酪蛋白多肽的制备和色谱分离方法

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1、酪蛋白多肽的制备和色谱分离方法蔡焕新;殷宝茹;姚萍【摘 要】为了得到低成本的多肽,本文利用胰蛋白酶对酪蛋白进行了充分的酶解.采 用分析级反相高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(RP-HPLC/ESI-MS)分析了酶解 产物各组分的组成,并通过改变流动相的梯度洗脱程序,优化了分析级色谱条件以充 分分离相对含量较高的多肽组分;将优化的分析级色谱条件直接放大到制备级RP-HPLC中，在程序控制下通过紫外吸收信号结合ESI-MS信号共同引导实现了多肽的 全自动化分离和收集.整个过程方便快捷,经过这样一个单一的分离步骤,得到了多个 纯度较高的多肽.除此之外,本文还考察了流动相的酸碱性、柱上样量等因素对该体

2、 系制备级分离的影响,并对一次分离中分辨率不好的亲水性多肽混合物进行了二次 分离,得到了多个新的多肽.本文建立的多肽制备方法为多肽和多肽材料的广泛应用 提供了一种选择.期刊名称】色谱年(卷),期】2010(028)007【总页数】7页(P637-643) 【关键词】 高效液相色谱-电喷雾质谱法;制备级色谱;多肽;酪蛋白;蛋白酶;低成本【作 者】 蔡焕新;殷宝茹;姚萍【作者单位】 复旦大学聚合物分子工程教育部重点实验室,高分子科学系,上海,200433;复旦大学聚合物分子工程教育部重点实验室,高分子科学系,上海,200433;复旦大学聚合物分子工程教育部重点实验室,高分子科学系,上海,20043

3、3【正文语种】中文【中图分类】O658多肽作为一种生物分子,由于结构相对简单,且具有良好的生物相容性、生物降解性 和生物活性等特点,已经成为生物医学、纳米科技、材料科学等众多学科的研究热 点。但人工合成多肽较高的成本使多肽作为材料应用受到了很大的限制。 近几十年来,通过蛋白酶解寻找和表征具有特定功能的多肽片段的方法受到了广泛 的关注1-7。然而,分离和鉴定这些酶解后所产生的多肽组分一直是该方法所面临 的两大问题。一般来说,酶解产物需经过多步粗分离和液相色谱分离才能得到纯度 较高的微量单一组分,然后通过质谱等方法鉴定组分的多肽序列。这样的复杂过程 大大降低了通过蛋白酶解制备多肽的效率。M ink

4、iew icz等8采用制备级反相高 效液相色谱(RP-HPLC)(C18色谱分离柱,20mmx250mm)对k-酪蛋白经胰凝乳蛋 白酶降解后的产物进行制备级分离，一次上样量为8 m g,并应用高效凝胶渗透色谱、 核磁及质谱对分离得到的组分进行了分析，得到了源自K-酪蛋白的长链多肽。Adam son等9用胰液素对酪蛋白进行了降解，通过CaCl2水溶液与乙醇混合物对 磷酸化多肽片段进行选择性沉淀，并用高流速(44mL/m in)制备级RP-HPLC(C18 色谱分离柱,25mmx100 mm)结合阴离子交换色谱二次纯化磷酸化多肽混合物，经 毛细管区带电泳分析确认,得到了一些多肽片段及其相应信息。液

5、相色谱与质谱联 用技术(LC-MS)的发展使人们可以在不分离出独立组分的情况下分析复杂体系中的 多肽片段10。在线或离线HPLC-MS已经被成功地用来鉴定包括蛋白水解产物 11、发酵牛奶12-14、奶酪15,16等体系的活性多肽片段。已有报道首先利用 离子交换色谱对蛋白酶解产物进行分离,然后利用半制备级和分析级HPLC-MS对 非单一组分进行进一步的分离和鉴定分析17。应用HPLC-MS在制备级的规模上 简单有效地分离和分析蛋白酶解产物的方法目前还未见报道。 为了寻求一种简单、快速、有效、低成本的方法得到纯多肽,本文采用胰蛋白酶对 酪蛋白进行降解，利用规模较大的制备级RP-HPLC结合ESI-

