遗传工程和转基因技术

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1、DNA重 组 技 术 的 应 用 重 组 蛋 白 质 的 表 达 系 统 克 隆 能 编 码 特 定 蛋 白 质 的 基 因 或 cDNA. 开 发 合 适 的 表 达 系 统 常 用 的 表 达 系 统1. 大 肠 杆 菌 E.coli 2. 枯 草 芽 孢 杆 菌 Bacillus Subtilis3. 酵 母4. 培 养 的 昆 虫 细 胞5. 哺 乳 动 物 细 胞 选 择 表 达 系 统 ， 根 椐 所 生 产 的 蛋 白 质 的 性 状 确 定 。 细 菌 细 胞优 越 性 1. 操 作 方 便2. 细 菌 繁 殖 快3. 可 获 得 大 量 蛋 白 质 且 价 格 低 廉缺 点

2、1. 多 肽 成 份 常 不 能 适 当 的 折 叠 ， 常 形 成 不 溶 性 包 涵 体 。 而 从包 涵 体 中 制 备 的 蛋 白 质 常 无 生 物 活 性 。2. 菌 体 因 产 生 的 大 量 异 体 蛋 白 ， 而 对 细 菌 产 生 毒 性 副 作 用 ，而 使 细 菌 培 养 物 中 细 菌 的 浓 度 不 高 。3. 细 菌 缺 乏 转 录 后 修 饰 的 酶 ， 如 在 蛋 白 质 上 加 上 磷 酸 根 ， 糖基 。 而 这 些 修 饰 作 用 对 蛋 白 质 完 成 其 功 能 常 常 是 必 须 的 。 酵 母 细 胞 优 越 性1. 为 十 分 简 单 的 真

3、核 细 胞 ， 其 特 性 和 哺 乳 动 物 细 胞相 似 ， 而 其 生 长 和 细 菌 一 样 快 。2. 可 完 成 人 类 蛋 白 质 的 转 录 后 修 饰 。 并 可 诱 导 表 达蛋 白 分 泌 至 培 养 基 中 。缺 点 其 有 活 性 的 蛋 白 水 解 酶 类 ， 可 降 解 异 体 蛋 白 ， 使其 产 量 降 低 。 昆 虫 细 胞 利 用 昆 虫 病 毒 ， 杆 状 病 毒 在 昆 虫 细 胞 中 表 达 异 体 蛋 白 质 。优 越 性 1.蛋 白 能 高 水 平 表 达 ， 多 肽 能 正 确 折 叠 。2.具 有 转 录 后 修 饰 作 用 。缺 点 昆 虫

4、 细 胞 培 养 价 格 高 于 细 菌 和 酵 母 哺 乳 动 物 细 胞 生 产 哺 乳 动 物 蛋 白 质 的 最 佳 表 达 系 统 。启 动 子 ， 载 体 ， 转 染 方 法在 哺 乳 动 物 细 胞 稳 定 组 入 扩 增 基 因 ， 可 供 产 生 大 量 蛋 白缺 点细 胞 培 养 价 格 高 于 细 菌 和 酵 母 和 昆 虫 细 胞 。 启 动 子 可 使 克 隆 的 外 源 基 因 高 水 平 表 达 的 最 佳 启 动 子 ， 必 须 具 备 后 面 这几 个 条 件1. 它 必 须 是 一 种 强 启 动 子 ， 能 够 使 克 隆 基 因 的 蛋 白 质 产 物

5、的 表 达 量 占 细 胞 总 蛋 白 的 10 30 以 上 。2. 这 个 启 动 子 应 能 呈 现 出 一 种 低 限 的 基 础 转 录 水 平 。 3. 这 种 启 动 子 应 是 诱 导 型 的 ， 能 通 过 简 单 的 方 式 使 用 廉 价 的诱 导 物 而 得 以 诱 导 。 如 在 大 批 量 的 蛋 白 质 制 备 中 ， 热 和 化 学 诱 导 便 是 两 种 广 泛使 用 的 方 式 。 IPTG是 杂 种 强 启 动 子 tac和 trc的 一 种 有 效 的 化 学 诱 导 物 。但 对 于 人 类 临 床 药 用 蛋 白 质 的 大 批 量 制 备 ， IP

6、TG则 不 是 理 想的 诱 导 物 ， 因 为 它 有 毒 性 。 编 码 热 敏 感 lac阻 遏 物 的 温 度 敏 感 突 变 体 lacI基 因 ， 为 诱导 1ac及 其 派 生 启 动 子 提 供 了 方 便 的 手 段 。 1.在 启 动 子 tac的 一 10和 一 35元 件 之 间 有 一 段 17bp的 间 隔序 列 。2.核 糖 体 结 合 位 点 ,RBS 由 ShineDalgarno,SD序 列 及 其后 的 一 段 富 含 AT碱 基 的 转 译 间 隔 区 组 成 ， 间 隔 区 的 最 适长 度 约 为 8个 碱 基 。3.在 转 译 起 始 期 间 ，

7、SD序 列 与 16srRNA的 3末 端 发 生 作 用 。4.三 个 起 始 密 码 子 及 其 在 大 肠 杆 菌 中 的 使 用 频 率 。 三 个 终止 密 码 子 中 其 后 连 着 U的 UAA是 大 肠 杆 菌 最 有 效 的 转 译 终止 密 码 子 。 1. 调 节 基 因 R 编 码 阻 遏 物 ， 可 调 节 启 动 子 的活 性 ， 它 既 可 以 存 在 于 表 达 载 体 上 ， 也 可 以是 整 合 在 寄 主 染 色 体 上 。2. 转 录 终 止 子 ， TT 可 使 mRNA和 载 体 分 子 稳定 。 抗 菌 素 抗 性 基 因 ， ter为 载 体 提

