《长期毒性试验》ppt课件

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1、实 验 动 物 与 动 物 实 验 第 2讲 长 期 毒 性 试 验 2. Chronic Toxicity Test 2021-5-4 1 确 定 毒 性 剂 量 ： Toxic dosage 发 现 安 全 范 围 ： Safety margin 研 究 毒 性 反 应 ： Toxic reaction: 性 质 、 程 度 、量 毒 关 系 、 产 生 时 间 ， 达 峰 时 间 , 持 续 时 间 及 反复 产 生 毒 性 反 应 时 间 、 迟 发 性 、 蓄 积 性 、 耐 受 性 找 到 毒 性 反 应 靶 器 官 ： Target organ 明 确 毒 性 反 应 是 否 可

2、 逆 ： Reversibility确 定 “ DOSTR” 二 、 长 期 毒 性 试 验 的 基 本 内 容 和 要 求 1.试 验 动 物 二 种 动 物 ， 啮 齿 类 首 选 大 鼠 ， 非 啮 齿 类 用 犬 (Beagle犬 ), 必 要 时 用 猴 ； 动 物 应 写 明 供 应 单 位 信 息 ， 品 系 及 生 产 合 格 证 号 ； 大 鼠 6-8周 龄 ， 体 重 差 异 不 超 过 平 均 体 重 的 20 。 3个 月以 上 可 选 5-6周 龄 大 鼠 ； Beagle犬 4-12月 龄 ； 各 半 ， 数 量 相 同 。 或 选 用 敏 感 性 别 的 动 物

3、2.饲 养 管 理 严 格 控 制 环 境 条 件 ， 避 免 不 必 要 的 干 扰 因 素 。室内温度饲料或饲料配方湿 度光 照通风条件饮水质量环 境 因 素 2.饲 养 管 理啮 齿 类 动 物适 宜 温 度 为 1827 。 相 对 湿 度 为 40%70%。光 照 宜 持 续 12 小 时 明 亮 ， 12 小 时 黑 暗 。通 风 条 件 良 好 。所 用 饲 料 应 符 合 动 物 的 营 养 标 准 。 雌 雄 动 物 应 分 开 饲 养 ， 每 笼 不 宜 超 过 5只 犬单 笼 饲 养 ， 定 量 喂 食 。 Beagle 狗 实 验 前 至 少 驯养 12 周 ; 杂 种

4、 狗 应 先 检 疫 ， 驱 虫 。 2.饲 养 管 理主 要 因 素 动 物 类 别小 鼠 、 大 鼠 豚 鼠 、 家 兔 犬温 度 ( ) 20-26 18-28 18-28湿 度 40-60% 40-60% 40-60%换 气 次 数 10-15次 /h 10-15次 /h 10-15次 /h气 流 速 度 13-18cm/s 13-18cm/s 13-18cm/s压 力 正 压 正 压 负 压洁 净 度 100000级 100000级落 下 细 菌 3个 /皿 3个 /皿照 明 150-300 Lux 150-300 Lux噪 声 60 db 60 db臭 气 氨 浓 度 20 ppm

5、 氨 浓 度 20 ppm 3.受 试 物 受 试 物 应 能 充 分 代 表 临 床 试 验 受 试 物 和 上 市 药 品 ； 因 此 受 试 物 应 采 用 制 备 工 艺 稳 定 、 符 合 临 床 试 用 质 量标 准 规 定 的 样 品 ； 一 般 用 中 试 样 品 ， 并 注 明 受 试 物 的 名 称 、 来 源 、 批 号含 量 （ 或 规 格 ） 、 保 存 条 件 及 配 制 方 法 等 。 4.给 药 途 径 与 临 床 给 药 途 径 一 致 混 入 饲 料 或 饮 水 中 灌 服 时 ： 保 证 受 试 药 分 布 均 匀 在 配 制 饲 料 或 溶 于 饮 水