6、MS对酶解产物进行 分离纯化。酪蛋白占牛奶中蛋白质含量的80%左右18,由as1-、as2-、p-、K- 酪蛋白组成，其含量比为3:0.8:3:1相对分子质量为19 000-25 00019-21。 这 4种酪蛋白成分的氨基酸序列都已经有报道22。胰蛋白酶是一种肽链内切酶, 它能切开蛋白质多肽链上的赖氨酸和精氨酸残基(除了后面紧跟着脯氨酸残基以外) 的羧基端肽键,并且有高度的专一性23。因此,酪蛋白经过胰蛋白酶酶解后所得到 的多肽片段的氨基酸序列是已知的。在本文中,我们通过一步纯化过程得到了多个 已知氨基酸序列的多肽。1 实验部分1.1 仪器、材料与试剂W aters公司高效液相色谱自动纯化分

7、离系统。该系统包括一个自动进样收集平台 (W aters2767 Sam p le MGR)、二元流动相泵(W aters2545B inary G radient M odule)、515 补偿泵(W aters515HPLC Pum p)、紫外检测器(W aters2489UV-Visible D etector)、流动相管理系统(W aters System Fluidics O rganizer)、单四极杆质谱仪(W aters3100M ass D etector),整个系统用M assLynx软件(W aters公司)操作管理。酪蛋白(technical grade)购自 Sigm

8、 a-A Idrich 公司。胰蛋白酶(trypsin,biotech grade,USP,活性2 500U/m g)购自上海生工生物工程有限公司。乙腈(HPLC grade)购自Honeyw ell公司。三氟乙酸(TFA,HPLC grade)购自Tedia公司。所 使用的其他化学试剂均为分析纯,从国内购买,使用前未经过进一步纯化。实验中所 有的溶液均用电阻率为18 MQcm的去离子水配制，并经0.45pm滤膜过滤处理。1.2 酪蛋白水解将酪蛋白溶解在0.05m ol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中，用氢氧化钠调节 溶液pH值至8.8,酪蛋白溶液的最终质量浓度为60m g/mL。为

9、了防止酪蛋白变 质，在溶液中加入一定量的叠氮化钠，其最终质量浓度为0.2m g/mL。每次水解前， 将胰蛋白酶溶解在0.05m ol/L Tris-HC l缓冲液(pH8.8)中配成2m g/mL的新鲜 母液。然后将一定量的胰蛋白酶母液加入到60m g/mL的酪蛋白溶液中，使胰蛋白 酶最终质量浓度为0.01m g/mL。将混合溶液置于37工水浴中反应,待反应达到特 定时间后,将反应液置于95工水浴中加热10m in使酶解反应终止。反应液冷却至 室温后，在10 000 r/m in的条件下离心20m in,取上清液并将其冷冻抽干后于-20工 下保存待用。1.3反相高效液相色谱-电喷雾电离质谱(R

10、PHPLC/ES I-M S)分析将冷冻抽干的水解产物溶解在含0.1%(体积分数，下同)TFA水中,配制成1m g/mL 的溶液，经220nm滤膜过滤后，滤液作为分析级RP-HPLC/ ESI-MS样品。分析级HPLC色谱柱为Xbridge BEH300C18反相分离柱 (250mmx4.6mm,5pm,3nm(30 A);进样量 20pL;流动相流速 1mL/m in。流动相 A为含有0.1%TFA的去离子水;流动相B为含有0.1%TFA的乙腈。流动相梯度洗 脱程序：030 m in,5%B60%B;3038m in,100%B,冲洗色谱柱;3845m in,5%B,平衡色谱柱。紫外-可见光

11、检测设定214nm和280nm双波长检测。质谱 采用正离子电离模式(ESI+),毛细管电压3kV,离子源温度120乜去溶剂温度 350C,反吹气(N2)流速0 L/h,去溶剂气(N2)流速400L/h,锥孔电压30V。1.4 RP-HPLC/ES I-M S 制备级纯化将冷冻抽干的水解产物溶解在含0.1%TFA的去离子水中配制成150m g/mL的溶 液，经220nm滤膜过滤后的滤液作为制备级RP-HPLC/ESI-MS的样品。制备级HPLC色谱柱为Xbridge BEH300C18反相分离柱 (250mmx19mm,10pm,3nm);流动相A:含有0.1%TFA的去离子水;流动相B:含有0

12、.1%TFA的乙腈;补偿泵流动相:含有0.05%甲酸的乙腈(掺入10%去离子水);流动 相流速为15 mL/m in,补偿泵流动相流速为1mL/m in。流动相洗脱梯度程序:0 3m in,28%B;3 30m in,28% B 45%B;30 38m in,100%B;38 45m in, 28%B。 上样量为45m g。质谱仪中反吹气(N2)流速为50L/h,其他条件同1.3节相应的条 件。分离后的纯多肽组分由214nm紫外吸收信号结合ESIMS分析信号共同引导， 在M asslynx软件平台上实现全自动化收集。1.5基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD I-TO F M S)分析