8、 供 了 表型 选 择 记 号 ， 复 制 起 点 ， 0ri决 定 着 载 体 的拷 贝 数 。 克 隆 载 体 克 隆 质 粒 载 体基 因 克 隆 的 目 的 不 仅 是 为 了 获 得 大 量 的 克 隆 在 载 体 上 的 DNA片 段 ， 而 且 还 要 考 虑 后 续 实 验 如 测 序 ， 表 达 ， 突 变 的 要 求 。 pGEM-T和 pGEM-T Easy载 体1. PCR扩 增 中 常 用 的 DNA聚 合 酶 Taq DNA聚 合 酶 可 以 不 需 要 模 板在 PCR产 物 上 加 一 个 A， 一 些 生 物 公 司 根 据 这 一 特 点 研 究 制了 T载

9、 体 。2. 在 pGEM-T载 体 的 两 边 还 分 别 有 一 个 限 制 性 内 切 酶 BstZ I的识 别 位 点 ， 如 果 在 外 源 DNA片 段 上 没 有 该 酶 的 识 别 位 点 ， 只用 该 酶 就 可 以 将 外 源 基 因 完 整 的 切 下 来 ， 根 据 酶 切 片 段 的大 小 对 重 组 质 粒 进 行 签 定 。 在 pGEM-T Easy质 粒 的 插 入 点 两边 ， 增 加 了 EcoR I和 Not I酶 切 位 点 ， 使 外 源 DNA片 段 的 鉴定 更 加 容 易 。 表 达 质 粒 载 体1. 原 核 表 达 质 粒 载 通 常 须

10、具 有 一 个 强 的 启 动 子 ， 一 个 位 于启 动 子 和 起 始 密 码 子 ATG之 间 的 核 糖 体 结 合 序 列 以 及 位 于外 源 基 因 插 入 序 列 下 游 的 转 录 终 止 序 列 。2. 原 核 表 达 载 体 常 用 的 启 动 子 lac启 动 子 较 早 使 用 的 启 动 子 ， 来 自 大 肠 杆 菌 的 乳 糖 操 纵 子 ， 常 用 IPTG诱 导 ， 启 动外 源 基 因 的 表 达 。 trp启 动 子 来 自 大 肠 杆 菌 的 色 氨 酸 操 纵 子 ， 表 达 载 体 上 的 启 动 子 常 常 包 含 操 纵 子 的启 动 基 因

11、 ， 操 纵 基 因 和 部 分 trpE基 因 ， 删 除 了 衰 减 子 序 列 ， 在 -吲 哚 丙氨 酸 的 诱 导 下 ， 转 录 水 平 比 大 肠 杆 菌 中 的 正 常 启 动 子 提 高 8到 10倍 。 tac启 动 子 是 一 组 由 lac和 trp启 动 子 人 工 构 建 的 杂 合 启 动 子 ， 但 仍 可 以 用 IPTG诱 导 ，tac是 一 个 非 常 强 的 启 动 子 ， 由 tac启 动 子 启 动 的 基 因 的 转 录 水 平 比 lac和trp启 动 子 高 。 PL启 动 子 来 自 噬 菌 体 ， 也 是 一 个 非 常 强 的 启 动 子

12、 。 受 噬 菌 体 阻遏 基 因 cI编 码 的 阻 遏 蛋 白 的 控 制 ， 表 达 载 体 的 宿 主 菌 带 有一 个 cI基 因 温 度 敏 感 突 变 体 ， 它 表 达 的 阻 遏 蛋 白 在 2830 才 有 活 性 ， 能 够 阻 抑 启 动 子 的 表 达 ； 当 温 度 提 高 到42 时 ， 它 的 表 达 产 物 失 去 活 性 ， 启 动 子 能 够 转 录 外 源 基因 。 这 种 温 度 诱 导 的 特 性 是 以 PL为 表 达 载 体 的 一 大 优 点 。 T7启 动 子 来 自 于 T7噬 菌 体 ， 有 该 启 动 子 并 在 T7 RNA聚 合 酶

13、 驱 动 下 表达 外 源 基 因 的 大 肠 杆 菌 质 粒 称 为 pET表 达 载 体 家 族 。 T7噬 菌 体 RNA聚 合 酶 不 仅 能 够 选 择 性 的 与 T7启 动 子 结 合 ，而 且 在 不 降 低 启 动 效 率 的 前 题 下 ， 其 沿 DNA模 板 合 成 mRNA的速 度 比 大 肠 杆 菌 RNA聚 合 酶 快 5 倍 ， 因 此 提 高 了 对 外 源 基 因的 转 录 水 平 。 pET表 达 系 统 表 达 外 原 蛋 白 必 须 使 用 特 殊 的 大 肠 杆 菌 受 体 菌 ，如 BL21和 HNS174。 这 些 菌 株 是 噬 菌 体 的 溶

14、 源 衍 生 菌 ， 其 染 色 体 上 含 有 PlacUV5启 动 子 控 制 下 的 T7 RNA聚 合 酶 基 因 。 pET表 达 系 统 是 一 个 基 因 表 达 的 级 联 反 应 ， IPTG首 先 诱 导 PlacUV5启 动 子 表 达 T7 RNA聚 合 酶 ， T7 RNA聚 合 酶 再 选 择 性 的结 合 T7启 动 子 启 动 外 源 基 因 的 转 录 。 pcDNA3.1/His表 达 载 体 pCDNA3.1/His表 达 载 体 是 Invitrogen公 司 的 产 品 ， 载 体 采 用 人巨 细 胞 病 毒 的 立 即 早 期 启 动 子 ， 用

15、来 在 哺 乳 动 物 细 胞 内 获 得 高 表达 的 外 源 基 因 及 进 行 基 因 功 能 的 研 究 。 pCDNA3.1/His载 体 是 一 种 穿 梭 质 粒 表 达 载 体 ， 带 有 pUC质 粒 的 复制 起 点 和 ampr基 因 ， 可 以 在 大 肠 杆 菌 内 扩 增 和 选 择 重 组 转 化 子 ，同 时 载 有 SV40的 复 制 起 点 和 新 霉 素 抗 性 基 因 ， 可 以 在 表 达 SV40T抗原 的 细 胞 内 复 制 并 选 择 重 组 转 化 子 。 表 达 载 体 起 始 密 码 子 下 游 有 一 段 编 码 6个 组 氨 酸 的 D

