

20、的 沙 眼 衣 原 体 .实 验证 明 ,此 引 物 不 扩 增 其 他 眼 部 常 见 微 生 物 和 正 常 人 核 酸 ,而 对 临 床 49例 诊 断 为 沙 眼 的 标 本 阳 性 率 为 63%,敏 感 性 和特 异 性 均 超 过 细 胞 培 养 法 和 免 疫 荧 光 法 与 酶 免 疫 法 等 常规 方 法 ,灵 敏 度 达 到 能 检 出 1个 衣 原 体 DNA分 子 . 特 别 要 注 意 的 问 题 : 取 材 : 一 定 要 取 到 细 胞 临 床 评 价 ： 金 标 准 培 养 免 疫 学 ： 荧 光 主 观 判 定 EIA金 葡 、 链 球 菌 、 淋 球 菌

21、-交 叉 反 应 PCR： 假 阴 阳 性 人 类 组 织 相 容 性 抗 原 (HLA)组 织 相 容 性 （ 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 MHC）系 统 的 概 念 ： 有 I、 II、 III类I类 ： HLA-A， HLA-B， HLA-C， HLA-E，HLA-F， HLA-G， HLA-HL等II类 : HLA-DR， HLA-DQ， HLA-DP，HLA-DO， HLA-DN， HLA-M,等 位 点III类 : 为 补 体 系 统 C2， C4， Bf等 。HLA抗 原 的 分 类 : I 类 和 II 类 抗 原多 态 性 、 共 显 性 遗 传 ： 已 发 现

22、的 HLA基 因 位点 (等 位 基 因 数 )约 400左 右 HLA分 型 的 基 本 方 法血 清 学 方 法 :基 本 原 理 活 的 淋 巴 细 胞 表 面有 大 量 的 HLA-A,HLA-B,HLA-C HLA-DR抗 原 ,在与 特 异 性 的 同 型 抗 体 结 合 后 ,有 补 体 存 在 时 会被 杀 死 ,经 过 染 色 ， 根 据 淋 巴 细 胞 被 杀 死 的 百分 率 ,可 以 决 定 待 测 淋 巴 细 胞 是 否 具 有 某 一 特异 性 的 抗 原 .细 胞 学 方 法 :基 本 原 理 检 测 的 抗 原 属 于HLA-DP， HLA-DQ两 个 位 点

23、， 如 果 两 种 淋 巴 细 胞表 面 抗 原 不 同 ,在 一 起 培 养 ， 不 同 抗 原 互 相 刺激 ， 淋 巴 细 胞 增 殖 并 向 母 细 胞 转 化 ； 否 则 ， 这两 种 细 胞 会 保 持 不 变 。 HLA分 型 的 基 本 方 法常 用 X射 线 处 理 已 知 HLA-DP， HLA-DQ特 异淋 巴 细 胞 ， 失 去 增 殖 能 力 保 持 刺 激 能 力 ，与 待 测 淋 巴 细 胞 混 合 培 养 ， 若 不 发 生 增殖 和 母 细 胞 化 即 认 为 与 已 知 特 异 性 细 胞同 型 ， 否 则 为 不 同 型 别 淋 巴 细 胞 .HLA-DR

24、基 因 分 型 :(例 )序 列 特 异 性 引物 PCR法 合 成 19对 引 物 ,21管 加 公 共 引物 DR型 别 . HLA抗 原 ：一 .HLAABC抗 原 :与 疾 病 相 关 HLAA,B与 器 官 移 植 的 关 联 没 有 D的 配 型 意义 显 著 ,C无 意 义 .二 .HLAD抗 原 :与 器 官 移 植 配 型 相关 DR座 位 上 的 等 位 基 因 数 比 AB座 位 上 的 少 ,在 随机 人 群 中 挑 选 到 DR抗 原 配 合 的 供 体 要 比 选 择AB抗 原 配 合 的 供 体 容 易 ,所 以 目 前 器 官 移 植 主要 做 DR配 型 .

25、遗 传 病 检 测 遗 传 病 是 由 基 因 在 性 细 胞 的 突 变 引 起 的 一 。 PCR结 合 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 苷 酸 探 针 法 对 已 知 突 变 热 点 基 因 检 测 ： PCR-目 的 基 因 -膜 杂 交 发 现 突 变 位 点 合 成 正 常 及 突 变 寡 核 苷 酸 探 针 一 个 等 位 基 因 有 一 种 ASO探 针 ,要 证 明 待 测 标 本 是 否 属 于 这一 等 位 基 因 ,要 进 行 一 次 杂 交 显 示 信 号 的 操 作 ,这 对 于 致 病基 因 有 多 个 突 变 可 能 性 的 诊 断 (地 中 海 贫 血 在

