青霉素发酵操作手册B5

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1、青霉素发酵使用手册东方仿再北京东方仿真技术有限公司二零零五年八月、背景知识1、菌种介绍青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉(Penicillum chrysogenum)、点 青霉(Penicillum nototum)等都能大量产生青霉素。青霉素的发现和大规模地生产、应用， 不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如 像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。此外，有的青霉菌还用于生产灰黄 霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。 1981 年报导，疠孢青霉是纤维素

2、酶 的新来源，它能分解棉花纤维。2、发酵工艺菌种鞄子制备(包括罐内)种子制备发酵发酵液预处理提取及精制成品检验成品包装本仿真软件针对其中发酵过程 进行了仿真模拟。3、青霉素的单位目前国际上青霉素活性单位表示方法有两种：一是指定单位(unit)；二是活性质量 (yg),最早为青霉素规定的指定单位是：50mL肉汤培养基中恰能抑制标准金葡萄菌生 长的青霉素量为一个青霉素单位。在以后，证明了一个青霉素单位相当于0.6昭青霉素 钠。因此青霉素的质量单位为: 0.6yg 青霉素钠等于 1 个青霉素单位。由此， 1mg 青霉素 钠等于1670个青霉素单位(unit)。二、反应机理介绍菌种介绍 :青霉是产生青

3、霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂 的柑桔皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉(Penicillum chrysogenum)、点 青霉(Penicillum nototum)等都能大量产生青霉素。青霉素的发现和大规模地生产、应用， 不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如 像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。此外，有的青霉菌还用于生产灰黄 霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。 1981 年报导，疠孢青霉是纤维素酶 的新来源，它能分解棉花纤维。青霉菌菌丝与曲霉相似，但没有足细胞。分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊

4、，经多次 分枝，产生几轮对称或不对称小梗，小梗顶端产生成串的青色分生孢子。孢子穗形如扫 帚，美国研究者Thom按照分生抱子梗的形态，把青霉属分为四组。即一轮青霉：分生 孢子梗只有一轮分枝；二轮青霉：分生了梗产生两轮分枝；多轮青霉；分生孢子梗具三 轮以上分枝；不对称青霉：分生抱子梗上，不对称地产生或多或少轮层的分枝。抱子穗 的形态构造是分类鉴定的重要依据。青霉属中大多数种的有性阶段至今还不知道。菌种的保藏 微生物受外界环境的影响会经常地发生小机率的变异，这种变异可能造成菌种生产 性状的劣化或自身死亡。生产菌株的获得是一项艰苦的工作，要使菌种在生产中长期保 持优良的生产性状就必须设法减少菌种的退化

5、和死亡，即做好保藏工作。菌种的保藏具有下列目的： 保持菌种的活力 保持菌种的优良特性 菌种保藏的基本原理 菌种保藏是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌的代谢活动处于不活泼的状 态。保藏时，先挑选优良的纯种，最好是选取它们的休眠体（孢子、芽孢等），然后创 造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等），以降低菌 种代谢活动的速度达到延长保存期的目的。一种较好的保藏方法，首先要求能较长期地 保存原有菌种的优良特性，但也要考虑方法本身的经济简便。至于具体采用哪种方法， 要根据菌种特性及具体条件来决定。菌种保藏的方法菌种保藏的方法很多，原理也大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯

6、种，最好采 用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，创造一个最有利休眠的环境条件，如 干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂等。一种良好的保藏方法，首先应 能保持原种的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和简便性。菌种保藏常用方法 有： 斜面菌种低温保藏法： 利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。把斜面菌种、固体穿 刺培养物或菌悬液等，直接放入45C冰箱中。保藏时间一般不超过3个月，到时必 须进行移接传代，再放回冰箱。 砂土管保藏法： 将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。若把砂土管放在低温或抽气后密封，效果更佳。此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期

7、110 年。 甘油封藏法：向培养好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发，又能使菌种与空气隔绝。保藏期12 年。 真空冷冻干燥法：是目前比较理想的一种方法。在低于-15C下，快速将细胞冻结，并保持细胞完 整，然后在真空中使水分升华致干。在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不 易发生变异，故可长时间保存，一般为510年，最多可达15年之久。此法兼备了低 温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的 设备。菌种保藏的注意事项 在整个保存处理过程中要防止杂菌污染，并一定要做无菌检查。 保藏所用的菌种要在新鲜