16、NA片 段 及 编 码一 段 短 肽 DLYDDDDK的 DNA片 段 ， 外 源 基 因 克 隆 在 这 些 基 因 的 上 游 ，构 成 融 合 基 因 。 此 融 合 基 因 能 够 表 达 目 的 蛋 白 和 组 氨 酸 ， 故 通 过 标 记 组 氨 酸 可 分 离纯 化 目 的 融 合 蛋 白 ， 组 氨 酸 可 以 作 为 检 测 融 合 蛋 白 的 标 签 。 在 表 达 载 体 上 设 计 有 蛋 白 酶 的 识 别 和 切 割 位 点 ， 用 蛋 白 酶 可 以 切 除融 合 蛋 白 上 非 目 的 蛋 白 的 氨 基 因 酸 序 列 如 组 氨 酸 和 DLYDDDDK短

17、 肽 。 组 织 纤 溶 酶 原 激 活 物 克 隆 表 达 tPA 纤 溶 酶 原 纤 溶 酶 水 解 纤 维 蛋 白 （ 可 用 于 血凝 块 的 溶 解 ， 治 疗 血 栓 梗 塞 性 疾 病 ） tPA基 因 （ 信 号 肽 和 tPA CDNA） 表 达 载 体 重 组 载 体 转 染 哺 乳 动 物 细 胞 用 HAT培 养 基 选 择 出 稳 定 的 转 染 细 胞 细 胞 表 达 低 水 平 的 tPA Mtx（ 氨 甲 蝶 呤 ） 筛 选 细 胞 表 达高 水 平 的 tPA 细 胞 在 发 酵 器 培 养 tPA分 泌 tPA于 培 养液 中 。 DNA限 制 性 内 切

18、酶 消 化 DNA限 制 性 内 切 酶 消 化 是 基 因 分 析 中 的 关 键 步 骤 ， 内 切 酶 是 最 关键 的 工 具 酶 。 限 制 性 内 切 酶 是 一 类 具 有 严 格 识 别 位 点 ， 并 在 识 别位 点 内 或 附 近 切 割 双 链 DNA 的 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 。 酶 单 位 规 定 为 在最 适 应 条 件 下 小 时 完 全 消 化 1 DNA的 酶 量 为 个 单 位 。 影 响 限 制 性 内 切 酶 活 性 的 因 素 包 括 DNA的 纯 度 、 缓 冲 液 、 温 度及 酶 本 身 。 DNA甲 基 化 ， 含 有 蛋 白 质 或

19、高 分 子 量 DNA胶 体 溶 液 太 粘稠 均 会 降 低 内 切 酶 的 消 化 效 率 。 由 于 在 限 制 性 内 切 酶 消 化 反 应 中 ，甘 油 浓 度 超 过 5 会 抑 制 内 切 酶 活 性 ， 因 此 在 20 l反 应 体 系 中 ，甘 油 浓 度 应 少 于 1 l。 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 对 缓 冲 液 中 盐 浓 度 的要 求 各 不 相 同 。 缓 冲 液 一 般 分 为 高 、 中 、 低 盐 种 。 一 般 使 用 厂家 提 供 的 与 酶 配 套 的 缓 冲 液 。 在 需 进 行 双 酶 切 反 应 时 ， 可 采 用 以 下 不 同

20、 的 方 法 进 行 。 如 果 两 种 酶的 反 应 缓 冲 液 相 同 或 相 近 ， 可 以 同 时 加 入 两 种 酶 进 行 酶 切 ， 但 反 应体 积 应 稍 大 些 ， 以 免 甘 油 浓 度 过 高 ， 影 响 酶 的 活 性 。 如 果 相 差 甚 远 ，则 必 须 如 下 进 行 ： 在 第 个 酶 酶 解 反 应 完 毕 后 ， 采 用 乙 醇 沉 淀 ，回 收 已 线 性 化 的 DNA， 再 建 立 第 个 酶 切 体 系 ， 继 续 酶 解 。 也 可先 用 低 盐 浓 度 的 酶 进 行 酶 解 ， 等 酶 解 完 全 后 ， 补 加 NaCl及 相 差 的 化

21、学 成 分 或 调 节 pH然 后 再 加 入 第 种 酶 继 续 酶 解 。 如 果 两 个 酶 的 反应 条 件 只 是 温 度 上 的 差 别 ， 可 以 先 加 一 种 酶 进 行 酶 解 ， 然 后 加 入 另一 种 酶 在 相 应 的 温 度 下 酶 解 。 酶 解 反 应 主 要 应 用 于 质 粒 的 酶 切 鉴 定 。 典 型 的 反 应 是 20 l体 积 中 含 0.21 gDNA。 酶 切 反 应 体 系 如 下 质 粒 DNA 10 l 10 缓 冲 液 2 l 限 制 酶 1 l 双 蒸 去 离 子 水 7 l 总 体 积 20 l 操 作 方 法 按 下 列 顺

22、序 加 入 试 剂 (1)在 一 灭 菌 的 新 的 Eppendorf管 中 加 入 7 l双 蒸 水 。 (2)加 入 10 缓 冲 液 2 l。 (3)加 限 制 酶 1 l (4)最 后 加 入 质 粒 DNA10 l。 (5)稍 离 心 ， 混 合 。 (6)37 水 浴 1 2h。 (7)取 出 后 电 泳 分 析 鉴 定 是 否 酶 解 。 注 意 问 题1. 双 蒸 水 为 可 变 体 积 ， 当 其 它 反 应 成 分 确 定 后 ， 用 双 蒸 水 将 反 应 体 积 补 足 。2. 为 保 持 限 制 酶 的 活 性 ， 将 酶 从 低 温 冰 箱 取 出 后 立 即 置

