酶的生产与分离纯化瑶瑶

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1、 组 织 提 取发 酵 生 产化 学 及 生 物 合 成 集 中 垄 断 ， 市 场 全 球 化 ： 丹 麦 诺 和 诺 得 公 司 （ 诺 维 信 novozymes） 美 国 杰 能 科（ Genencor） 、 芬 兰 科 特 和 丹 麦 丹 尼 斯 克 国 际 以 液 体 、 颗 粒 为 主 。 国 内 糖 化 酶 、 -淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 三 大 类 重 要 产 品 系 列 果 胶 酶 、 低 温 碱 性 蛋 白 酶 ， 国 内 尚未 投 入 生 产 ; 我 国 7家 。 应 用 领 域 不 断 扩 大 食 品 工 业 占 62% 酶 的 发 酵 生 产 ： 经 过 预 先

2、设 计 ， 通 过 人 工 操 作 控 制 ， 利 用细 胞 的 生 命 活 动 ， 产 生 人 们 所 需 要 酶 的 过程 能 用 于 酶 发 酵 生 产 的 细 胞 需 具 备 如 下 几 个条 件 ： （ 1） 产 酶 量 高 （ 2） 容 易 培 养 和 管 理 （ 3） 产 酶 稳 定 性 好 （ 4） 利 于 酶 的 分 离 纯 化 （ 5） 安 全 可 靠 为 什 么 利 用 微 生 物 产 酶 ？ (1) 种 类 多 、 酶 种 丰 富 ， 且 菌 株 易 诱 变 ， 菌 种 多 样 。 (2) 生 长 繁 殖 快 ， 易 提 取 酶 . (3) 培 养 基 来 源 广 泛

3、、 价 格 便 宜 。 (4) 微 电 脑 ， 连 续 化 、 自 动 化 ， 经 济 效 益 高 。 (5) 利 用 以 基 因 工 程 为 主 的 现 代 分 子 生 物 学 技 术 ， 产 酶 种 类 、 产 量 、 发 酵 条 件 、 工 艺 。 主 要 包 括 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 菌 、 霉 菌 。 （ 1） 枯 草 芽 孢 杆 菌 细 菌 属 菌 落 粗 糙 ， 不 透 明 生 产 -淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 -葡 聚 糖 酶 ， 碱 性 磷 酸酶 等 。 （ 2） 大 肠 杆 菌 阴 性 ， 无 芽 孢 菌 落 光 滑 用 于 谷 氨 酸 脱 羧 酶 ， 天

4、门 冬 氨 酸 酶 等 胞 内 酶 （ 3） 黑 曲 霉 属 于 真 菌 属 糖 化 酶 、 淀 粉 酶 、 酸性 蛋 白 酶 、 果 胶 酶 等 。 （ 4） 米 曲 霉 糖 化 酶 、 蛋 白 酶 （ 5） 根 霉 主 要 用 于 糖 化 酶 、 淀粉 酶 、 转 化 酶 等 生 产 （ 6） 毛 霉 蛋 白 酶 、 糖 化 酶 、 淀粉 酶 、 脂 肪 酶 等 。 （ 7） 链 霉 菌 葡 萄 糖 异 构 酶 、 青霉 素 酰 化 酶 、 纤 维素 酶 、 几 丁 质 酶 等 （ 8） 啤 酒 酵 母 转 化 酶 丙 酮 酸 脱 羧 酶 产 酶 菌 株 的 选 育 主 要 依 据 酶 催

5、 化 的 反 应 性 质 、 作 用 底 物 的 特 异性 、 底 物 和 产 物 的 特 性 以 及 酶 在 细 胞 中 所 处 的 位置 。 胞 外 酶 ： 菌 落 周 围 的 透 明 圈 、 颜 色 变 化 来 筛 选 。 胞 内 酶 ： 若 酶 作 用 底 物 分 子 量 小 可 透 过 细 胞 膜 ，将 酶 反 应 的 产 物 作 为 底 物 ， 加 在 培 养 基 中 ， 根 据菌 落 颜 色 变 化 。 而 多 数 胞 内 酶 产 生 菌 的 筛 选 ： 细 胞 破 碎 物 做 酶 源 ，经 酶 反 应 后 ， 根 据 酶 反 应 产 物 的 特 点 来 筛 选 （ 辅酶 NAD

6、） 。 选 择 性 能 优 良 的 产 酶 微 生 物 培 养 基 设 计 选 择 合 适 的 发 酵 方 式 发 酵 过 程 的 各 种 参 数 控 制 保 藏 细 胞细 胞 活 化细 胞 扩 大 培 养原 生 质 体 固 定 化 细 胞固 定 化 原 生 质 体 预 培 养发 酵发 酵 分 离 纯 化酶 主 要 是 碳 源 、 氮 源 ， 其 次 是 无 机 盐 、 生 长 因 子和 产 酶 促 进 剂 等 。 （ 1） 碳 源 当 前 酶 制 剂 生 产 上 使 用 的 菌 种 大 都 是 只 能利 用 有 机 碳 的 异 养 型 微 生 物 。吃 点 啥 ？ 有 机 碳 的 主 要 来