13、采用 App lied B iosystem 公司的 Voyager D ESTR MALD I-TO F MS 仪对收集 得到的纯多肽样品进行分析。该仪器配置脉冲氮激光(337nm)作为解吸电离源。 仪器采用高分辨率反射模式，加速电压为20 25kV。将0.3%甲酸水溶液和乙腈按 1:1体积比配制成混合溶剂，并加入过量基质2-氰基-4-羟基肉桂酸,取上清液作为 基质饱和溶液。将10 m g/mL样品溶液与基质饱和溶液按1:10体积比混合，取 0.8 1pL混合溶液滴加到MALD I-TO F MS仪专用钢制样品靶上待样品自然晾 干后,将样品靶直接放入质谱仪靶箱内进行分析。2 结果与讨论2.1

14、 酪蛋白酶解产物的分析由于酪蛋白具有比较强的疏水性,在水溶液中通常以胶束存在。为了达到完全酶解 的目的，本文选用胰蛋白酶进行酶解。胰蛋白酶在pH8 9之间于37工下对蛋白质 有较高的水解效率23。酪蛋白的等电点在pH4.624,在pH接近9时，酪蛋白带 有比较多的负电荷,因而可以抑制其疏水性聚集。根据文献所报道的胰蛋白酶的专 一酶切位点23和酪蛋白的氨基酸序列22,理论上完全酶解产物中应含有 80多个 不同的多肽组分。本文的实验证明在PH8.8的Tris缓冲液中，经过24h的反应，胰 蛋白酶可以对酪蛋白进行充分的降解,并且重复性很好。我们通过 RP-HPLC/ESI- MS对酶解产物进行了分析

15、，图1为其分析谱图。图1酪蛋白酶解产物的(a)RP-HPLC分析谱图和(b)总离子流色谱图F ig.1 (a)A na lytica l RP-HPLC chrom a togram and (b)tota l ion cu rren t chrom a togram of the case in hyd rolysa te sep a ra ted by acid ic m obile phaseRP-HPLC conditions:colum n,Xbridge BEH300C18(250 mm x4.6mm,5pm,3nm);samp le size,20pL;flow rate,1 m

16、L/m in;m obile phase A,deionized w ater containing0.1% TFA;m obile phase B,acetonitrile containing0.1%TFA.Gradient elution p rogram:0-30m in,5%B-60%B;30-38m in, 100%B;38-45m in,5%B.2.2 对酪蛋白酶解产物的一次分离纯化为了达到良好的分离效果，提高后面的分离纯化效率，首先利用分析级RP-HPLC优 化对酪蛋白酶解产物尤其是对相对含量较高即图1a中UV吸收值较大的组分(矩 形框圈出的部分)分离的色谱条件。通过改变 1.

17、3节的流动相洗脱梯度,使图1中相 对含量较高的组分得到较好的分离。采用的流动相洗脱梯度程序为：0 3m in,28%B;330 m in,28%B45%B;3038m in,100%B;3845m in,28%B。图 2中，组分1为图1中疏水性相对较低的多肽混合物即保留时间在17m in之前的 组分经过3m in28%B洗脱得到的色谱峰;组分210为图1中矩形框圈出的部分 即被分离的组分。通过与ESI-MS联用，同时可以得到各组分的质谱定性结果(见表 1)。表 1 图 2 中各组分的定性结果 Table1 Q ua lita tive resu Its of the fractions sho

18、w n in F ig.2NP：not pure.ND：not determ ined.?图2酪蛋白酶解产物的(a)RP-HPLC分析谱图和(b)ES I-M S总离子流色谱图F ig.2 (a)A na lytica l RP-HPLC chrom a togram and (b) ES I-M S to ta l ion cu rren tchrom a togram of the case in hydro lysa teRP-HPLC conditions：gradient elution p rogram：0-3m in, 28%B;3-30m in,28%B-45%B;30-38m