23、 于 预 先 准 备 的 冰 浴 中 ， 操 作 应 迅 速 ， 用 后 立 即 放 回 低 温 水 箱 中 。3. 大 多 数 酶 多 以 浓 缩 液 存 放 ， 吸 取 时 需 严 格 取 量 。4. 若 要 取 用 多 种 酶 ， 每 种 酶 必 须 单 独 使 用 吸 头 ， 避 免 交 叉 污 染 。5. 大 多 数 限 制 酶 均 加 50 甘 油 缓 冲 液 置 于 -20 保 存 ， 其 活 力 稳 定 ， 但 在 配 制 反 应 混 合 物 时 ， 酶 的 加 入 量 要 准 确 ， 小 于 总 体 积 的 1/10，否 则 甘 油 会 抑 制 酶 解 反 应 。 UNIQ-

24、10质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒 DNA 本 试 剂 盒 的 核 心 是 UNIQ-10柱 。 柱 的 底 部 有 一 层 由Sangon研 制 开 发 的 惰 性 大 分 子 材 料 ， 它 能 选 择 性 吸 附 核 酸物 质 ， 不 吸 附 蛋 白 质 ， 多 糖 和 其 它 物 质 。 DNA与 UNIQ-1 0的 结 合 需 要 一 定 的 离 子 强 度 。 抽 提 质 粒 时 ， 细 菌 用 常 规 的 碱裂 解 ， 离 心 除 去 基 因 组 D NA。 含 质 粒 的 上 清 液 加 入 到UNIQ-1 0拄 中 ， 经 简 单 的 洗 涤 步 骤 除 去 非

25、特 异 性 结 合 的 杂质 。 所 要 抽 提 的 质 粒 用 Elution Buffer， TE或 者 水 洗 脱 。质 粒 DNA提 取 操 作 步 骤1 将 过 夜 培 养 的 1 2ml细 菌 12， 000rpm离 心 15秒 ， 彻 底 去 除 上 清 。 注 意 ： 对 于 低 拷 贝 数 的 质 粒 ， 请 用 2 5ml细 胞 ， 同 时 按 比 例 相 应 提 高 Solution l， lI和 llI的 用 量 。 在 执 行 步 骤 5后 ， 将 上 清 分 批 加 入 到 UNlQ-10柱 中 ， 重 复 步 骤 6， 直 至 处 理 完 所 有 样 品 。2.

26、加 入 100 l Solution I， 用 枪 头 或 振 荡 器 充 分 悬 浮 细 菌 。3 加 入 200 l Solution II， 立 即 温 和 混 匀 (倾 斜 45度 角 ， 顺 一 个 方 向 ， 慢 慢 旋 转 离 心 管 )， 使 细 菌 裂 解 ， 室 温 放 置 2分 钟 。 注 意 ： 不 能 剧 烈 混 合 ， 否 则 会 出 观 基 因 组 DNA污 染 。4 加 入 350 l SoIution llI 立 即 上 下 颠 倒 5 10次 ， 使 之 充 分 中 和 ， 室 温 放 置 2分 钟 。 5. 12， 000rpm， 离 心 5分 钟 。 6

27、 将 步 骤 5中 上 清 转 移 到 套 放 于 2.0 ml收 集 管 内 的 UNIQ-10柱 中 ， 8， 000rpm室 温 离 心 15秒 。 注 意 ： 不 要 吸 取 沉 淀 ， 否 则 会 出 现 基 因 组 DNA和 蛋 白 质 污 染 。7. 弃 收 集 管 中 的 废 液 ， 将 UNlQ-10柱 放 入 同 一 支 收 集 管 中 ， 吸 取 500 l Wash Solution至 UNIQ-1O柱 ， 10， 000rpm室 温 离 心 30秒 。8 重 复 步 骤 7。9 弃 收 集 管 中 的 废 液 ， 将 UNIQ-10柱 放 入 同 一 支 收 集 管

28、中 ， 1O， 000rpm室 温 离 心 30秒 以 彻 底 去 除 Wash SOlutiOn。1 0 将 UNIQ-10柱 放 入 新 的 洁 净 1.5 ml离 心 管 中 ， 加 50 l Elution Buffer， 室 温 放 置 2分 钟 后 ， 10,000rpm室 温 离 心 1分 钟 。 离 心 管 中 的 溶 液 即 为 所 抽 提 的 质 粒 DNA。 注 意 ： 如 果 要 提 高 质 粒 的 浓 度 ， 可 以 用 30 l Elution Buffer,37 或 50 下 放 置 2分 钟 ， 10,000rpm室 温 离 心 1分 钟 。 DNA体 外 连

29、接 利 用 DNA连 接 酶 把 目 的 DNA片 段 和 载 体 DNA连 接 在 一 起 ， 成 为 一 个新 的 重 组 分 子 ， 这 就 是 基 因 工 程 中 常 说 的 DNA体 外 连 接 。 目 的 DNA片 段 被 限 制 酶 消 化 后 其 末 端 只 可 能 有 三 种 形 式 1.带 有 相 同 的 粘 性末 端 ： 用 同 一 种 酶 或 同 尾 酶 处 理 可 得 这 样 的 末 端 。 由 于 质 粒 载 体也 必 须 用 同 样 的 酶 消 化 ， 亦 得 两 个 相 同 的 粘 性 末 端 ， 因 此 在 连 接反 应 中 ， 外 目 的 基 因 片 段 和

30、 质 粒 载 体 DNA均 可 能 发 生 自 身 环 化 ， 而 且 正 反 两 种 连 接 方 向 都 有 。 为 防 止 载 体 DNA自 身 环 化 ， 在 连 接 前需 除 去 载 体 分 子 5 -p， 使 之 最 大 限 度 地 抑 制 载 体 环 化 现 象 。 2.带 有 非 互 补 的 粘 端 用 两 种 不 同 的 限 制 酶 进 行 消 化 可 以 产 生 这 样 的末 端 。 一 般 情 况 下 ， 常 用 质 粒 载 体 的 多 克 隆 位 点 总 能 找 到 若 干 个 不 同的 酶 单 酶 切 位 点 ， 用 同 样 两 种 酶 消 化 载 体 后 ， 可 将