26、 中 国 有 18种 突变 类 型 ,全 球 有 100多 种 ),操 作 繁 杂 甚 至 不 可 能 . 二 。 PCR扩 增 特 异 等 位 基 因 在 3 末 端 设 计 突 变 位 点 ,根 据 特 异 性 PCR产 物 出 现 与 否 判 断突 变 的 存 在 . 三 .限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 分 析 突 变 位 点 与 酶 切 位 点 相 关 出 现 新 的 电 泳 图 谱四 .单 链 构 象 多 态 性 分 析 (SSCP) PCR扩 增 靶 DNA; 将 特 异 的 PCR扩 增 产 物 变 性 ， 而 后快 速 复 性 ， 使 之 成 为 具 有 一 定 空

27、间 结 构 的 单 链 DNA分子 ; 将 适 量 的 单 链 DNA进 行 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 ; 最 后 通 过 放 射 性 自 显 影 、 银 染 或 溴 化 乙 锭 显 色 分析 结 果 .若 发 现 单 链 DNA带 迁 移 率 与 正 常 对 照 的 相 比 发生 改 变 ， 就 可 以 判 定 该 链 构 象 发 生 改 变 ， 进 而 推 断 该DNA片 段 中 有 碱 基 突 变 .该 方 法 简 便 、 快 速 、 灵 敏 ， 不需 要 特 殊 的 仪 器 ， 适 合 临 床 实 验 的 需 要 . 不 足 之 处 .例 如 ， 只 能 作 为 一

28、 种 突 变 检 测 方 法 ，要 最 后 确 定 突 变 的 位 置 和 类 型 ， 还 需 进 一 步 测 序 ;电 泳 条 件 要 求 较 严 格 ;另 外 ， 由 于 SSCP是 依 据 点突 变 引 起 单 链 DNA分 子 立 体 构 象 的 改 变 来 实 现 电泳 分 离 的 ， 这 样 就 可 能 会 出 现 当 某 些 位 置 的 点 突变 对 单 链 DNA分 子 立 体 构 象 的 改 变 不 起 作 用 或 作用 很 小 时 ， 再 加 上 其 他 条 件 的 影 响 ， 使 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 无 法 分 辨 造 成 漏 检 .尽 管 如 此 该 方

29、法和 其 他 方 法 相 比 仍 有 较 高 的 检 测 率 .首 先 ， 它 可以 发 现 靶 DNA片 段 中 未 知 位 置 的 碱 基 突 变 .Takao，经 实 验 证 明 小 于 300bp的 DNA片 段 中 的 单 碱 基 突 变 ，90%可 被 SSCP发 现 ， 他 认 为 现 在 知 道 的 所 有 单 碱基 改 变 绝 大 多 数 可 用 该 方 法 检 测 出 来 .另 外 ，SSCP方 法 可 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 将 不 同 迁 移率 的 突 变 单 链 DNA分 离 ， 并 且 还 可 以 进 一 步 提 纯 .用 这 种 方 法 可 以

30、 最 终 从 DNA序 列 水 平 上 鉴 别 突 变DNA片 段 . UNG酶 /dUTP防 污 染 系 统 本 试 剂 盒 中 加 入 了 dUTP以 保 证 PCR只 选 择 性 地 扩 增 临床 中 的 靶 DNA。 UNG酶 （ 尿 嘧 啶 糖 基 化 酶 ） 能 识 别 并催 化 酶 解 含 有 dUTP 的 DNA结 构 ， 但 不 会 对 含 有 dTTP 的 DNA的 结 构 识 别 并 催 化 酶 解 。 dUTP 不 存 在 于 自 然的 DNA中 ， 只 有 运 用 dUTP 替 代 dTTP的 PCR反 应 之 中产 生 的 扩 增 子 中 存 在 。 这 种 dU化

31、 的 PCR产 物 与 UNG酶一 起 孵 育 后 使 其 失 去 再 被 扩 增 的 能 力 ， 因 UNG可 裂 解尿 嘧 啶 碱 基 和 糖 磷 酸 骨 架 间 的 N-糖 苷 键 ， 可 去 除 dU，使 无 dU的 位 点 阻 止 TaqDNA聚 合 酶 的 延 伸 。 UNG酶 可从 单 链 或 双 链 DNA中 消 除 尿 嘧 啶 ， 而 对 RNA中 的 尿 嘧啶 和 单 一 尿 嘧 啶 分 子 则 无 作 用 。 UNG酶 在 正 常 PCR循环 变 性 一 步 就 可 被 灭 活 ， 所 以 对 含 dU的 新 的 PCR产 物没 有 影 响 。 肿 瘤 研 究 中 的 分