19、 in,100%B;38-45 m in,28%B.O ther conditions are the sam e as in Fig.1.For peak identifications,see Table1.图2显示出色谱峰基本上达到了基线分离的要求。我们将该分析级色谱条件直接 放大到制备级RP-HPLC中，结果如图3所示。通过软件控制，以214nm紫外吸收峰流出时间结合ESI-MS信号共同引导收集了 编号为210的组分。通过分析级RP-HPLC/ESI-MS对所收集组分的纯度进行了 分析。图4是采用RP-HPLC/ ESI-MS对制备级色谱收集的编号为3 5组分进行 分析的结果,图4中每

20、个组分在分析色谱图中都只有一个峰,表明所得到的多肽具有 相当高的纯度。与此同时,我们通过质谱信号可以推断出多肽的氨基酸序列。例如, 组分 4的主要离子峰 m/z 634.52,通过酪蛋白氨基酸序列搜索,推断该组分的序列 可能为YLGYLEQLLR,即m/z634.52为该多肽组分带两个正电荷的质谱信号，我们 通过MALD I-TO F MS进行了验证。在该组分的MALD I-TO F MS谱图上可以 观察到m/z1 267.70的主要质谱峰。由于MALD I 般是采用单电荷电离方式电 离被检测物，所以该质谱峰应该对应于带单个正电荷的分子离子峰，这与ESI-MS得 出的结果相符,因而证明了该组分

21、的氨基酸序列推断结果。本文用同样的方法分析 了所收集的其他组分的纯度,并对被分离组分的氨基酸序列进行了鉴定（见表1）。其 中组分2 5以及组分9的纯度较高，其氨基酸序列也可以被推断出来。而组分10 虽然能确认其相对分子质量,但是通过简单的氨基酸序列检索无法确认该片段的组 成,这有可能是因为该片段含有甲硫氨酸、半胱氨酸等这类容易被氧化的氨基酸 22,在蛋白酶解和分离前的处理过程中侧链基团发生了氧化反应,因此还需要通过 其他方法进行进一步的表征来确认氨基酸序列。组分68虽然相对含量较高，但由 于组成相对复杂,因此很难在次分离过程中得到纯的组分。图3图1中框出组分的制备级RP-HPLC谱图F ig.

22、3 P repa ra tive RP-HPLC chrom a togram of the fractions fram ed in F ig.1RP-HPLCconditions:colum n,Xbridge BEH300C18(250 mm x19mm,10pm,3nm).O ther conditions are the sam e as in Fig.2.For peak identifications,see Table1. 图 4 图 3 中组分 35 的 RP-HPLC 分析谱图 F ig.4 A na lytica l RP-HPLC chrom a togram s of

23、 the fractions3-5show n in F ig.3 RP-HPLC conditions are the sam e as in Fig.1.2.3 二次分离纯化制备亲水性多肽组分本文把疏水性相对较弱的多肽组分，即图1中保留时间在17m in之前的组分在制 备级分离中作为混合物收集 (表1中的组分 1),将其冷冻抽干、溶解后进行了二次 分离纯化。采用的梯度洗脱程序：0 3m in,9%B;3 12m in,9%B 12%B;12 13 m in,13%B;1317m in,13%B15%B;17 18m in,16.5%B;1824m in,16.5%B 20%B; 2425m

24、 in,22.5%B;25 38m in,22.5%B 28%B;38 48m in,100%B,清洗色谱柱;4856 m in,9%B,平衡色谱柱。得到的RP-HPLC制备级 二次色谱结果如图5所示。同样按照上面对酪蛋白酶解产物一次分离纯化的思路, 经过RP-HPLC/ ESI-MS二次分离纯化以及MALD I-TO F MS分析，收集得到表2 中编号为1 6的组分。其中组分1 4可以推断出对应的氨基酸序列。组分5纯 度不高,组分 6能够确定其相对分子质量,但未能检索到对应的氨基酸序列。图5亲水性较强的多肽组分的制备级RP-HPLC谱图F ig.5 Prepa ra tive RP- HPL

25、C chrom a togram of the hyd roph ilic pep tidesRP-HPLC conditions:gradient elution p rogram:0-3m in, 9%B;3-12m in,9%B- 12%B;12-13m in,13%B;13-17 m in,13%B-15%B;17-18m in,16.5%B;18-24m in, 16.5%B-20%B;24-25m in,22.5%B;25-38m in,22.5%B -28%B;38-48m in,100%B;48-56m in,9%B.O ther conditions are the sam