31、外 源 目 的 片 段 定 向克 隆 到 载 体 上 。 3.带 有 平 末 端 由 产 生 平 末 端 的 限 制 酶 或 核 酸 外 切 酶消 化 产 生 ， 或 由 DNA聚 合 酶 Klenow片 段 补 平 3凹 陷 ， 使 不 相 匹 配 的 末端 转 变 为 平 端 所 致 。 成 功 的 连 接 反 应 需 纯 净 的 目 的 DNA片 段 ， 相 对 应 的 末 端 浓度 。 一 般 采 用 插 入 片 段 与 载 体 DNA分 子 数 比 3 5:1。 目 的基 因 比 例 太 多 ， 易 产 生 基 因 自 连 后 插 入 载 体 的 多 聚 体 ，根 据 插 入 片 段

32、 和 载 体 的 分 子 量 大 小 、 计 算 连 接 反 应 体 系中 需 要 加 入 的 各 DNA 片 段 含 量 。 粘 性 末 端 连 接 碱 性 磷 酸 酶 去 除 5 磷 酸 基 团 1.建 立 下 列 的 反 应 系 线 性 化 载 体 10 l 10 CIP缓 冲 液 2 l 碱 性 磷 酸 酶 CIP 0.5 l 双 蒸 水 7.5 l 2.37 水 浴 15min 3.再 加 CIP 0.5 l， 置 55 水 浴 45min 4.加 2 l0.5mol/L EDTA, 65 灭 活 15min 5.乙 醇 沉 淀 ， TE溶 解 。 载 体 与 目 的 DNA片 段

33、的 连 接1. 在 0.5ml EP管 中 建 立 连 接 反 应 体 系 线 性 化 目 的 基 因 （ 0.4 g） 4 l 载 体 DNA （ 经 CIP处 理 ） 1 l 10 连 接 缓 冲 液 1 l T4DNA连 接 酶 1 l H2O 至 10 l2. 16 水 浴 12 6h。3. 取 2 5 l连 接 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 。 平 粘 端 连 接 1.制 备 目 的 基 因 酶 切 片 段 （ 如 二 端 均 为 EcoRI粘 端 ） 。 2.制 备 载 体 酶 切 片 段 （ 一 端 为 EcoRI粘 端 ， 一 端 为 其 它 酶 切 的 粘 端

34、） 。 3.用 T4连 接 酶 连 接 匹 配 的 粘 末 端 （ 另 一 端 不 匹 配 ， 没 有 连 接 ） 。 4.用 Klenow补 平 不 匹 配 的 粘 末 端 目 的 DNA和 /或 线 性 载 体 0.5 g 10 Klnow buffer 2 l klenow片 段 1 l 2mmol/L dNTP 2 l H2O 至 20 l 5.37 水 浴 1h， 乙 醇 沉 淀 ， 溶 于 7 lTE（ pH8.0） 。 6.取 上 述 5 lTE， 加 1 l连 接 缓 冲 液 ， 1 l连 接 酶 ， ddH 2O 13 l作 用 16 20h。 7.电 泳 观 察 连 接 效

35、 果 （ 2 lTE 来 自 5,作 连 接 前 对 照 ） 并 估 计 含 量 。 8.取 适 量 作 转 化 。 重 组 DNA的 转 化 转 化 是 将 外 源 DNA分 子 导 入 到 受 体 细 胞 ， 使 之 获 得 新 的 遗 传 特 性 的一 种 方 法 。 转 化 所 用 的 受 体 细 胞 一 般 是 限 制 修 饰 系 统 缺 陷 变 异 株 ，即 不 含 限 性 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 。 将 对 数 生 长 期 的 细 菌 经 理 化 方 法 处理 后 ， 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 暂 时 性 改 变 ， 成 为 能 允 许 外 源 DNA分 子进

36、入 的 感 受 态 细 胞 。 进 入 受 体 细 胞 的 DNA分 子 通 过 复 制 和 表 达 实 现遗 传 信 息 的 转 移 ， 使 受 体 细 胞 具 有 了 新 的 遗 传 性 状 。 将 经 过 转 化 的细 胞 在 筛 选 培 养 基 上 培 养 ， 可 筛 出 带 有 异 源 DNA 分 子 的 细 胞 。 试 剂 及 仪 器 1. LB液 体 培 养 基 2. LB固 体 培 养 基 液 体 培 养 基 中 加 1.5 琼 脂 糖 3. 0.1mol/L CaCl2 4. 抗 菌 素 5. 培 养 箱 6. 恒 温 摇 床 7. 无 菌 操 作 台 受 体 菌 的 培 养

37、 1. 将 甘 油 贮 存 受 体 菌 EColi DH5 在 LB平 板 上 划 线 37 培 养 过 液 。 2. 从 平 板 上 挑 取 单 菌 落 接 种 于 1ml LB液 体 培 养 基 中 ， 37 振 摇 过 夜 。 3. 取 200 300 l菌 液 转 入 50ml LB液 体 中 ， 37 振 荡 培 养 2.5 3h 对 数 生 长 期 A600=0.3 0.5 感 受 态 细 胞 的 制 备1.将 培 养 的 菌 液 冰 上 放 置 10min， 倒 入 离 心 管 内 4000rpm 10min。2.弃 上 清 ， 将 离 心 管 倒 置 于 吸 水 纸 上 ， 控

38、 干 。3.沉 淀 轻 悬 于 10ml预 冷 的 0.1mol/L CaCl2中 ， 冰 浴 15min。 此 时为 感 受 态 细 胞 。4.4000rpm， 4 离 心 10min， 弃 上 清 ， 沉 淀 悬 于 2ml 0.1mol/L CaCl2中 。5.分 装 成 100 l/小 份 于 EP管 中 。 贮 存 12-24h可 增 加 转 化 效 率 ， 超 过 24h效 率 下 降 。 转 化1. 加 外 源 DNA 100 500ng(小 于 5 l)与 100 l感 受 态 细 胞 混 匀 ， 冰 浴 30min（ 阴 性 对 照 同 时 进 行 ） 。2.将 管 转 移

