《核酸的序列分析》PPT课件

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1、 即 核 酸 DNA分 子 一 级 结 构 的 测 定 ， 是 现 代 分 子 生物 学 一 项 重 要 的 技 术 。 1963年 ， 和 等 人 第 一 次 完 成胰 岛 素 51个 氨 基 酸 的 序 列 测 定 ， 这 在 当 时 来 说 是一 件 了 不 起 的 大 事 。 70年 代 后 期 ， 和等 人 又 建 立 了 核 酸 序 列 测 定 的方 法 ， Sanger双 脱 氧 末 端 终 止 法 和 Maxam-Gilbert化 学 裂 解 法 将 核 酸 序 列 测 定 技 术 推 进 到“ 直 读 ” 阶 段 ， 使 核 酸 序 列 测 定 变 得 远 比 蛋 白 质氨

2、基 酸 序 列 测 定 容 易 ， 这 样 人 们 可 以 通 过 核 酸 序列 和 遗 传 密 码 推 导 出 蛋 白 质 氨 基 酸 的 序 列 。 1、 末 端 终 止 法 2、 化 学 裂 解 法 3、 DNA测 序 自 动 化使 用 特 异 性 引 物与 单 链 模 板 DNA退火 ， 在 DNA聚 合 酶作 用 下 进 行 延 伸反 应 ， 用 ddNTP终止 ， 用 PAGE区 分长 度 仅 相 差 1个 核苷 酸 的 ssDNA， 从而 完 成 测 序 的 方法 。 用 化 学 试 剂 在 A、 G、C、 T处 特 定 的 裂 解DNA片 段 ， 产 生 一 簇各 种 长 度

3、的 短 链 ，经 过 PAGE放 射 自 显影 可 直 读 DNA顺 序 。 类 似 末 端 终 止 法 ， 所不 同 的 是 用 荧 光 染 料标 记 ， 计 算 机 自 动 读出 。优 点 简 便 、 迅 速 、 应用 广 泛 。 不 需 酶 促 反 应 ， 可以 对 寡 核 苷 酸 测 序 。 1、 高 负 荷 ， 1块 胶 可测 16个 样 品 ； 2、 机读 不 需 放 射 自 显 影 ；3、 安 全 不 用 同 位 素 ； 4、 简 单 迅 速 。 (dideoxy-termination sequencing) 原 理 ： 双 脱 氧 （ 2， 3） -核 苷 酸 可 以 象 2

4、-脱 氧 核 苷 酸 那 样直 接 掺 入 新 合 成 的 DNA链 中 ， 但 因 3 端 不 具 OH基 ， DNA链 合 成 至此 中 断 。 由 于 双 脱 氧 核 苷 酸 在 每 个 DNA分 子 中 掺 入 的 位 置 不 同 ， 故可 根 据 不 同 长 度 的 DNA片 段 测 定 出 核 苷 酸 序 列 。 不 能 和 下 一 个 核 苷 酸通 过 磷 酸 二 酯 键 连 接起 来 测 序 过 程 : 1.模 板 与 引 物 杂 交 2.引 物 的 延 长 和 合 成 阻 断 四 个 试 管 分 别 加 入 DNA聚 合 酶 dNTP 标 记 底 物 终 止 剂 不 同 dd

5、A ddG ddC ddT 四 个 试 管 中 所 有 产 物 是 一 系 列 长 度 只 差 一 个核 苷 酸 的 聚 合 链 3.电 泳 4.放 射 自 显 影 得 到 直 读 图 象 5-AACTGCTG-3与 引 物 退 火5-AACTGCTG-3 5 dNTPddATPdNTPddCTPdNTPddGTPdNTPddTTP 5-AACTGCTG-3 AC-55-AACTGCTG-3 C-55-AACTGCTG-3 GAC-55-AACTGCTG-3 TGACGAC-5 5-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 GACGAC-

6、55-AACTGCTG-3 TTGACGAC-5 2+5 1+43+67+8dddd dddd dd dddddd AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53 添 加 DNA polymerase所 有 4 dNTPs其 中 一 种 标 记 的 ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在 四 个 不 同 的 反 应 管 中 各 只 包 含 一 种 ddNTP. AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA

7、reaction每 一 管 中 的 复 制 的 序 列 都 停 留 在 ddNTPs 处5 反 应 终 止 后 ， 四 个 反 应 管 中 的 反 应 混 合 液 分 别 进 行 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶电 泳 分 离 .这 四 个 反 应 管 中 延 伸 的 寡 核 苷 酸 仅 相 差 一 个 碱 基 .电 泳 结 构 通 过 显 色 指 示 . T C G A3CCTT TAGCT5 法 是 Maxam和 Gilbert等 人 1977年 创建 的 ， 用 来 测 定 DNA序 列 。 化 学 法 是 用 化 学 试 剂 在A、 G、 C、 T处 特 定 地 裂 解 DNA片 段 ， 产

8、 生 一 簇 各 种长 度 的 短 链 （ 等 差 数 列 n=1） ， 经 过 PAGE和 放 射自 显 影 后 ， 可 以 直 接 读 出 DNA的 顺 序 。 1、 用 放 射 性 核 素 标 记 待 测 DNA一 侧 末 端2、 将 标 记 DNA分 为 G、 A+G、 C+T、 C 4个 反 应 体 系3、 用 不 同 的 化 学 试 剂 处 理 不 同 反 应 体 系 ， 随 机 断裂 DNA片 段 某 种 碱 基 中 的 任 何 一 个 ， 产 生 一 组 一端 为 放 射 线 标 记 的 末 端 ， 另 一 端 为 不 同 大 小 的DNA片 段 的 混 合 物4、 电 泳 分