32、 子 生 物 学肿 瘤 分 为 :癌 ,肉 瘤 ,白 血 病 /淋 巴 瘤 癌 :90%的 人 类 肿 瘤 ,起 源 内 胚 层 及 外 胚 层 上 皮 细 胞肉 瘤 ,白 血 病 /淋 巴 瘤 起 源 中 胚 层 细 胞 ,包 括 肌 肉 ,骨 骼 ,血 管 ,成 纤 维 细 胞 以及 血 液 和 淋 巴 系 统 中 的 循 环 细 胞 肿 瘤 发 展 的 多 步 性 .病 毒 癌 基 因 :肿 瘤 病 毒 : 有 致 癌 能 力 的 DNA病 毒 : ( 6个 病 毒 家 族 ) 乙 肝 病 毒 , 猴 病 毒 40, 多 瘤 病 毒 , 乳 头 瘤 病 毒 , 疱疹 病 毒 , 痘 病

33、毒 只 有 一 类 RNA病 毒 致 癌 反 转 录 病 毒肿 瘤 抑 癌 基 因 的 发 现 : Hanis 1960年 ,正 常 细 胞 与 肿 瘤 细 胞 融 合 杂 合 体 细胞 不 致 瘤 正 常 细 胞 中 具 有 肿 瘤 抑 制 基 因 产生 肿 瘤 表 型 的 负 调 节 物 当 杂 合 体 细 胞 某 段 染色 体 丢 失 后 细 胞 变 为 肿 瘤 表 型 -这 段 染 色体 上 有 重 要 的 肿 瘤 抑 制 基 因 抑 癌 基 因 :P53多 种 肿 瘤 .早 期 发 现 肿 瘤 中 P53表 达 增加 ,认 为 是 癌 基 因 .正 常 P53基 因 抑 制 肿 瘤

34、形 成 ,肿 瘤 中 过 量 表 达 的 是 P53基 因 突 变 体 作 为 显性 抑 制 物 影 响 P53功 能 致 癌 P16,PTP多 种 抑 癌 基 因WT1肾 母 细 胞 癌DCC结 肠 癌APC家 族 性 腺 瘤 息 肉 癌 变 广 义 的 讲 ,许 多 在 细 胞 繁 殖 中 起 正 常 作 用 的 基 因 ,如 DNA修 复 基 因 ， 其 突 变 也 会 导 致 肿 瘤 的 发 生 ,它 们 的 存 在 间 接 地 起 到 抑 制 肿 瘤 的 作 用 临 床 评 价1、 假 阳 性 与 假 阴 性2、 阳 性 率 与 “ 金 标 准 ”3、 临 床 实 践 是 最 重 要

35、 的 依 据 遗 传 病 诊 断 地 中 海 贫 血 ： 珠 蛋 白 序 列 中 的 的 十 几 种 点 突 变 ； 3 -碱 基 特 异 的 PCR或 ASO. 地 中 海 贫 血 : 16号 染 色 体 珠 蛋 白 序 列 中 基 因 簇 的 三 种 大 片 段 缺 失 ； 每 条 染 色体 上 各 有 两 个 紧 密 连 锁 的 基 因 ， 故 一 对 16号 染 色 体 上 共 有四 个 珠 蛋 白 基 因 （ / ） 缺 失 1个 基 因 - +珠 蛋 白 合 成 障 碍 性 贫 血 缺 失 2个 基 因 - 0珠 蛋 白 合 成 障 碍 性 贫 血 缺 失 3个 基 因 - HbH

36、病 缺 失 4个 基 因 （ 全 部 缺 失 ） -Hb Bart s胎 儿 水 肿 综 合 症 非 缺 失 型 珠 蛋 白 合 成 障 碍 性 贫 血 不 终 止 HB constant spring 遗 传 病 诊 断甲 型 血 友 病 ： X-连 锁 隐 性 遗 传 病 ， （ 长距 离 PCR技 术 ） 唐 氏 综 合 症 （ 21三 体 ） ： 三 体 形 成 配 子 期 ； 智 力 低 下 ， 1/800全 基 因 组 分 析 法 :多 个 具 有 多 态 性 的 位 点进 行 连 锁 分 析 。 生 物 芯 片 ：PCR技 术 在 HLA-DRB1基 因 配 型 中 的 应 用

37、：序 列 特 异 性 引 物 PCR（ SSP-PCR） ： 基 因 诊 断 是 指 检 测 感 染 者 体 内 病 毒 核 酸 的 有 无 ,或含 量 多 少 来 进 行 病 原 学 诊 断 的 一 类 方 法 。病 毒 性 肝 炎 基 因 诊 断 包 括 病 毒 基 因 种 类 及 含 量 、基 因 分 型 、 亚 型 和 变 异 及 准 种 等 的 诊 断 。甲 型 肝 炎 和 戊 型 肝 炎 无 慢 性 化 ,且 有 较 好 的 血 清 学诊 断 指 标 ,故 一 般 不 需 进 行 基 因 诊 断 。HGV和 TTV病 毒 性 肝 炎 的 基 因 诊 断 定 性 和 定 量 PCR：