6、后 仍 旧 稳 定 计 量 准 确 临 床 iv 时 , 大 鼠 给 药 周 期 1月 ， 可 用 ip代 替 ， im或 sc应变 换 注 射 部 位 必 要 时 改 变 给 药 途 径 5.剂 量 及 分 组 至 少 3个 给 药 组 , 单 位 : mg(ml,IU) /kg 或 /m2 以 不 等 浓 度 等 容 量 给 药 低 剂 量 组 -高 于 有 效 剂 量 ， 不 出 现 毒 性 反 应 (一 般 为 动 物 有 效 剂 量或 临 床 治 疗 量 的 23倍 ) 中 剂 量 组 （ 1-n个 ） -产 生 轻 微 或 中 等 度 毒 性 反 应 高 剂 量 组 -产 生 明

7、显 或 严 重 的 毒 性 反 应 ， 或 个 别 动 物 死 亡 （ 但 死 亡 率 应 控 制 在 20% 以 内 ） ； 空 白 对 照 -溶 媒 或 其 它 赋 形 剂 ， 若 溶 媒 或 赋 形 剂 有 毒 性 时 则 增 加 正常 对 照 组 3月 ， 大 鼠 各 20只 /组3月 ， 大 鼠 各 30只 /组大 动 物 6-8只 /组 （ 各 半 ）按 计 算 高 剂 量低 剂 量 X 5.剂 量 及 分 组 在 选 择 合 适 的 剂 量 时 还 应 考 虑 到 ： 药 物 在 体 内 的 生 物 蓄 积 作 用 。 对 于 高 蓄 积 性 药 物 应适 当 减 少 其 剂 量

8、 ， 否 则 在 长 期 毒 性 试 验 结 束 时 各 剂 量 均 有可 能 出 现 毒 性 作 用 ； 药 物 是 否 有 可 能 被 特 殊 的 酶 所 “ 解 毒 ” 或 “ 活 化 增毒 ” ， 而 这 些 酶 又 是 否 易 被 药 物 本 身 所 诱 导 或 抑 制 。 药 物 在 消 化 道 中 的 稳 定 性 。 与 胃 肠 道 内 容 物 有 亲 和性 的 药 物 ， 则 应 酌 情 增 加 剂 量 。 可 供 参 考 的 具 体 方 法（ 1） 半 数 致 死 量 法 （ LD50法 ）（ 2） 短 期 蓄 积 试 验 过 渡 法（ 3） 药 代 动 力 学 法 （ MB

9、S法 ）（ 4） 最 大 耐 受 量 法 （ MTD法 ）（ 5） 临 床 拟 用 剂 量 法 （ ACD法 ）（ 6） 等 效 剂 量 法5.剂 量 及 分 组 大 鼠 3个 月 :采 用 约 LD50的 1/10、1/50和 1/100剂 量 ， 狗 各 剂 量 组 可采 用 一 半 剂 量 。根 据 药 代 动 力 学 最 大 有 效 安 全 浓度 （ MCD）大 鼠 3个 月 :采 用 大 鼠 的 1.0 、3.36.6 和 1020 MCD;狗 可 采 用 大 鼠 一 半 左 右 的 剂 量 。根 据 大 鼠 急 性 毒 性 (MTD)大 鼠 3个 月 ： 分 别 为 1、 1/3及

10、1/10MTD；狗 和 猴 可 采 用 大 鼠 一 半 左 右 的 剂 量 。 根 据 临 床 拟 用 剂 量 （ 3个 月 ）采 用 50100倍 、 2550倍 和 1020倍 临 床 剂 量狗 可 分 别 采 用 3050倍 、 1525倍 和 510倍 临 床 剂 量猴 可 采 用 与 狗 相 近 的 剂 量 或 略 低 于 狗 的 剂 量 进 行 试 验 限 度 试 验 我 国 SFDA规 定 ： 如 小 鼠 急 性 毒 性 的 口 服给 药 剂 量 大 于 5g/kg，注 射 给 药 剂 量 大 于 2g/kg 仍 未 产 生 毒 性 反应 和 死 亡 ， 或 仅 个 别 动物 有