39、到 42 水 浴 中 加 热 冲 击 90秒 或 37 5min, 迅 速 置 冰 浴 冷 却 3 5min。3. 加 400 l LB， 37 轻 摇 培 养 45min（ 使 抗 性 基 因 表 达 ） 。4. 取 100 l涂 布 于 筛 选 平 板 上 （ 加 抗 菌 素 ） ， 对 照 菌 涂 布 于 另 一筛 选 平 板 。 5. 室 温 至 液 体 吸 收 后 ， 37 培 养 过 夜 。 重 组 DNA转 化 受 体 细 胞 后 ， 须 在 不 同 水 平 上 进 行 筛 选 ， 以 区别 转 化 子 与 非 转 化 子 ， 重 组 子 与 非 重 组 子 以 及 鉴 定 所

40、需 的 特 异性 重 组 子 。 在 转 化 过 程 中 ， 并 非 每 个 受 体 细 胞 都 被 转 化 ； 即 使获 得 转 化 细 胞 ， 也 并 非 都 含 目 的 基 因 ， 所 以 需 采 用 有 效 方 法 进行 筛 选 。 重 组 质 粒 的 筛 选 插 入 失 活 法 筛 选 原 理 该 法 选 用 于 含 有 个 以 上 选 择 标 志 的 载 体 ， 如 pBR322 带 有 氨 卞 青 霉 素 和 四 环 素 抗 性 基 因 。 若 将 外 源 基 因 插 入 tet基 因 区 后 ， 则 该 基 因 失 活 ， 所 构 建 的 重 组 质 粒 转 化 菌 落 只 能

41、 在 Ap存 在 下 生 长 ， 而 不 能 在 tet存 在 下 生 长 。 据 此 ， 判 断 含 有 重 组 质 粒 的 菌 落 。 操 作 1. 制 备 LB琼 脂 培 养 板 分 别 含 有 Ap和 tet。 2. 将 100 l转 化 菌 液 用 无 菌 玻 璃 涂 布 器 分 别 均 匀 涂 布 于 含 Ap培 养 板 表 面 ， 置 37 培 养 箱 20min后 倒 置 培 养 12 16h。 3. 挑 取 转 化 菌 落 并 分 别 接 种 于 Ap培 养 板 和 tet 培 养 板 的 互 相 对 应 的 位 置 上 ， 37 培 养 12 16h。 4. 挑 选 在 A

42、p培 养 板 生 长 而 在 tet 培 养 板 不 能 生 长 的 菌 落 ， 并 将 其 接 种 于 含 Ap的 LB液 体 培 养 基 5ml中 培 养 8 12h。 5. 小 量 制 备 质 粒 ， 限 制 酶 切 分 析 进 一 步 鉴 定 。 互 补 筛 选 适 用 于 含 有 半 乳 糖 苷 酶 基 因 ， LacZ的 载 体 ， 如 pUC系 列 等 ， 其 原 理 是 载 体 含 有 LacZ的 调 控 序 列 和 N端 146个 氨 基 酸 的 编 码 信 息 。在 这 个 编 码 区 中 插 入 了 一 个 多 克 隆 位 点 。 当 这 种 载 体 进 入 可 编 码

43、半 乳 糖 苷 酶 端 部 分 序 列 的 宿 主 细 胞 后 ， 它 们 可 以 融 为 一 体 ，形 成 具 有 酶 学 活 性 的 蛋 白 质 ， 这 种 现 象 叫 互 补 。 由 互 补 而 产生 的 Lac+细 菌 在 呈 色 底 物 5-溴 -4氯 -3吲 哚 - -D-半 乳 糖 苷 ， X-gal和 诱 导 剂 异 丙 基 硫 代 - -D-半 乳 糖 苷 ， IPTG存 在 下 形 成 蓝 色 菌 落 。当 外 源 DNA插 入 到 质 粒 的 多 克 隆 位 点 后 ， 导 致 产 生 无 互 补 能 力的 氨 基 端 片 段 。 因 此 ， 带 有 重 组 质 粒 的

44、细 菌 形 成 白 色 菌 落 。 通 过呈 色 反 应 即 可 初 步 识 别 可 能 带 有 重 组 质 粒 的 菌 落 。 通 过 小 量 制 备质 粒 DNA进 行 限 制 酶 切 分 析 ， 可 确 定 这 些 质 粒 的 结 构 。 试 剂X-gal (20mg/ml) 将 20mgX-gal溶 于 1ml二 甲 基 甲 酰 胺 中 ， -20 避 光 存 。IPTG (200mg/ml) 将 1gIPTG溶 于 4ml去 离 子 双 蒸 水 中 ， 定 容 至 5ml,0.22 m过 滤 器 除 菌 ， -20 保 存 备 用 。 操 作 1. 制 备 含 氨 苄 青 霉 素 的

45、 琼 脂 糖 平 板 。 2. 于 平 板 表 面 加 X-gal 40 l和 IPTG 4 l， 并 用 无 菌 玻 璃 涂 布 器 将 试 剂 均 匀 涂 布 于 整 个 平 板 表 面 。 置 37 1h直 至 所 有 液 体 消 失 。 3. 将 100 l转 化 的 菌 液 涂 布 于 平 板 表 面 ， 置 37 培 养 箱 20min后 ， 倒 置 平 板 继 续 培 养 12 16h。 4. 中 止 培 养 后 ， 将 平 板 置 4 4h， 使 蓝 色 充 分 显 现 ， 平 皿 上 显 示 蓝 色 和 白 色 两 种 菌 落 。 5. 挑 取 白 色 菌 落 置 5ml L

46、B(含 相 应 抗 生 素 Ap)液 体 培 养 基 中 ， 37 摇 床 培 养 8 12h， 提 取 质 粒 ， 限 制 性 酶 切 分 析 进 一 步 鉴 定 。 脂 质 体 介 导 的 转 染脂 质 体 一 种 人 造 的 脂 质 小 泡 ， 外 周 是 脂 双 层 ， 内 部是 水 腔 ， 它 作 载 体 可 以 把 外 源 DNA导 入 培 养 的 哺 乳 动物 细 胞 。 用 超 声 波 处 理 法 ， 已 成 功 地 把 带 有 内 酰 胺 酶 基 因的 重 组 质 粒 DNA装 入 带 正 电 荷 的 脂 质 体 。 这 些 脂 质 体载 体 同 培 养 的 动 物 细 胞