8、的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长。 斜面低温保藏用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易 产生酸，或使代谢活动加强，影响保藏时间。 保藏过程中要防止菌种退化现象的发生，及时采用有效方法复壮。传代次数 过多，容易退化。 菌种制备过程是保持菌种优良特性的一个重要环节。 使用保藏菌种时，需要将菌种接种在保藏前所使用的同一培养基上，才能收 到较好的保藏效果。菌种的自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过 程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能 下降；另一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的

9、工作人员， 就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过 程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵 生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但 自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。诱变育种诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求 的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速 度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包 括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个

10、部分。出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离 出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中购买。 选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。为了使菌体与诱变剂均匀接触，通常要将出发菌种制成细胞（或孢子）悬浮液，再 进行诱变处理。诱变剂有物理诱变剂（如紫外线、X射线、Y射线、快中子）、化学诱 变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥）等。在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、 处理时间等，都要视具体的情况和条件，并经过预备实验后才能确定。菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类 型呢？一般要经过

11、初筛和复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例 说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个 菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后 测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种，再 进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个 摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行13次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小 型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。杂交育种青霉菌杂交的过程实际上也是青霉菌准性循环的过程。青霉菌的杂交就是利用准性循环的过程中的基因重组和分离，把

12、两株具有不同优点的菌种结合成一株新的菌种的过程。在大部分霉菌中，基因重组都需要有性阶段，而青霉菌属于不完全菌纲，缺乏有性 阶段，在无性繁殖过程中，它的营养菌丝（体细胞）也能够发生像有性繁殖一样的遗传 现象，即两个不同来源的细胞核完全融合，染色体重新组合，以及同源染色体相互交换， 这也就是准性循环过程中的基因重组与分离。青霉菌杂交育种的方法如下： 选择直接亲本 异核体的形成 杂合二倍体的形成 体细胞交换、分离以及单倍化原生质体融合 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环 境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条 件下混合，由聚

13、乙二醇（PEG）助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两 套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重 组体。原生质体融合技术具有7 个方面的优点： 杂交频率较高 受接合型或致育性的限制较小 重组体种类较多 遗传物质的传递更为完整 可获得性状优良的重组体 可提高育种效率 可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株孢子的制备:这是发酵工序的开端，是一个重要环节。抗生素产量和成品质量同菌种性能以及同 孢子和种子的情况有密切关系。生产用的孢子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定 的才能用来制备种子孢子的制备工艺 保藏在砂土管或冷冻管中的菌种，在接入种子罐以前，需经过

14、扩大繁殖才能获得接 种所需要的孢子数。扩大繁殖的方法有两种： 孢子进罐法： 即在培养基上生长繁殖成大量的孢子，此法是目前生产抗生素孢子常用的方法。 优点：工艺过程简单，并且一次可以制备大量的孢子，易于保存，不易染菌。缺点：砂 土管或冷冻管用量太大。 摇瓶菌丝进罐法： 即先将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养基中，使其生长繁殖成菌丝， 再转入种子罐内，此法适用于生长发育缓慢的放线菌。优点：可以节约砂土管或冷冻管 用量。缺点：菌丝不宜保藏，批号更换频繁，批与批之间的差异容易造成生产上的波动； 孢子制备工艺时间拖长，容易染菌。种子的制备: 这一过程的目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以

15、便接种到发酵罐当 中去。种子制备有的从摇瓶培养开始，再接入种子罐进行逐级扩大培养；有的直接从种 子罐进行逐级扩大培养。详细介绍请参见“种子制备和菌种保藏”部分。种子的制备工艺 种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程。种子制备所使用 的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。种子制备的工艺过程，因抗生素的品种不同而异，一般可分为一级种子制备、二级 种子制备和三级种子制备。孢子瓶中的孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐 中，经过培养后孢子即发芽繁殖成大量的菌丝，然后再把菌丝转入发酵罐内，进行抗生 素的生物合成，这样的种子称为一级种子；利用一级种子进行发酵的过程，