38、 定 性 检 测 主 要 是 用 于 未 知 感 染者 的 诊 断 ,确 定 患 者 是 否 感 染 了 肝 炎 病 毒 ,结 果 分别 报 告 为 阳 性 或 阴 性 。定 量 测 定 ： 己 知 感 染 者 的 抗 病 毒 治 疗 时 动 态 观 察疗 效 ,结 果 报 告 需 以 量 来 表 示 。 如 高 出 定 量 范 围上 限 ， 则 需 对 标 本 稀 释 后 再 测 ,低 于 定 量 范 围 下限 时 ,则 报 告 小 于 copies/ml,不 能 以 阴 性 形 式 报 告 。病 毒 性 肝 炎 的 基 因 诊 断 肝 炎 病 毒 甲 型 肝 炎 病 毒 与 戊 型 肝 炎

39、 病 毒 由 消 化 道 传 播 ，引 起 急 性 肝 炎 ， 不 转 为 慢 性 肝 炎 或 慢 性 携 带 者 。 乙 型 与 丙 型 肝 炎 病 毒 主 要 由 输 血 、 血 制 品 或 注射 器 污 染 而 传 播 ， 除 引 起 急 性 肝 炎 外 ， 可 致 慢性 肝 炎 ， 并 与 肝 硬 化 及 肝 癌 相 关 。 丁 型 肝 炎 病 毒 为 一 种 缺 陷 病 毒 戊 型 肝 炎 病 毒 （ HEV） 庚 型 肝 炎 病 毒 （ HGV） TT型 肝 炎 病 毒 （ TTV） SEN型 肝 炎 病 毒 （ HSV） 甲 型 肝 炎 病 毒 （ hepatitis A vir

40、us， HAV） HAV的 生 物 学 性 状属 小 RNA病 毒 科 ， 直 径 27nm， 无 包 膜呈 20面 立 体 对 称外 面 为 一 独 立 外 壳 ， 内 含 一 个 单 链 RNA分子 HAV的 电 镜 照 片 Feinstone（ 1973） HAV的 结 构 HAV的 致 病 性粪 口 途 径 传 播 口 咽 部 或 唾 液腺 中 早 期 增 殖 肠 道 与 局 部淋 巴 结 中 大量 增 殖入 血 并 形成 病 毒 血症肝 脏 为 最 终 靶器 官 （ 病 毒 直接 损 伤 或 免 疫病 理 作 用 ）通 过 胆 汁 随 粪便 排 出 体 外 HAV的 免 疫 性 HA

41、V只 存 在 单 一 的 抗 原 抗 体 系 统 ， 即 HAVAg和 抗 -HAV 无 论 显 性 感 染 还 是 隐 性 感 染 均 能 诱 生 出 高 效价 抗 -HAV 抗 -HAVIgM阳 性 是 甲 肝 的 确 诊 依 据 IgM型 抗 体 在 感 染 后 仅 持 续 存 于 3-6个 月 IgG型 抗 体 则 可 存 在 多 年 Time course of HAV infection HAV的 其 他 生 物 学 特 性 培 养 特 性 原 代 肝 细 胞 或 恒 河 猴 胚 肾 传 代 株 细 胞 对 HAV敏 感 ， 生 长缓 慢 ， 不 引 起 细 胞 裂 解 抵 抗 力

42、 比 肠 道 病 毒 更 耐 热 ， 60 1h不 被 灭 活 ， 100oC 5分 钟 可灭 活 对 乙 醚 、 酸 处 理 （ pH 3） 均 有 抵 抗 力 氯 消 毒 、 紫 外 线 照 射 、 福 尔 马 林 处 理 均 可 破 坏 其 传 染性 常 见 症 状 流 感 样 症 状 厌 食 恶 心 黄 疸 （ 眼 部 及 皮 肤 呈 黄 色 ） 尿 黄 腹 痛 乏 力 微 生 物 学 检 查 感 染 早 期 可 检 测 血 清 中 的 抗 HAV IgM 流 行 病 学 调 查 可 检 测 抗 HAV IgG 对 已 接 种 甲 肝 疫 苗 者 检 测 中 和 型 抗 HAV抗 体

43、直 接 检 测 抗 原 或 用 分 子 生 物 学 方 法 检 测 病 毒RNA 乙 型 肝 炎 病 毒 （ hepatitis B virus, HBV） HBV-DNA病 原 学 ： HBV属 嗜 肝 DNA病 毒 科 ， 部 分 双 链 DNA， 3200碱基 对 ， 10个 亚 型 ， 序 列 表 明 不 同 亚 型 的 变 异 为10%， 同 一 亚 型 的 变 异 为 2%。 检 测 ： 病 原 体 抗 原 、 抗 体 核 酸 临 床 评 价 ： HBV的 基 因 组 结 构3.2Kb不 完 全 双 链环 状 DNA， 含 4个ORF 可 将 微 孔 板 包 被 有 蛋 白 质 （