11、 毒 性 反 应 时 ， 可 考虑 只 做 一 个 高 于 临 床 拟用 剂 量 50倍 (狗 用 30倍 )的 剂 量 组 。 经 济 合 作 与 开 发 组 织 (OECD)提 出 ： 如 果 一 种 化 合 物 以 1000mg/kg的 剂 量 ， 按 规 定 期 限 连 续 给 药 ，不 产 生 任 何 可 观 察 到 的 毒 性 反应 ， 而 且 根 据 结 构 相 关 药 物 的已 有 资 料 ， 估 计 不 会 产 生 毒 性的 话 ， 就 不 需 要 再 用 三 个 剂 量来 进 行 试 验 ， 除 非 预 期 临 床 需要 更 高 的 剂 量 。 6.给 药 方 法 及 时

12、限 每 天 给 药 ， 每 周 必 须 给 药 7 天 。 给 药 期 限 长 （ 3个 月 或 以 上 ）的 药 物 每 周 至 少 应 给 药 6天 。 每 天 给 药 最 好 固 定 时 间 。按 我 国 药 政 管 理 部 门 的 要 求 ， 长 期 毒 性 试 验 的 给 药 期 限 一 般 为 临床 疗 程 的 34倍 时 间 。 创 新 药 品 试 验 周 期 应 不 少 于 90天 ， 超 过180天 的 新 药 可 以 在 试 验 开 始 90天 后 ， 同 时 进 行 I期 临 床 试 验 。 6.给 药 方 法 及 时 限临 床 拟 用 毒 性 试 验 期 限 给 药 时

13、 间 啮 齿 类 动 物 非 啮 齿 类 动 物 5天 2周 2周 2周 1月 1月 2-4周 3月 3月 1-3月 6月 6月 3月 6月 9月 2021-5-4 15 7.观 察 及 测 定 指 标 试 验 前 ， 啮 齿 类 动 物 至 少 应 进 行 5天 的 适 应 性 观 察 ， 非 啮 齿 类 动 物至 少 应 驯 养 观 察 12周 ， 应 对 动 物 进 行 一 般 观 察 及 血 液 生 化 学 指 标 的检 测 。 试 验 期 间 ， 至 少 应 每 天 或 每 两 天 作 一 次 详 细 的 观 察 。 试 验 结 束 时 ， 必 须 留 1/3的 动 物 做 恢 复

14、期 的 观 察 试 验 ， 其 观 察 期 时间 一 般 不 超 过 28天 。 2021-5-4 16 7.1 日 常 观 察 1） 一 般 观 察 内 容 包 括 对 实 验 动 物 被 毛 、 皮 肤 、 眼 睛 、 粘 膜 、 孔 道 ( 及 其 分 泌 物 ) 、 呼 吸 、 循 环 、 自 主 神 经 系 统 、 躯 体和 肢 体 活 动 情 况 以 及 精 神 行 为 进 行 仔 细 地 观 察 ； 对动 物 粪 便 的 量 、 色 泽 和 内 含 物 ， 散 失 的 食 物 ， 饮 水瓶 中 残 余 的 水 以 及 一 切 可 以 反 映 动 物 生 活 情 况 变 化的 各

15、种 迹 象 ， 都 必 须 加 以 注 意 。 所 有 出 现 的 症 状 都 必 须 记 录 在 案 。 2021-5-4 17 1） 一 般 观 察 内 容 如 果 发 现 动 物 死 亡 ， 必 须 尽 可 能 快 地 进 行 尸 体 剖 检 ， 以 减 少组 织 自 溶 。 将 组 织 置 于 10% 的 中 性 福 尔 马 林 或 其 它 适 宜 的 固 定 液中 。 如 果 尸 体 剖 检 不 能 立 即 进 行 ， 则 必 须 将 动 物 冷 藏 起 来 以 延 缓组 织 自 溶 。 对 濒 死 的 动 物 也 应 立 即 处 死 作 尸 体 剖 检 。 尸 体 剖 检 后 行