16、称为二级发 酵。如果将制备的一级种子，接入到体积较大的种子罐内，经过培养繁殖成更多的菌丝， 然后再转入发酵罐内进行抗生素的生物合成，这样的种子称为二级种子；使用二级种子 的发酵过程，称为三级发酵。青霉素的发酵就是三级发酵。同样，如果使用三级种子的 发酵过程，称为四级发酵。发酵:这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始前，有关设备和 培养基必须先经过灭菌，后接入种子。接种量一般为520%。发酵周期一般为45天， 但也有少于 24 小时，或长达二周以上的。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持 一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生 素产生情

17、况和有无杂菌污染。详细内容请参见“发酵的过程控制”和“青霉素的发酵工 艺”。发酵培养基的组成在青霉素的发酵过程中，培养基组成是一个极重要的因素，培养基由碳源、氮源、 无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部分组成。现将它们对青霉素发酵的影响作详 细介绍，请到左边的导航栏里选择查看青霉素发酵培养基的内容。培养基和发酵设备的灭菌原理及方法 “灭菌”指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质 的技术或工艺流程。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体 杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介

18、质过滤除菌等几种。湿热蒸汽灭菌湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强有强大的穿透力， 在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物 在短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。用蒸 汽加热的方法对培养基灭菌的要求是：既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营养成 分的破坏。灭菌时间和灭菌温度对灭菌程度和营养成分的破坏都有影响，必须采用适当 的灭菌时间和灭菌温度。在实际的青霉素生产中采用了湿热蒸汽灭菌中的“实罐灭菌（即分批灭菌）法”和 “连续灭菌法”。空气过滤除菌青霉素生产菌为好气菌，发酵过程中必需通入无菌空气来满足产生

19、菌生理上的需 要。如果空气除菌不当或除菌设备失效，就会引起大面积的染菌，造成极大的损失。因 此，空气除菌是抗生素发酵生产极其重要的一环。空气是一种气态物质的混合物，除氧和氮外，还含有惰性气体、二氧化碳和水蒸 气等。此外，空气中还有悬浮的灰尘存在，这些灰尘中由构成地壳的无机物质微粒、烟 灰、植物的花粉，以及种类繁多的细菌和其它微生物所组成。空气过滤除菌是抗生素发酵获得无菌空气的主要方法。防止染菌的要点 染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。影响染菌的因素很 多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。请到左边的 导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。空气系统

20、的要求 防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气 过滤器失效。提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过 滤着手。防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏 水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。蒸汽系统的要求 重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动， 保证生产时所用的蒸汽压力在3035千帕以上。 连续灭菌设备 连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于 控制温度。 发酵罐 发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”

21、。凡与物料、空 气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。 无菌室用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。工艺操作的要求空罐准备 发酵罐放罐后应当进行全面地检查和清洗。空罐灭菌 注意先将罐内的空气排尽，灭菌时要保持蒸汽畅通，使有关阀门、管道彻底灭菌。 实罐灭菌配制培养基时要防止结块，灭菌时要保证各路进气畅通及罐内培养基沸腾激 烈，要控制好温度和压力，防止泡沫升至罐顶。 连续灭菌 料液进入连消塔前必须先预热，连续灭菌设备应定期清理和维修。 补料发酵过程中加入发酵罐的物料一定要保证无菌才能进罐。 种子和无菌实验严格按相应要求进行操作。无菌检查和染菌后的处理方法在发酵工业中，谷氨酸、柠檬酸、液体

22、曲酶制剂、抗菌素、酵母扩培等都属于机 械搅拌通风发酵，其发酵要求纯种培养。微生物在繁殖及耗氧发酵过程中，常常发生不 同程度的杂菌污染现象。所谓杂菌，是指培养液或发酵液中侵入了有碍生产的其它微生 物。杂菌的污染将消耗大量的营养物质以及各种代谢产物。轻则破坏预定发酵的正常进 行，使发酵产品的效价降低，产量下降；重则使发酵彻底失败，造成倒罐、甚至停产等 严重事故。染菌直接影响产量、质量和企业的经济效益，影响企业的生存和发展。下面 介绍如何检查和处理染菌的方法，请到左边的导航栏里选择查看详细内容。无菌检查 无菌检查试验的方法：双碟培养、斜面培养、肉汤培养、镜检等。其中又以双碟培 养和肉汤培养为主。双碟