44、 如 亲 和 素 或 链 霉 亲和 素 、 抗 Dig-抗 体 、 牛 血 清 白 蛋 白 ） 或 已 知 序列 的 核 苷 酸 ， 此 为 通 用 型 活 化 微 孔 板 ， 任 何 探针 末 端 只 要 含 有 相 应 配 体 或 与 已 知 序 列 互 补 的核 苷 酸 都 可 与 相 应 的 活 化 微 化 板 固 相 化 。 我 们设 计 了 HBV特 异 探 针 ， 其 -端 含 -段 与 通 用 板 已知 序 列 互 补 的 核 苷 酸 ， 引 物 5端 修 饰 有 生 物 素 ，HBV DNA PCR产 物 与 固 相 化 探 针 杂 交 后 ， 即 可用 酶 标 亲 和 素

45、进 行 酶 呈 色 测 定 ， 并 证 实 其 测 定敏 感 度 至 少 高 于 普 通 电 泳 法 1 0 0 倍 。 HBV DNA定 量 测 定 的 临 床 意 义 为 临 床 诊 断 提 供 更 全 面 、 精 确 的 资 料真 实 、 全 面 地 反 映 HBV感 染 、 复 制 及 病 情 变 化 过 程 抗 病 毒 治 疗 的 分 子 水 平 监 测用 HBV DNA的 血 清 浓 度 的 变 化 来 评 价 抗 病 毒 药 物 的 疗效 ：荧光探针1 ：荧光探针2 ：引物：PCR扩增产物 ：Taq酶 扩 增 及 检 测 原 理 a： 变 性 ， 双 链 模 板 裂 解 成 两

46、条 单 链 b： 退 火 ， 引 物 、 荧 光 探 针 分 别 结 合 到 单 链 模 板 的 相 应 位 点 ，探 针 3 端 激 发 基 团 和 探 针 5 端 的 发 光 基 团 紧 靠 在 一 起 ，发 出 640nm的 荧 光 c： 延 伸 ， 随 聚 合 反 应 的 进 行 ， 结 合 在 模 板 上 的 2条 荧 光 探 针被 替 换 下 来 。 d： 一 个 循 环 结 束 ， 生 成 2条 双 链 模 板 阳 性 率 （ ） 上 海瑞 金 医 院 上 海 市传 染 病 医 院 浙 医 大 附 属第 一 医 院 合 计“ 大 三 阳 ” 标 志 100（ 42/42） 100

47、( 38/38） 100 (28/28） 100（ 108/108）“ 小 三 阳 ” 标 志 43.9(18/41） 78.9(30/38） 46.4(13/28） 57.0(61/107）其 它 HBV血 清 学标 志 阳 性 7.5（ 3/40） 38.0(19/50） 23.8（ 5/21） 24.3(27/111）非 乙 肝 肝 病 0（ 0/20） 0（ 0/18） 0（ 0/18） 0（ 0/56） 献 血 员 0（ 0/40） 0（ 0/36） 0（ 0/28） 0（ 0/104） 不 同 临 床 标 本 组 中 的 HBV DNA检 出 率 不 同 临 床 标 本 组 中 H

48、BV DNA阳 性 的 定 量 结 果临 床 组平 均 病 毒 载 量考 核 医 院 “ 大 三 阳 ” 标 志 “ 小 三 阳 ” 标 志瑞 金 医 院 2.83 107 8.80 105上 海 传 染 病 医 院 1.00 10 7 1.85 105浙 一 医 院 1.93 107 1.70 105合 计 1.78 107 6.85 105 电 镜 下 的 HBV Dane 颗 粒 HBV的 小 球 形 颗 粒 HBV的 管 形 颗 粒 HBV的 复 制 HBV的 抗 原 组 成 表 面 抗 原 HBsAg 核 心 抗 原 HBcAg e抗 原 HBeAg 表 面 抗 原 HBsAg存 在

49、 于 三 型 颗 粒 中是 HBV感 染 的 主 要 标 志分 亚 型 （ a, d/y, w/r, adr）产 生 抗 -HBs Pre S1、 Pre S2及 抗 - Pre S1和 抗 - Pre S2 核 心 抗 原 HBcAg仅 存 在 于 Dane颗 粒 中不 易 在 血 液 中 检 出可 在 感 染 的 肝 细 胞 表 面 存 在刺 激 机 体 产 生 抗 HBc（ IgG、 IgM）表 明 病 毒 在 复 制 e抗 原 HBeAg仅 存 在 于 Dane颗 粒 中游 离 存 在 于 血 液 中为 病 毒 复 制 及 强 传 染 性 的 指 标产 生 抗 HBe， 是 预 后 良