9、 离 ， 放 射 自 显 影 得 到 互 相 错 落 的 梯 形 图谱 ， 即 可 读 出 DNA序 列 反 应 体 系 碱 基 修 饰 试 剂 碱 基 修 饰 反 应 主 链 断 裂 试 剂 断 裂 点G 硫 酸 二 甲 酯 鸟 嘌 呤 甲 基 化 六 氢 吡 啶 GG+A 甲 酸 脱 嘌 呤 作 用 六 氢 吡 啶 G和 AC+T 肼 嘧 啶 开 环 六 氢 吡 啶 C和 TC 肼 （ 加 盐 ） 胞 嘧 啶 开 环 六 氢 吡 啶 C 每 组 测 序 图 谱 为 4条 垂 直 的 阶 梯 带 ， 该 片 从 胶 底 部 一个 个 向 顶 部 读 ， G+A和 C+T两 列 中 含 有 所

10、 有 相 差 一 个 碱 基 的DNA片 段 。 如 果 G+A中 出 现 1条 带 就 看 G列 中 是 否 有 同 样 大 小的 带 ， 若 有 即 为 G碱 基 ， 无 则 为 A碱 基 ； 同 理 ， C+T中 则 检查 C列 中 有 无 同 样 大 小 条 带 ， 有 即 为 C， 无 则 为 T。 从 单 块 凝 胶 上 能 得 到 可 靠 序 列 数 量 约 为 200-300bp以 内 优 点 ： 1、 所 测 序 列 直 接 来 源 于 所 测 DNA ， 避 免 了 DNA 复 制 中 错 误 dNTP 的 掺 入 。 2、 可 直 接 对 合 成 的 寡 核 苷 酸 测

11、序 ， 可 分 析 甲基 化 修 饰 等 ， 以 及 研 究 DNA 的 二 级 结 构 及 蛋白 质 与 DNA 的 相 互 作 用 等 。 缺 点 ： 操 作 复 杂 ， 读 序 困 难 。 特 点原 理 同 末 端 终 止 法标 记 物 为 荧 光 染 料激 光 扫 描 自 动 测 序结 果 清 晰 、 准 确 、 分 辨 率 高测 序 速 度 快 200bp/h 1、 标 记 物 不 同 ： 手 工 测 序 采 用 放 射 性 核 素 标 记 ， 而 自 动测 序 采 用 4种 荧 光 染 料 分 别 标 记 ddNTP或 标 记 引 物2、 加 样 方 式 不 同 ： 手 工 测 序

12、 ， 一 个 样 品 的 4个 测 序 反 应物 分 别 在 不 同 泳 道 进 行 ， 而 自 动 测 序 可 在 一 个 泳 道 内电 泳 ， 提 高 电 泳 分 析 的 效 率3、 检 测 手 段 不 同 ： 手 工 测 序 采 用 放 射 自 显 影 ， 从 4种 寡聚 核 苷 酸 的 梯 子 形 图 谱 中 读 出 DNA序 列 ， 而 自 动 测 序则 采 用 激 光 扫 描 器 同 步 扫 描 ， 计 算 机 进 行 阅 读 和 编 辑 DNA序 列 测 定 的 自 动 化 1. DNA测 序 步 骤 与 自 动 化 1） 模 板 制 备 可 自 动 化 2） 定 序 反 应 可

13、 自 动 化 3） 凝 胶 电 泳 自 动 化 有 一 定 困 难 ： 制 胶 ， 点 样 ， 电 泳 ， 凝 胶 干燥 ， 放 射 自 显 影 。 4） 核 苷 酸 序 列 阅 读 与 计 算 机 输 入 可 自 动 化 2.自 动 测 序 仪 Conney等 人 于 1987年 设 计 了 不 同 荧 光 染 料 标 记 引 物 ， 然 后做 链 终 止 测 序 ， 用 激 光 扫 描 阅 读 序 列 。 红 色 引 物 +T反 应 系 统 （ 引 物 +DNA+dNTP+ddTTP） 黄 色 引 物 +G 反 应 系 统 （ 引 物 +DNA+dNTP+ddG TP） 绿 色 引 物 +

14、A反 应 系 统 （ 引 物 +DNA+dNTP+ddATP） 兰 色 引 物 +C反 应 系 统 （ 引 物 +DNA+dNTP+ddCTP） 目 前 市 场 上 已 经 有 各 种 型 号 的DNA自 动 测 序 仪 可 供 选 购 。 “分子生物学研究方法”思考题：1、 常 用 的 核 酸 的 凝 胶 电 泳 是 哪 两 种 ？ 它 们 分 辨DNA片 段 的 范 围 有 何 不 同 ？2、 电 泳 操 作 的 基 本 程 序 有 哪 些 ？3、 核 酸 的 分 子 杂 交 的 概 念 ？ Southern 印 迹 法 、Northern 印 迹 法 和 Western 印 迹 法 的 检 测 对 象分 别 是 什 么 ？4、 什 么 叫 探 针 （ Probe)？5、 PCR定 义 ？ 简 述 聚 合 酶 链 式 反 应 的 基 本 原 理 ？6、 核 酸 测 序 的 常 用 方 法 有 哪 些 ？