23、培养法操作要点：发酵罐发酵过程中每隔8小时，用空白试管取样515毫升 左右，于37C培养6小时后划碟，双碟放置37C培养。24小时内的双碟，每隔23 小时在灯光下检查一次，观察有无杂菌菌落生长。 2448 小时的双碟，每天检查一次， 以防止生长缓慢的杂菌漏检。斜面或肉汤培养法：直接用酚红肉汤或直接用斜面取样培养。但也有先用空白无菌 试管取样，再接种于肉汤或斜面培养基的。当发现某罐，某时间取样的样品在双碟上有杂菌时，即应复核紧接该样品前、后取 样的两样品，若复核结果仅是该样品有杂菌、而其前后两样品均无杂菌，说明是假染菌 （操作误差），若复核结果发现两个样品有杂菌，菌型又相同，可初步判定染菌。如果

24、 第三个样品又出现杂菌，且菌型相同，那肯定是染菌了。污染杂菌的处理种子罐染菌后，罐内的种子不能再进入发酵罐中，可以从备用种子中，选择生长正 常无染菌的种子移入发酵罐。如无备用种子，可选择一个适当培养龄的发酵罐内的培养 物作种子，移入新鲜培养基中。发酵罐前期染菌，先停止运转，按需要放掉部分料液，补入新鲜料液，对培养基重 新灭菌后再运转。发酵罐中后期染菌，可加入适当对发酵无影响的杀菌剂，或把高单位的后期发酵液 压一小部分到染菌罐中，抑制杂菌的生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速度。如 染菌罐 pH 下降很快，糖要少补或缓补，氨水可适当增加。染菌后的发酵罐，灭菌前用甲醛蒸汽将罐体及其附属设备灭菌一

25、次。染菌后的种子罐，灭菌前放水加温至100C，加水量至少占罐体的2/3。染噬菌体后的处理抗生素生产中出现噬菌体往往造成倒罐。当噬菌体大量发生时，不得不停产。噬 菌体染菌后的具体现象是：菌丝长得稠厚的发酵液数小时后迅速变稀，泡沫增多，早期 镜检可见菌丝染色不均匀，在平板上出现典型的噬菌斑。防止噬菌体感染的方法 向车间周围环境喷洒甲醛溶液或往下水口倾倒甲醛溶液。 选育抗噬菌体菌体，使用抗菌素防止染菌，这也是解决噬菌体感染最积极的办法。 加强车间环境中噬菌体、噬菌斑的监测，改善环境卫生条件。因为噬菌体的专一性较强，发酵过程中噬菌体感染后，应暂时停产消毒，并调换生产菌种。碳源控制青霉菌能利用多种碳源，

26、如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然 油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比较好的碳源，但必须控制其 加入的浓度，因为葡萄糖易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响 青霉素的合成，所以可以采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素 G 的侧链 前体。菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用， 即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要取决于培养条件以及 所用菌种的特性。通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯 乙酸的毒性取决

27、于培养基的 pH 和前体的浓度。碱性时，苯乙酰胺有毒；酸性时，苯乙 酸毒性较大；中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于 0.1%时，青霉素的 生物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速率随培养基pH上升而增加。年幼的菌丝不 氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。随着菌龄的增大，氧化能力逐渐增加。培养 基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以 保持前体的供应速率略大于生物合成的需要。pH 控制在青霉素发酵过程中，pH是通过下列

28、手段控制的：如pH过高，则添加糖、硫酸或 无机氮源；若pH过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。另外, 也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH维持在6.87.2，以提高青霉素产量。温度控制青霉菌生长的适宜温度为30C，而分泌青霉素的适宜温度是20C左右，因此生产 上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要。一般一级种子的培养温度控制在 271C左右；二级种子的培养温度控制在251C左右；发酵前期和中期的温度控制 在26C左右；发酵后期的温度控制在24C左右。补料控制发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及pH外，补加氮源也可提高发酵单位。经试 验证实：若在发酵 6070h 开

29、始分次补加硫酸铵，则在 90h 后菌丝含氮量几乎不下降， 维持在 6%7%，且 60%70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳 量近30p 1/ （mg菌丝h）,抗生素产率为最高水平的30%40%；而不加硫酸铵的对 照罐，在发酵中期菌丝含氮量为 7%，以后逐级下降。至发酵结束时为4%。发酵结束时 呼吸强度降至二氧化碳量为16p 1/ （mg菌丝h），且抗生素产量下降至零，总产量仅 为试验罐的 1/2。因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源 也是有效的措施。在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂和少量可溶性高分子化合物也能增加青 霉素的产量。铁离子的影响三价铁离子