47、一 道 温 育 后 ， 在 细 胞 的 提 取 物中 ， 便 可 测 定 到 内 酰 胺 酶 的 活 性 。 带 HSV-1 tk基 因 的 重 组 质 粒 DNA， 经 脂 质 体 包 装后 ， 成 功 地 导 入 小 鼠 Ltk-细 胞 。 这 种 由 脂 质 体 介 导 的使 外 源 DNA导 入 细 胞 的 方 法 ， 叫 做 脂 质 体 载 体 法 ， 又叫 做 脂 质 转 染 法 。 本 方 法 适 用 于 将 DNA或 RNA转 染 进 入 组 织 培 养 细 胞 。 其 机 制为 阳 离 子 脂 质 ， 如 DOTMA, N-1-(2,3-二 油 酰 氧 )丙 基 N, N,

48、N-三 甲 铵 硫 酸 二 甲 脂 和 DOPE,二 油 酰 磷 脂 酰 乙 胺 在 与 核酸 混 合 后 可 以 形 成 阳 离 子 脂 质 体 从 而 将 核 酸 包 裹 于 其 中 的水 相 。 这 种 脂 质 体 -核 酸 复 合 物 可 以 吸 附 于 细 胞 膜 并 将 核 酸转 移 到 细 胞 内 。 这 一 转 染 方 法 比 磷 酸 钙 法 相 比 ， 其 转 染 效率 要 高 5到 100倍 。 它 应 用 于 将 DNA或 RNA分 子 引 入 真 核 细 胞 。 脂 质 体 载 体 法 阳 离 子 型 的 脂 质 体 具 有 十 分 重 要 的作 用 。 因 为 它 不

49、 仅 能 够 同 带 负 电 荷 的 DNA分 子 结 合 ，也 能 够 同 表 面 为 负 电 荷 的 受 体 细 胞 发 生 强 烈 的 结 合作 用 ， 而 且 还 会 引 起 细 胞 紊 乱 ， 导 致 脂 质 体 与 细 胞膜 之 间 发 生 融 合 作 用 ， 最 终 使 DNA脂 质 复 合 物 进 入 细胞 。 存 在 于 细 胞 质 中 的 DNA脂 质 复 合 物 ， 仍 然 保 持 着完 好 的 结 构 ， 并 有 机 会 以 同 样 的 方 式 与 细 胞 核 膜 发生 相 互 作 用 ， 并 进 入 核 内 。 DNA脂 质 复 合 物 转 染 法 将 外 源 DNA

50、与 阳 离 子 型 的 脂质 体 混 合 形 成 DNA脂 质 复 合 物 。 这 种 复 合 物 可 有 效地 被 受 体 细 胞 捕 获 ， 实 现 基 因 的 高 频 率 转 移 ， 这 种方 法 为 DNA脂 质 复 合 物 转 染 法 。 在 这 个 过 程 中 ， DNA并 不 是 被 包 装 在 脂 质 体 的 内 部 ， 而 是 通 过 两 者 之 间的 静 电 引 力 作 用 结 合 在 一 起 的 。 操 作 方 法1. 在 转 染 之 前 ， 将 细 胞 接 种 于 60mm 15mm培 养 皿 上 ， 培 养 24小 时 。2. 用 MEM培 养 基 洗 涤 单 层 细

51、 胞 一 次 。3. 在 5ml聚 丙 乙 烯 试 管 中 加 入 下 列 试 剂 1.5 ml无 血 清 的 MEM培 养 基 50 l Lipofectin， 1mg/ml GIBCO BRL产 品 在 另 一 只 聚 丙 乙 烯 试 管 中 加 入 1.5 ml 无 血 清 的 MEM培 养 基 50 l DNA或 RNA 5 19g 在 加 入 每 一 项 后 混 匀 。4. 吸 去 培 养 皿 中 的 培 养 基 。5. 将 两 只 试 管 内 的 溶 液 合 并 ， 并 用 移 液 管 抽 吸 混 匀 。 6. 将 上 述 液 体 小 心 吸 取 3 ml转 移 至 培 养 皿 上

52、 ， 注 意 不 要 破 坏 细 胞层 。7. 在 37 将 细 胞 培 养 过 夜 。8. 次 日 早 晨 ， 吸 去 旧 培 养 基 ， 并 加 入 含 20%小 牛 血 清 的 MEM培 养 基 。9. 继 续 培 养 48 72小 时 ， 而 后 收 集 细 胞 用 于 抽 提 及 下 步 实 验 。 注 意 问 题1. 目 前 许 多 分 子 生 物 学 公 司 均 生 产 不 同 的 产 品 用 于 阳 离 子 脂 质体 介 导 的 转 染 。 如 GIBCO BRL公 司 的 Lipofectin和Boehringer Mannheim 公 司 的 DOTAP。2. 不 必 用

53、无 血 清 培 养 基 洗 涤 细 胞 。 在 配 制 脂 质 体 核 酸 混 合 液时 必 须 使 用 无 血 清 的 培 养 基 。 因 为 血 清 可 以 抑 制 核 酸 与 脂 质体 之 间 的 相 互 作 用 。3. 为 了 取 得 最 佳 转 染 效 果 ， 对 于 Lipofectin的 用 量 ， 核 酸 用 量以 及 细 胞 与 Lipofectin和 核 酸 复 合 物 共 同 保 温 时 间 的 最 佳 长度 等 问 题 ， 都 必 须 根 据 不 同 的 细 胞 株 而 决 定 。 TA克 隆 系 统 由 Invitrogen公 司 发 展 而 来 的 商 业 性 试