50、 好 的 征 象 HBV的 其 它 生 物 学 性 状 培 养 黑 猩 猩 动 物 模 型 、 鸭 动 物 模 型 用 分 子 生 物 学 技 术 的 细 胞 培 养 成 功 抵 抗 力 抵 抗 力 强 于 HAV 对 低 温 干 燥 紫 外 线 耐 受 不 被 70 乙 醇 灭 活 100 10分 钟 可 灭 活 HBV的 致 病 机 制 免 疫 低 下 ： HBsAg无 症 状 携 带 者 病 毒 变 异 ： 逃 逸 免 疫 细 胞 介 导 的 免 疫 损 伤 ： 为 主 免 疫 复 合 物 性 的 免 疫 损 伤 ： 肝 外 损 伤 自 身 免 疫 反 应 的 免 疫 损 伤 ： 肝 特

51、 异 性 脂 蛋 白 抗 原 HBV的 传 染 机 制传 染 源 主 要 传 染 源 是 患 者 或 无 症 状 HBsAg携 带 者 传 播 途 径 密 切 接 触 血 液 及 体 液 母 婴 传 播 不 严 格 集 体 预 防 接 种 、 药 物 注 射 针 刺 、 文 身 等 乙 型 肝 炎 的 特 点我 国 约 有 40%-60%人 群 曾 受 到 过 HBV的 感染表 现 急 性 乙 肝 的 仅 占 0.1%-1%， 亚 临 床 30%-75%， 慢 性 乙 肝 1%-5%， 乙 肝 病 毒 携 带 7%-20%)急 性 乙 肝 如 治 疗 不 彻 底 ， 10%患 者 可 转 为

52、慢性 乙 肝 乙 肝 五 项 及 HBV DNA的 临 床 意 义 HBsAg、 抗 HBsHBeAg、 抗 HBe抗 HBc （ HBcAg）HBV DNA 乙 型 肝 炎 病 毒 抗 原 ,特 别 是 表 面 抗 原 ,在 血 液 中 的浓 度 较 高 ,现 症 HBV感 染 明 确 诊 断 。 仅 抗 HBc单 项 阳 性 ,也 可 在 血 清 中 检 测 到 HBV DNA 乙 型 肝 炎 的 诊 断 往 往 不 需 要 进 行 病 毒 核 酸 的 检 测 。 抗 病 毒 治 疗 时 ,血 清 中 的 病 毒 核 酸 含 量 是 反 映 病 毒数 量 和 复 制 活 跃 程 度 最 可

53、 靠 的 直 接 指 标 、 动 态 观察 药 物 疗 效 的 确 切 指 标 ,特 别 是 对 于 HBeAg阴 性患 者 。 预 防 及 免 疫控 制 传 染 源 ， 切 断 传 播 途 径人 工 自 动 免 疫 ： 疫 苗 （ 血 源 性 、 基 因 工 程 )人 工 被 动 免 疫 ： 高 效 价 人 血 清 球 蛋 白 （ HBIg） 丙 型 肝 炎 病 毒 （ hepatitis C virus） HCV的 生 物 学 性 状40 60nm球 形有 包 膜单 正 链 RNA HCV的 基 因 结 构 丙 型 肝 炎 的 特 点我 国 丙 肝 病 毒 携 带 者 的 比 例 在 2%

54、-5%随 着 年 龄 的 增 长 ， 丙 肝 病 毒 携 带 率 亦 增 高易 感 人 群 感 染 HCV后 ， 慢 性 化 的 比 例 高 达 50%以 上乙 肝 患 者 容 易 重 叠 HCV感 染 HCV的 诊 断 及 预 防检 查 病 毒 RNA检 测 抗 HCV因 HCV免 疫 原 性 不 强 及 变 异 ， 目 前 尚 无 可用 疫 苗 HCV-RNA HCV是 引 起 输 血 后 肝 炎 主 要 致 病 因 子 ， 因 为 血 中 HCV含 量 仅为 HBV的 千 分 之 一 ， 加 之 其 免 疫 学 标 志 仅 有 抗 -HCV一 项 ，至 今 HCV分 离 尚 不 成 功

55、， 其 检 测 较 HBV困 难 得 多 ， 因 此 分 子生 物 学 方 法 在 此 应 用 显 得 格 外 重 要 。 丙 型 肝 炎 基 因 诊 断 及 意 义 抗 HCV(+)伴 ALT， 或 已 排 除 其 他 肝 炎 的 慢 性 肝 炎 ， 可诊 断 为 丙 肝 。 抗 HCV(+)， ALT N。 必 须 检 测 到 HCV-RNA(+)（ 定 性 ） 才诊 断 丙 肝 。 丙 型 肝 炎 基 因 诊 断 及 意 义 抗 HCV(-)， 临 床 怀 疑 丙 肝 。 应 做 HCV-RNA二 次 定 性 或 有一 次 定 量 (+)， 可 诊 断 为 丙 肝 。 常 见 于 免 疫