30、对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液中铁离子含量超过 3040p g/ml,则发酵单位增长缓慢。铁离子对产黄青霉绿色抱子合成青霉素的影响见下表。因此铁罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使铁离子含量控制 在30p g/ml以下。发酵菌种介绍 发酵所采用的是一种适合深层培养的产黄青霉菌高产菌株,有关青霉菌的描述请参 见生产概况中的“菌种”。菌落外观：有的平坦,有的褶皱较多。菌落形态：一般都是圆形的,其边缘或整齐、或呈锯齿状、或成扇形。 在沉没培养条件下,青霉素产生菌细胞的生长发育过程发生明显的变化,其生长特 征可以划分为六个生长期：第I期：分生抱子发芽。抱子先膨胀，再形成小

31、的芽管，原生质未分化，具有小空 胞。第II期：菌丝增殖，原生质的嗜碱性很强，在II期末有类脂肪小颗粒。第III期：形成脂肪粒，积累贮藏物，没有空胞，原生质嗜碱性仍强。第W期：脂肪粒减少，形成小空胞，原生质嗜碱性减弱。第V期：形成大的空胞，其中含有一个或数个中型红染色的大颗粒，脂肪粒消失。第W期：细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。上述六个生长期中IW期初是年轻菌丝，一般不合成青霉素或合成较少，适于作 发酵罐的种子；WW期合成青霉素的能力最强。发酵工艺包含如下几个过程： 抱子的斜面培养 抱子的继续培养 一级种子的培养 二级种子的培养 种子发酵及其控制其中，对发酵的种子有如下要求：菌丝长稠，菌

32、丝团很少， 菌丝粗壮，有中 小空胞，处在第IIIW期。发酵液的预处理发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的高价无机离子（如钙、镁、铁离子等） 和蛋白质。因此要先将这些杂质除去。对于钙离子，通常加草酸使之形成草酸钙沉淀；对于镁离子，通常加三聚磷酸钠可 与镁离子形成可溶性络合物；对于铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。蛋白质胶体的去除可调节pH到其等电点，或者采用加热、加入明矶或食盐等无机盐，或者采用蛋白质絮凝剂来除去。 单级萃取单级萃取只包括一个混合器和一个分离器。料液F和溶剂S加入混合器中经接触达到平衡后，用分离器分离得到萃取液L和萃余液R。 多级错流萃取料液经萃取后，萃余液再与新鲜萃取

33、剂接触，再进行萃取。第一级的萃余液进 入第二级作为料液，并加入新鲜萃取剂进行萃取。第二级的萃余液再作为第三级的料液， 也同样用新鲜萃取剂进行萃取。此法特点在于每级中都加溶媒，故溶媒消耗量大，而得 到的萃取液平均浓度很稀，但萃取较完全。 多级逆流萃取在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并 逐级向前一级移动。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。在逆 流萃取中，只在最后一级加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂消耗量较少，因而萃 取液平均浓度较高。发酵罐的特点通用发酵罐是一个长筒形的密闭容器，具有椭圆形或碟形的盖或底。为了防止染菌， 管内壁应光滑无死角，

34、要保证焊接质量，至少可以承受4Kg/cm2水压。搅拌装置在发酵罐内设置机械搅拌有利于液体本身的混合和气液及液固间的混合，以及 质量和热量的传递，特别对氧的溶解具有重要的意义，因为它可以加强气液间的湍动， 增加气液接触面积和延长气液接触时间。消沫装置发酵过程中由于发酵液中含有大量的蛋白质，在强烈的通气搅拌情况下将产生大量 的泡沫。严重的泡沫将导致发酵液的外溢和增加污染的机会。需加入消沫剂的方法去除， 泡沫的机械性强度较差和泡沫较小时采用机械消沫装置消沫也有一定的作用。提取和精制:发酵结束后，发酵液即送去提取和精制，利用一些物理化学方法将抗生素提纯为合 乎药典规定的成品。通常在提取前，需先进行过滤

