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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。小鼠型胶原N 末端肽(NTX) 酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书产品编号 : E-EL-M0360( 本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断 !)声明 : 尊敬的客户 , 感谢您选用本公司的产品。本产品选用世界著名生产厂家的原料 , 采用专业 ELISA kit 生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、 血浆、 组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组NTX浓度。 使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!如有疑问,请及时联系伊莱瑞特生物科技有限公司。试剂盒组成 :名称 -中文名称 -英文规格保存条件ELISA 酶标板Micro ELI
2、SA Plate812 / 8 6*4冻干标准品Reference Standard2/ 1 支 *4标准品 & 样品稀释液Reference Standard & Sample Diluent1 瓶20mL/12mL*4浓缩生物素化抗体Concentrated Biotinylated Detection Ab1支120L/70 L*4生物素化抗体稀释液Diluent for Biotinylated Detection Ab1瓶10mL/6mL*4浓缩 HRP 酶结合物Concentrated HRP Conjugate1 支120L/70 L*4(避光 )酶结合物稀释液Diluent f
3、or HRP Conjugate1 瓶10mL/6mL*4浓缩洗涤液 ( 25 )Concentrated Wash Buffer ( 25 ) 1 瓶30mL/16mL*4底物溶液 ( TMB)Substrate Reagent1 瓶10mL/6mL*4(避光 )反应终止液Stop Solution1 瓶10mL/6mL*4资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。封板覆膜Plate Sealer5/3 张 *产品说明书Product Description1 份*: 96T/48T(打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整)检测原理 :本试剂盒采用双抗体夹心 ELISA
4、 法。用抗小鼠 NTX 抗体包被于酶标板上 , 实验时标本或标准品中的 NTX 会与包被抗体结合 , 游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠 NTX 抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠 NTX 抗体与结合在包被抗体上的小鼠 NTX 结合、 生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物 , 游离的成分被洗去。加入显色底物 (TMB), TMB 在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色 , 加终止液后变黄。用酶标仪在 450nm波长处测 OD 值, NTX 浓度与 OD450值之间呈正比 , 经过绘制标准曲线求出标本中 NTX 的浓度。标本收集 :1. 血清 : 全血标本于室温放置 2小时或 4 过夜
5、后于 1000 g离心 20分钟 , 取上清即可检测 , 收集血液的试管应为一次性的无热原 , 无内毒素资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。试管。2.3.血浆 : 抗凝剂推荐使用 EDTA.Na2, 标本采集后 30分钟内于 1000 g 离心 15分钟 , 取上清即可检测。避免使用溶血 , 高血脂标本。组织匀浆 : 用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4) 冲洗组织 , 以去除残留血液 ( 匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果 ) , 称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS( 一般按 1:9的重量体积比 , 比如 1g的组织样本对应 9mL 的PBS
6、, 具体体积可根据实验需要适当调整, 并做好记录。推荐在 PBS中加入蛋白酶抑制剂) 加入玻璃匀浆器中, 于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞, 能够对匀浆液进行超声破碎 , 或重复冻融。最后将匀浆液于5000g 离心 510分钟 , 取上清检测。4.5.6.细胞培养上清 : 取细胞培养上清于 1000 g离心 20分钟 , 除去杂质及细胞碎片。取上清检测。其它生物标本 : 1000 g离心 20分钟 , 取上清即可检测( 具体处理方法可参考: )标本应清澈透明, 悬浮物应离心去除。7. 标本收集后若不及时检测 , 请按一次使用量分装 , 冻存于 -20/-80 冰箱内 , 避免重复冻融 ,