56、 功 能 低 下 或缺 陷 、 少 数 儿 童 和 老 人 。 急 性 丙 肝 抗 HCV检 出 率 为 50%-90%， 应 检 测 HCV-RNA。 抗 病 毒 药 用 治 疗 必 须 用 定 量 PCR检 测 反 映 药 物 疗 效 。 HCV-RNA病 原 学 ： 单 链 正 股 RNA 病 毒 基 因 组 长 度 10KB， 为 一 个 连续 的 ORF， 包 含 多 个 结 构 区 和 非 结 构 区 的 蛋 白基 因 。HCV变 异 及 其 亚 型 ： 序 列 变 异 率 在 3.2-28%之 间 ,不 同 国 家 和 地 区 分 离 的 毒 株 基 因 差 异 很 大 ,同 一

57、 患 者 在 不 同 时 期 分 离 的 毒 株 也 有 变 异 .HCV基 因 组 分 为 I-IV型 和 若 干 亚 型 . 定 量 检 测 HCVRNA:1.可 用 于 急 性 丙 肝 的 早 期 诊 断 ,在 HCV阳 性 之 前 2.可 作 为 HCV感 染 有 无 传 染 性 的 指 标 3.作 为 抗 病 毒 疗 效 的 指 标 HCV的 生 物 学 性 状40 60nm球 形有 包 膜单 正 链 RNA HCV的 致 病 性 与 免 疫 性传 播 途 径 似 HBV是 引 起 输 血 后 慢 性 肝 炎 和 肝 硬 化 的 主 要 原 因潜 伏 期 ： 4-8周无 症 状 HC

58、V携 带 者 和 慢 性 丙 肝 者 多 见诱 发 肝 外 损 伤 ： 肾 小 球 肾 炎 免 疫 力 不 牢 固 丙 型 肝 炎 的 特 点我 国 丙 肝 病 毒 携 带 者 的 比 例 在 2%-5%随 着 年 龄 的 增 长 ， 丙 肝 病 毒 携 带 率 亦 增 高易 感 人 群 感 染 HCV后 ， 慢 性 化 的 比 例 高 达 50%以 上乙 肝 患 者 容 易 重 叠 HCV感 染 HCV的 诊 断 及 预 防检 查 病 毒 RNA检 测 抗 HCV因 HCV免 疫 原 性 不 强 及 变 异 ， 目 前 尚 无 可用 疫 苗 HCV的 诊 断 及 预 防丙 型 肝 炎 病 毒

59、 ： 中 国 普 通 人 群 抗 抗体 的 阳 性 率 为 3 2%全 世 界 约 1 7亿 人 感 染 了 目 前 除 了 干 扰 素 ( )或 其 与 利 巴 韦林 联 合 应 用 对 部 分 患 者 有 一 定 疗 效疫 苗 研 究 ： 由 于 包 膜 糖 蛋 白 2中 和性 抗 原 位 点 存 在 高 变 区 1( 1)进 展 甚微 抗 原 表 位 ： 线 性 表 位 、 空 间 表 位 。 如 果 以 特异 性 抗 体 对 化 学 合 成 的 随 机 噬 菌 体 多 肽 库 进 行 筛 选 ,则 很 难筛 选 到 与 原 始 的 抗 原 序 列 完 全 一 致 的 序 列 ,而 是

60、获 得 大 量 与原 始 抗 原 序 列 完 全 不 同 的 多 肽 片 段 。 这 种 一 级 结 构 序 列 与原 始 抗 原 不 同 ,又 保 留 其 抗 原 反 应 性 的 抗 原 表 位 ,称 为 模 拟 表位 ( )。 从 其 结 构 而 言 ,模 拟 表 位 多 数 是 构象 表 位 ( ),即 空 间 表 位 。 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 的 建 立 和 应 用 促 进 了 抗 原 模 拟表 位 的 研 究 。 国 外 学 者 应 用 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 筛 选 获 得了 不 同 的 结 构 和 非 结 构 蛋 白 抗 原 的 模 拟 表 位 。 这

61、些研 究 结 果 首 先 在 免 疫 学 理 论 上 阐 明 了 抗 原 抗 体 分 子 之 间 相互 对 应 的 多 样 性 的 问 题 ,同 时 由 于 模 拟 表 位 的 抗 原 性 较 强 ,且具 有 广 谱 性 ,因 此 ,在 新 型 诊 断 试 剂 和 广 谱 疫 苗 的 研 究 中 具 有重 要 的 应 用 前 景 。 HCV的 诊 断 及 预 防丙 型 肝 炎 病 毒 感 染 的 诊 断 ,第 三 代 血 清 学 检测 试 剂 较 好 的 敏 感 性 和 特 异 性 ,但 20%患 者 可 不 出 现 抗 体 ,或 有 的 患 者 抗 体 存 在 时间 可 以 很 长现 行 感