35、，将菌丝和滤液分开。如抗生素分泌 在液体中，则需将滤液进行预处理，以利于以后的提取；如抗生素分泌在菌丝中，则通 常先用有机溶剂萃取。详细内容请见“青霉素的化学提炼”。提炼工艺概论 化学提取和精制的目的：从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。由于发酵液中抗生素浓度很低，仅0.14.5%左右，而杂质浓度比抗生素的高几十 倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重 要的工作。发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、 预处理需要加入的杂质等。在提炼过程中要遵循下面四个原则： 时间短 温度低 pH适中 勤清洗消毒各种提取方法 吸

36、附法 利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。常用的吸附剂 有活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂等。 溶媒萃取法 当抗生素以不同的化学状态（游离或成盐状态）存在时，在水及水不互溶的溶媒 中有不同的溶解度。利用溶解度的差异来进行提取的方法就是溶媒萃取法。 离子交换法 利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素吸附上去， 然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。 沉淀法 是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法。各种精制方法色谱法 多级萃取或吸附方法都属于色谱法。分子筛去盐 利用分子筛的方法可将无机杂质从抗生素溶液中分出。 脱色和去热源质利

37、用活性炭可以将各种色素和热源质同时除去。 沉淀、结晶和重结晶利用抗生素能形成某些不溶性盐类，而自溶液中沉淀析出，然后再将沉淀转化成品鉴定:成品鉴定是根据药典的要求逐项进行分析，包括效价鉴定、毒性试验、无菌检查、 热源质试验、水分测定、水溶液酸碱度及混浊度测定、结晶颗粒的色泽及大小的测定等 对于药典上未有规定的新抗生素，则可参照相近抗生素，按经验规定一些指标。成品分装:抗生素产品一般分装为大包装的原料药，以供制剂厂进行小包装或制剂加工。也有 一些抗生素工厂在无菌条件下用自动分装机进行小瓶分装。I乙F寻坠工工 三四、主要工艺指标编号指标推荐值备注1糖浓度5kg/m3初始值2氨氮含量0.250.3k

38、g/m33PH值前期 6. 8-7. 2后期 6.4-6.5使发酵液pH维持在6.87.2,以提咼青霉素产量。4温度24-26 C发酵前期和中期的温度控制 在26C左右；发酵后期的温 度控制在24C左右。5搅拌转速150-250rpm200rpm6溶氧浓度30%7前体浓度1kg/m3五、主要设备列表及仿真操作设备编号名称备注1发酵罐2进料泵加入基质3空气系统含消毒、冷却、过滤。4计量泵一（加氨水）操作时有开关、调节及入罐处泵门三处要操作5计量泵二（加前体）同上6计量泵二（加消沫剂）同上7加菌种按钮点击后自动按比例增加一次菌种六、操作规程（一）正常发酵正常发酵（过程）1、进料（基质），开备料泵分

39、值： 10.002、开备料阀分值： 10.003、备料后（罐重100000KG ）关备料阀分值： 10.004、关备料泵分值： 10.005、开搅拌器分值： 10.006、设置搅拌转速为200 转分值： 10.007、开动空气系统，通风分值： 10.008、开通风阀分值： 10.009、开排气阀分值： 10.0010 、投加菌种分值： 10.0011 、补糖，开补糖阀分值： 10.0012 、补氮，开加硫铵阀分值： 10.0013、开冷却水，维持温度在25C分值： 10.0014、 PH 值保持在一定范围内分值： 10.0015、前体超过1KG/M3 （扣分步骤，出现则扣分）分值：-10.00

40、出料1 、停止进空气分值： 10.002、停搅拌分值： 10.003、关闭所有进料，开阀出料分值：10.00（二）发酵过程中PH值低调节PH值开大氨水流量分值：10.00PH 值指标分值：20.00（三）发酵过程中 PH 值高关闭进氨水分值：10.00开大补糖阀分值：10.00调节PH值分值：20.00（四）发酵过程中溶解氧低开大进空气阀 V02分值：10.00调节溶解氧大于 30%分值：20.00（五）残糖浓度低开加糖阀补糖分值：10.00（六）发酵过程中温度高开通冷却水进水冷却分值：10.00温度指标分值：20.00（七）泡沫高添加消泡剂分值：10.00泡沫高度降低到 30CM分值：10.00七、主要操作画面