7、 1-6月内检测 ,4 保存的应在 1周内进行检测。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。8. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值 , 请根据实际情况 , 做适当倍数稀释 (建议先做预实验 , 以确定稀释倍数 )。试验所需自备物品:1. 酶标仪 (450nm波长滤光片 )2. 高精度移液器 , EP管及一次性吸头 : 0.5-10L, 2-20 L, 20-200 L, 200-1000L3. 37恒温箱 , 双蒸水或去离子水4. 吸水纸检测前准备工作:1. 请提前 20分钟从冰箱中取出试剂盒 , 平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释 (1:25)。未用完的
8、放回 4。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶 , 属于正常现象 , 可用 40水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液 ( 加热温度不要超过 50 , 使用时洗涤液应为室温 ) 。3. 标准品 : 加入标准品 & 样品稀释液 1.0mL 至冻干标准品中 , 静置 10 分钟 , 待其充分溶解后 , 轻轻混匀 (浓度为 200ng/mL )。然后根据需要进行倍比稀释 ( 注 : 不要直接在反应孔中进行倍比稀释 ) 。建议资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。配制成以下浓度:200、 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、 0ng/mL , 样品稀释液直
9、接作为空白孔0ng/mL 。如配制 100ng/mL 标准品: 取 0.5mL 200ng/mL 的上述标准品加入含有0.5mL 样品稀释液的EP管中 , 混匀即可 , 其余浓度依此类推。4. 生物素化抗体工作液 : 实验前计算当次实验所需用量 ( 以 100L/ 孔计) , 实际配制时应多配制 100-200L 。使用前 15分钟 , 以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体 (1:100)成工作浓度。当日使用。5. 酶结合物工作液 : 实验前计算当次实验所需用量 ( 以 100L/ 孔计 ) ,实际配制时应多配制100-200L 。使用前 15分钟 , 以酶结合物稀释液稀释浓缩 HRP酶结
10、合物 (1:100)成工作浓度。当日使用。标准品稀释方法图例: (以500L/ 管为例 , 也可根据实际用量来稀释,如 200L/ 管 )200100502512.56.253.130ng/mL洗涤方法 :资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。1.2.自动洗板机 : 每孔加入洗涤液350L, 注入与吸出间隔60秒。手工洗板 : 甩尽孔内液体 , 在洁净的吸水纸上拍干 , 每孔加洗涤液 350L, 浸泡 1-2分钟 , 吸去 ( 不可触及板壁 ) 或甩掉酶标板内的液体, 在厚的吸水纸上拍干。操作步骤 :实验开始前 , 各试剂均应平衡至室温 ; 试剂或样品配制时 , 均需充
11、分混匀 , 并尽量避免起泡。1. 加样 : 分别设空白孔、 标准孔、 待测样品孔。 空白孔加样品稀释液 100L, 余孔分别加标准品或待测样品100L, 注意不要有气泡,加样时将样品加于酶标板底部, 尽量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜 , 37 孵育 90 分钟。 为保证实验结果有效性, 每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体 , 甩干 , 不用洗涤。每个孔中加入 生物素化抗体工作液 100L( 在使用前 15 分钟内配制 ) , 酶标板加上覆膜 , 37温育 1 小时。3. 弃去孔内液体 , 甩干 , 洗板 3 次 , 每次浸泡 1-2 分钟 , 大约 350L/ 每孔 ,
12、甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。4. 每孔加 酶结合物工作液 ( 临用前 15 分钟内配制 ) 100L, 加上覆膜 ,资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。5.6.7.8.9.37温育 30 分钟。弃去孔内液体 , 甩干 , 洗板 5 次, 方法同步骤3。每孔加 底物溶液 (TMB) 100L, 酶标板加上覆膜37避光孵育15分钟左右 ( 根据实际显色情况酌情缩短或延长, 但不可超过30 分钟。当标准孔出现明显梯度时, 即可终止 ) 。每孔加 终止液50L, 终止反应 , 此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。立即用酶标仪在450nm 波长测量各孔的光密度( OD 值) 。应提前打开酶标仪电源, 预热仪器 , 设置好检测程序。实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。注意事项 :1. 保存 : 试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过2.3.程中避免将试剂暴露在强光中。 所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染 , 否则可能会出现错误的结果。酶标板 : 刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质 , 此为正常现象 , 不会对实验结果造成任何影响。加样 : 加样或加试剂时 , 第一个孔与最后一个孔的加样时间间隔如果太大 , 将会导致不同的 ”预温育 ”时间 , 从而明显地影响到测量值
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