16、组 织 病 理 学 检 查 、 评 价 。 2021-5-4 18 2） 生 长 率 体 重 3） 食 耗食 耗 常 用 来 评 价 给 药 对 食 欲 及 食 物 利 用 率 的 影 响食 耗 的 计 算 将 加 入 供 食 器 具 中 饲 料 的 重 量 减 去 剩 余 的 饲 料重 量 再 除 以 给 食 天 数 如 对 食 欲 有 影 响 ， 则 每 日 进 食 量 必 然 减 少 , 体 重 增 长 亦 受 影响 , 但 此 时 食 物 利 用 率 并 不 一 定 降 低 如 果 不 影 响 食 欲 ,而 体 重 增 长 却 下 降 ,表 明 药 物 有 可 能 影 响 食物 的 吸

17、 收 或 合 成 代 谢 ,此 时 食 物 利 用 率 就 必 然 会 有 变 化 2021-5-4 19 7.2 测 定 指 标 1） 器 官 重 量 涉 及 的 主 要 器 官 有 ： 心 脏 、 肝 脏 、 肾 脏 、 脾 脏 、 肺 、 脑 、 肾 上 腺 、 甲 状 腺 、 睾 丸 、 前 列 腺 、 子 宫 等 。 目 的 ： 确 定 靶 器 官 2021-5-4 20 药 物 研 究 技 术 指 导 原 则 规 定长 期 毒 性 试 验 中 需 称 重 并 计 算 脏 器 系 数 的 器 官 ：l脑l肝 脏l肾 上 腺l脾 脏l附 睾l子 宫 l心 脏l肾 脏l胸 腺l睾 丸l卵

18、 巢l肺 脏1） 器 官 重 量 甲 状 腺 、前 列 腺 长 期 毒 性 试 验 中 进 行 病 理 组 织 学 检 查 的 组 织 或 器 官 ：l脑 （ 大 脑 、 小 脑 、 脑 干 ）l垂 体l甲 状 腺l食 管l胃l肝 脏l肾 脏l脾 脏l气 管l主 动 脉l附 睾l卵 巢l前 列 腺l坐 骨 神 经 l眼 （ 眼 科 检 查 发 现 异 常 时 ） l给 药 局 部l淋 巴 结 l脊 髓l胸 腺l甲 状 旁 腺l唾 液 腺l小 肠 和 大 肠l胆 囊 l肾 上 腺l胰 腺l肺l心 脏l睾 丸l子 宫l乳 腺l膀 胱l视 神 经 l骨 髓注 ： 为 啮 齿 类 动 物 可 不 进

19、行 组 织 病 理 学 检 查 的 组 织 或 器 官 2021-5-4 22 2） 血 液 学u 常 规 的 血 液 学 参 数u 骨 髓 涂 片l红 细 胞 计 数l红 细 胞 容 积l平 均 红 细 胞 血 红 蛋 白l网 织 红 细 胞 计 数l血 小 板 计 数 l血 红 蛋 白l平 均 红 细 胞 容 积l平 均 红 细 胞 血 红 蛋 白 浓 度l白 细 胞 计 数 及 分 类l凝 血 酶 原 时 间红 细 胞 压 积血 液 学 指 标 2021-5-4 23 血 液 学 指 标 观 察 时 间非 啮 齿 类 动 物 ：一 般 于 整 个 试 验 周 期 中 每 隔 1.5 2

20、个 月 采 血 测 定 一 次 各 项 指 标 。啮 齿 类 动 物 ：试 验 周 期 为 6 个 月 时 ， 可 于 试 验 中 期 、 试 验 末 期 以 及 恢 复 期 分 别 剖杀 部 分 动 物 ( 约 1/4 、 2/4 、 1/4)， 进 行 各 项 检 查 ；试 验 周 期 为 3 个 月 时 ， 可 于 试 验 未 期 以 及 恢 复 期 分 别 剖 杀 部 分 动 物 ( 约 2/3、 1/3)， 取 血 检 查 。 2021-5-4 24 3） 血 液 生 化 学 注 意 事 项 ：q 采 血 时 从 各 组 中 随 机 捉 取 动 物 ， 样 本 不 能 溶 血q 使