26、e as in Fig.3.For peak identifications,see Table2.表 2 图 5 中各组分的定性结果 Table2 Q ua lita tive resu Its of the fractions show n in F ig.5NP:not pure.ND:not determ ined.?2.4 柱上样量对一次性分离制备的影响 柱上样量对色谱分离的效果有很大的影响。理论上,柱上样量的加大可以提高产量, 但峰形会出现展宽、拖尾等一系列影响分离效果的现象。本文在不改变其他条件的 情况下考察了不同的制备柱上样量对分离的影响,结果如图6所示。当上样量从 30 m

27、g增加到75m g时，大部分的峰形没有太大的变化，但是a、b、c3个峰的分辨 率有所下降,特别是上样量45m g与60m g之间的色谱峰有明显的差异，因此我们 认为45m g是在该体系分离条件下比较理想的上样量。2.5 流动相酸碱性对分离制备的影响由于多肽本身含有-NH2、-C00H等pH响应基团,在不同pH条件下多肽所带的 电荷会有所不同，其亲/疏水性也会随之发生变化。因此，在RP-HPLC色谱柱上的保 留时间也会发生改变。上面所讨论的分离是在酸性条件下,即流动相中含有 0.1%TFA条件下进行的。为了得到新的多肽，本文在流动相A（水相）和流动相B（乙 腈相）中分别加入了 0.1%NH3H2

28、O以取代TFA,使得流动相变为碱性环境。在保 持其他条件不变的情况下对酶解产物进行了分析。图7所示的是在碱性流动相条 件下RP-HPLC/ESI-MS对酶解产物的色谱分析结果。与酸性流动相条件下的结果 （见图1）比较,在碱性流动相条件下酶解产物各组分的保留时间以及紫外吸收峰形有 很大的不同。同样利用ESI-MS结果和氨基酸序列检索，可以得到紫外吸收信号比 较强的组分的氨基酸序列,结果列于表3中。图6酶解产物在不同上样量条件下的RP-HPLC制备级分离色谱图F ig.6 P rep a ra tive RP-HPLC ch rom a togram s w ith d iffe ren t lo

29、ading m asses 从表3来看,组分 1和 4多肽片段为碱性条件下新出现的氨基酸序列,而其他组分的 多肽片段已经在表1和表2中出现过。通过改变洗脱梯度,我们尝试采用 RP-HPLC 对组分 1与 4进一步分离。分离后可以得到纯的组分 4;而组分 1由于疏水性较弱, 在反相色谱柱上的保留时间很短,并且受到其他亲水性多肽片段的干扰,因此没能通 过一次反相色谱分离得到纯的组分。图7酪蛋白酶解产物在碱性流动相下的(a)RP-HPLC分析谱图和(b)总离子流色谱 图 F ig.7 (a)A na lytica l RP-HPLC chrom a togram and (b)tota l ion

30、cu rren t chrom a togram of the case in hyd rolysa te sepa ra ted by basic m obile phaseRP-HPLC conditions:m obile phase A,deionized w ater containing0.1%NH3H2O;m obile phase B,acetonitrile containing0.1%NH3H2O.O ther conditions arethe sam e asin Fig.I.For peak identifications,see Table3.表 3 图 7 中各组

31、分的定性结果 Table3 Q ua lita tive resu Its of the fractions show n in F ig.7ND:not determ ined.NP:not pure.?3 结论在37工、pH8.8条件下，本文采用胰蛋白酶对酪蛋白进行充分降解,得到了具有特 定氨基酸序列的多肽组分。酶解产物经过RP-HPLC/ESI-MS分析和条件优化提高 分辨率以后直接放大到制备柱上进行制备级分离。经过RP-HPLC/ESI-MS-步制 备级分离纯化，得到了 5个纯度较高的多肽组分;通过联用的ESI-MS与辅助的 MALD I-TO F MS分析，推断出了这些片段的氨基酸序

32、列。本文还对RPHPLC 步 分离纯化中收集下来的疏水性较弱的多肽混合物组分进行了二次分离纯化,得到了 新的 4个纯度较高、已知氨基酸序列的多肽片段。除此之外,还尝试了在碱性流动 相条件下直接对酶解产物进行分离,得到了 1个新的多肽片段。本文所得到的多肽 具有确定的氨基酸序列和亲/疏水性,适合于制备生物相容材料。本文建立的利用酶 解酪蛋白和色谱分离制备多肽的方法具有简单、成本低、重复性好等特点,适合于 较大规模的多肽制备。该方法为多肽分离和多肽材料的广泛应用提供了种选择。 参考文献:1 Tellez A,CorredigM,B rovko L Y,et al.J Dairy Res,2010,

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