54、剂 盒 ， 它 用 于PCR产 物 的 克 隆 和 测 序 。 TA克 隆 是 一 种 一 步 到 位 的 把 PCR产 物 直 接插 入 到 质 粒 载 体 的 方 法 。 TA克 隆 系 统 利 用 热 稳 定 的 TaqDNA聚 合 酶在 DNA双 链 分 子 的 3 末 端 加 上 一 个 腺 苷 酸 。 这 个 3 A突 出 端 被 用于 把 PCR产 物 直 接 插 入 到 有 一 个 3 T突 出 端 的 载 体 。 制 备 好 的 载 体 ，其 关 键 部 分 是 带 有 3 T突 出 端 的 线 形 分 子 。PCR产 物 的 TA克 隆 PCR扩 增 PCR产 物 在 任

55、何 情 况 下 都 可 用 于 TA克 隆 ， 但 是 带 有3 至 5 外 切 酶 活 性 的 聚 合 酶 应 尽 量 不 用 ， 这 是 因 为 克 隆的 效 率 极 低 。 除 非 PCR产 物 是 多 种 系 的 ， 否 则 一 般 没 有 必要 纯 化 PCR产 物 。 连 接 ddH2O 5l 10 连 接 缓 冲 液 1l PCR载 体 2l PCR产 物 1l T4 DNA连 接 酶 1l 12 保 温 4 12小 时 。 转 化 在 冰 上 融 化 0.5mol/L 巯 基 乙 醇 和 一 小 管 感 受 态 细 胞 ， 体 积 约 为 100l。 加 2l 0.5 mol/

56、L 巯 基 乙 醇 于 细 胞 中 并 轻 轻 敲 打 使 之 混 合 。 加 1l连 接 混 合 物 于 细 胞 中 ， 轻 轻 敲 打 。 冰 浴 30分 钟 。 42 保 温 30秒 ， 并 把 小 管 置 于 冰 上 2分 钟 。 加 450l预 热 的 SOC培 养 基 于 小 管 中 ， 225rpm/min 37 振 荡 培 养 1小 时 。 铺 25l X-Gal（ 40 mg/ml, 溶 于 DMSO中 ） 和 5l IPTG ( 200mg/ml)于 LB平 板 之 上 ， 并 等 30分 钟 。 铺 25l和 100l转 化 混 合 物 于 分 离 平 板 上 。 37

57、倒 置 培 养 20 40小 时 。 挑 选 白 色 的 菌 落 进 行 质 粒 电 泳 分 析 和 限 制 性 酶 切 分 析 ， PCR扩 增 以 及 测 序 。 蓝 色 菌 落 是 无 插 入 片 段 的 载 体 。 PCR产 物 的 鉴 别 PCR载 体 大 小 为 3.0kb。 克 隆 区 含 有 许 多 限 制 性 酶 切 位 点 。 载 体也 包 含 有 M13正 向 引 物 和 反 向 引 物 位 点 。 所 以 用 于 PCR扩 增 的 引 物 及 用于 这 种 载 体 的 引 物 都 能 应 用 于 测 序 和 PCR鉴 别 。 从 筛 选 出 的 克 隆 中 提 取质 粒

58、 ， 然 后 用 下 面 的 方 法 来 区 分 插 入 片 段 是 否 为 PCR产 物 。 限 制 性 内 切 酶 切 分 析 。 Hind III 和 EcoR I对 载 体 的 酶 切 可 以 释 放 PCR 产 物 片 段 。 PCR产 物 片 段 也 可 以 用 其 它 限 制 性 内 切 酶 酶 切 分 析 。 带 有 PCR引 物 的 重 组 载 体 的 PCR扩 增 应 能 产 生 同 样 大 小 的 产 物 。 用 于 载 体 的 引 物 和 应 用 于 PCR扩 增 的 引 物 都 能 对 插 入 片 段 进 行 测 序 分 析 。 转 基 因 动 物 把 外 源 基 因

59、 导 入 动 物 的 受 精 卵 ， 再 将 这 一 受 精 卵 接 种 到 寄 养 雌 性动 物 ， foster mother的 子 宫 内 ， 使 之 发 育 繁 殖 。这 时 外 源 基 因 与 动 物 本 身 的 基 因 整 合 ， 外 源 基 因 就 能 随 细 胞 分 裂而 增 殖 ，在 体 内 得 到 表 达 ， 并 能 传 给 下 一 代 。这 样 培 育 的 动 物 称 为 转 基 因 动 物 。 最 早 完 成 的 是 转 基 因 小 鼠 。 雌 性 鼠 （ 卵 ） 雄 性 鼠 （ 精 子 ） 受 精 卵 从 输 卵管 洗 出 用 显 微 注 射 法 在 前 核 内 注

60、入 感 兴 趣 的 异 体DNA 把 卵 细 胞 移 植 于 借 腹 怀 孕 的 雌 性 小 鼠 雌性 小 鼠 产 生 多 胎 新 生 小 鼠 DNA分 析 鉴 定 转 基 因 小鼠显 微 注 射 法 将 克 隆 的 异 体 基 因 注 入 受 精 卵 受 精 卵 2个 前 核 ， Pronucleu, 一 个 来 自 精 子 ， 一 个 来 自 卵 细 胞 。 2Pl 体 积 的 溶 液 （ 含 几 百 个 拷 贝 ） ， 直 接 注 入 一 个 前 核 内 。受 精 卵 移 入 寄 养 雌 性 动 物 的 输 卵 管 内 子 宫 内 着 床 发 育 成 熟转 基 因 小 鼠 ， trans

61、genic mice携 带 异 种 DNA的 小 鼠转 基 因 transgene异 种 DNA 转 基 因 家 兔 ， 猪 ， 羊 转 入 的 基 因 是 生 长 激 素 （ hGH） 观 察 方 法 检 测 hGH mRNA 在 转 基 因 动 物 中 的 表 达 并 可 测 量 hGH的 产 生 。 转 基 因 动 物 本 身 的 增 大 来 观 察 hGH是 否 表 达 。 成 功 率 低 2000个 注 射 卵 ， 只 有 一 个 卵 产 生 转 基 因 动 物 。 转 基 因 牛 1000个 受 精 卵 ， 129个 发 育 成 胚 胎 ， 产 生 19个 牛 仔 ， 2头 含 组 入 基 因 组 中 的 异 体 DNA。