62、 染 ， 早 期 诊 断 因 此 ,核 酸 检 测 在HCV感 染 的 诊 断 中 要 比 HBV感 染 的 诊 断 重要 得 多 。 丁 型 肝 炎 病 毒 （ hepatitis D virus， HDV） HDV是 一 种 缺 陷 病 毒 由 HBsAg构 成 其 外 壳 HDV定 位 于 肝 细 胞 核 内 ， 在 血 液 中 由 HBsAg包 被 ，形 成 35-37nm颗 粒 单 负 链 环 状 RNA HDV的 结 构 Rizzetto于1977年 首 先发 现 ， 又 称 抗 原 35-37nm球 形颗 粒 ； 1.7Kb-ssRNA 含 9个 ORF 丁 型 肝 炎 的 特

63、点 只 能 感 染 HBsAg阳 性 的 病 人 我 国 丁 肝 感 染 率 在 1.6%-5%， 西 南 地 区 感 染 率 高 患 者 可 不 定 期 隔 离 ， 或 隔 离 至 肝 功 能 正 常 ， 或 HBsAg阴 转 。 病 原 学 检 查 为 HDAg、 抗 HD及 HDV-RNA， 持 续 高 滴度 IgG型 抗 HD是 慢 性 HDV感 染 的 主 要 血 清 学 标 志 。 一旦 乙 肝 患 者 感 染 了 HDV， 尤 其 是 在 慢 性 乙 肝 的 基 础 上感 染 ， 容 易 发 展 成 为 重 度 慢 性 乙 肝 、 重 型 肝 炎 ， 甚 至肝 硬 化 。 微 生

64、 物 学 检 查 及 预 防诊 断 为 检 测 抗 -HDHDV-RNA丁 型 肝 炎 传 播 途 经 与 乙 型 肝 炎相 似 。 传 播 途 径 和 防 治 原 则 似HBV。 戊 型 肝 炎 病 毒 （ hepatitis E virus， HEV）球 形 ， 无 包 膜直 径 32 34nm单 正 链 RNA， 3个 ORF两 个 血 清 型 致 病 性 及 免 疫主 要 为 粪 口 途 径 传 播由 胆 汁 经 粪 便 排 出 体 外对 肝 细 胞 的 直 接 损 伤 及 免 疫 病 理 作 用多 表 现 为 急 性 戊 型 肝 炎孕 妇 感 染 常 致 流 产 戊 型 肝 炎 的

65、特 点 与 甲 型 肝 炎 相 比 ， 患 者 黄 疸 前 期 症 状 重 ， 病 程 持 续 时 间 较长 ， 病 死 率 较 高 ， 特 别 是 孕 妇 感 染 HEV后 。 青 壮 年 是 HEV最 喜 欢 攻 击 的 人 群 。 戊 型 肝 炎 分 两 种 ： “ 流 行 性 ” 多 发 生 在 雨 季 和 洪 水 后 ， “ 散 发 性 ” 在 秋 冬 季 呈 现 高 峰 。 传 染 性 强 的 时 间 在 患 者 将 要 出 现 症 状 前 (潜 伏 末 期 )至 发 病初 期 ， 患 者 的 隔 离 期 为 起 病 后 3周 。 尚 末 发 现 有 2次 发 病 者 。 微 生

66、物 学 检 查 及 预 防 检 测 HEV： EM或 IEM 检 测 抗 -HEV IgM HEV RNA 预 防 与 甲 肝 类 似 TLMV病 毒 （ TTV-liked mini virus, TLMV） ：2000年 Takahashi TTV-DNA引 物 作 PCR， 检测 抗 -HCV阳 性 血 浆 ， 10份 TTV DNA滴 度 105拷 贝 /ml， 其 中 3份 （ 分 别 为 CBD231、 279和203） 血 浆 PCR产 物 的 长 度 较 预 期 为 短 （ 约1.2kb） ， 该 病 毒 的 全 长 DNA序 列 较 TTV为 短 ，分 别 为 2 860nt（ CBD231株 ） 、 2 856ntBD279株 ） 和 2 897nt（ CBD203株 ） ， 证 明 是 一 种 新 病 毒 ， 命 名 为 TTV样 微 小 病 毒（ TTV-like mini virus， TLMV） . 准 种 的 研 究 ： 集 中 在 RNA病 毒 （ RNA病 毒 变 异 大 ，复 制 快 ， 短 时 间 内 感 染 个 体 中 即 可 形 成 一 个 彼