21、用 足 够 数 量 的 动 物q 采 样 前 禁 食 12 小 时q 使 用 合 适 的 统 计 学 分 析 方 法 ， 注 意 剂 量 反 应 关 系 ； 将 所 得 资 料和 数 据 与 同 种 、 同 龄 、 同 性 别 、 同 生 理 状 况 的 实 验 动 物 的 资 料 加以 比 较 分 析 血 液 生 化 学 指 标l天 门 冬 氨 酸 氨 基 转 换 酶l碱 性 磷 酸 酶 l尿 素 氮l总 蛋 白l血 糖l总 胆 固 醇l 谷 氨 酰 转 移 酶l氯 离 子 浓 度 l丙 氨 酸 氨 基 转 换 酶l肌 酸 磷 酸 激 酶l肌 酐l白 蛋 白l总 胆 红 素l甘 油 三 酯l

22、钾 离 子 浓 度l钠 离 子 浓 度 2021-5-4 25 4） 尿 液 分 析 尿 液 分 析 指 标l尿 液 外 观lpH值l尿 蛋 白l尿 胆 原l潜 血 l比 重l尿 糖l尿 胆 红 素l酮 体l白 细 胞 5） 心 电 图 导 联 大 动 物 长 期 毒 性 必 须 做 ； 主 要 观 察 指 标 ： 心 率 、 P波 电 压 、 P-R间 期 、 R波 电 压 、QRS时 间 、 ST段 、 T波 电 压 和 Q-T间 期 2021-5-4 27 8.恢 复 期 观 察 最 后 一 次 给 药 物 后 24小 时 ， 每 组 活 杀 部 分 动物 检 测 上 述 各 项 指 标

23、 ， 留 下 1/3 1/2动 物 进 行 恢 复期 观 察 。 观 察 期 一 般 不 超 过 28天 ， 而 后 再 活 杀 检查 上 述 所 有 指 标 ， 以 了 解 毒 性 反 应 的 可 逆 程 度 和可 能 出 现 的 延 迟 性 毒 性 反 应 。 首 页 写 明 : 负 责 者 的 姓 名 、 职 称 、 实 验 开 始 及 结 束 日期 、 实 验 承 担 单 位 、 研 究 室 负 责 人 和 资 料 保 存 单 位 试 验 指 导 者 、 课 题 负 责 人 、 病 理 学 检 查 、 血 液 生 化 指 标 测 定 、血 液 学 指 标 测 定 及 给 药 观 察 者

24、 第 二 页 书 写 试 验 摘 要 第 三 页 开 始 写 正 文 、 引 言 、 材 料 与 方 法 、 结 果 合 理 的 统 计 图 、 表 有 差 异 的 指 标 应 进 行 统 计 处 理 应 客 观 地 描 述 尸 检 及 组 织 病 理 学 检 查 结 果 对 各 种 异 常 现 象 可 用 半 定 量 的 方 式 表 述 ， 揭 示 量 -时 关 系 2021-5-4 29 长 期 毒 性 试 验 是 药 物 非 临 床 安 全 性 研 究 的有 机 组 成 部 分 ， 是 药 物 非 临 床 毒 理 学 研 究 中 综合 性 最 强 、 获 得 信 息 最 多 和 对 临 床 指 导 意 义 最大 的 一 项 毒 理 学 研 究 。 对 其 结 果 进 行 评 价 时 ，应 结 合 受 试 物 的 药 学 特 点 ， 药 效 学 、 药 代 动 力学 和 其 他 毒 理 学 研 究 的 结 果 ， 以 及 已 取 得 的 临床 研 究 的 结 果 ， 进 行 综 合 评 价 。 确 实 做 好 预 试 pretest周 密 设 计 剂 量 dosage 精 心 饲 养 动 物 housing细 心 观 察 反 应 observation认 真 测 定 指 标 examination实 事 求 是 总 结 conclusion