7、 源 有 ： 一 是 农 副 产 品 中 二 是 野 生 的 原 料 以 石 油 产 品 中 12 16碳 的 成 分 考 虑 营 养 要 求 、 诱 导 作 用 、 分 解 代 谢物 阻 遏 作 用 。 淀 粉 酶 生 产 用 淀 粉 不 用 果 糖 （ 2） 氮 源有 机 氮 源 和 无 机 氮 源一 般 来 说 ， 动 物 细 胞 、 植 物 细 胞 、异 养 型 微 生 物 、 自 养 型 微 生 物 。有 机 氮 源 和 无 机 氮 源 配 合我 有 我 要 求 只 用 铵 盐 或 硝 酸 盐 为 氮 源 时 ， 酶 产 量 仅 为 有 胨 时的 30%只 用 有 机 氮 源 而 不

8、 用 无 机 氮 源 时 产 量 也 低使 用 高 浓 度 有 机 氮 源 外 尚 需 添 加 1%3%的 无 机 氮源 。 （ 3） 碳 氮 比一 般 蛋 白 酶 (包 括 酸 性 、 中 性 和 碱 性 蛋 白酶 )低 ;淀 粉 酶 (包 括 淀 粉 酶 、 糖 化 酶 、 淀粉 酶 等 ) 高 , 在 糖 化 酶 生 产 培 养 基 的 碳 氮比 是 最 高 的 。 （ 4） 无 机 盐常 以 磷 酸 二 氢 钾 、 磷 酸 氢 二 钾 等 磷 酸 盐作 为 磷 源 ， 以 硫 酸 镁 为 硫 源 和 镁 源 。钙 灰 色 链 霉 菌 中 性 蛋 白 酶 pH77.5 pH5 7。 钠

9、离 子控 制 细 胞 渗 透 压 酶 产 量 增 加 ， 以 磷 酸 氢 二 钠 及硝 酸 钠 等 形 式 ， 例 如 米 曲 霉 淀 粉 酶 （ 5） 生 长 因 子 微 量 的 物 质 ， 或 生 长 素 。某 些 氨 基 酸 、 维 生 素 、 嘌 呤 或 嘧 啶 。有 你 才健 康 ！ （ 6） 产 酶 促 进 剂 产 酶 促 进 剂一 是 诱 导 物 ， 二 是 表 面 活 性 剂 。 表 面 活 性 剂 能增 加 细 胞 的 通 透 性 ， 改 善 氧 的 传 递 速 度 ， 保 护酶 的 活 性 。 发 酵 方 式 的 选 择 固 态 发 酵 法 液 体 深 层 发 酵 法 一

10、般 来 说 ， 培 养 基 成 分 中 碳 /氮 (C/N)比 高 ，发 酵 液 ， pH低 ； C/N低 ， pH高 。 添 加 缓 冲 液 ； 调 节 通 风 量 .调 节 培 养 基 的 初始 pH； pH过 高 糖 或 淀 粉 来 调 节 ， pH过 低 氮调 节 。 一 般 细 菌 为 37 ， 霉 菌 和 放 线 菌 为 28 30 ， 而 生产 糖 化 酶 的 最 适 温 度 为 37 40 。 微 生 物 代 谢 反 应 、 发 酵 中 通 风 、 搅 拌 速 度发 酵 初 期菌 体 繁 殖 旺 盛 时 溶 解 氧 而 定 。 目 前 用 于 酶 制 剂 生 产 的 微 生物

11、都 为 好 气 性 微 生 物 ， 采 用 自 动 测 定 和 记录 溶 解 氧 的 仪 表 。 有 利 于 热 交 换 、 营 养 物 质 与 菌 体 均 匀 接 触 ，提 高 新 陈 代 谢 。 打 破 空 气 气 泡 ， 使 发 酵 液 形 成湍 流 ， 提 高 溶 氧 量 ， 增 加 空 气 利 用 。 泡 沫 阻 碍 了 CO2的 排 除 ， 影 响 溶 氧 量机 械 消 泡 ， 消 泡 剂 1、 -淀 粉 酶 的 生 产 生 产 菌 种 ： 细 菌 和 曲 霉 ， 如 枯 草 芽 孢 杆 菌 、黑 曲 霉 等 。 发 酵 方 法 ： 霉 菌 ， 固 体 曲 法 ； 细 菌 ， 液

12、体深 层 发 酵 。 回 收 方 法 ： 盐 析 、 有 机 溶 剂 沉 淀 和 淀 粉 吸附 等 。 2、 果 胶 酶 的 生 产 生 产 菌 种 ： 真 菌 如 曲 霉 菌 、 青 霉 菌 ， 细 菌如 枯 草 芽 孢 杆 菌 、 欧 氏 杆 菌 。 发 酵 ： 固 体 曲 法 和 液 体 深 层 发 酵 回 收 ： 水 提 后 加 入 乙 醇 沉 淀 。 酶 的 纯 化 特 定 的 一 种 酶 在 细 胞 中 的 含 量 很 少 酶 可 以 通 过 测 定 活 力 加 以 跟 踪 1、 可 靠 和 快 速 的 测 活 方 法 ； 2、 酶 原 料 的 选 择 ； 3、 酶 的 提 取 ；

13、 4、 酶 的 提 纯 ； 5、 酶 的 纯 度 检 验 。 酶提取分离纯化技术路线发 酵 培 养动 物 器 官 植 物 组 织 微 生 物提 取 胞 内 酶 胞 外 酶细 胞 破 碎研 磨 酶 分 离 纯 化离 心 分 离 ， 过 滤 分 离 ， 沉 淀 分离 ， 层 析 分 离 ， 电 泳 分 离 ， 萃 取 分 离 ， 结 晶 分 离 等 。 酶 浓 缩酶 贮 存 机 械 破 碎 捣 碎 法研 磨 法匀 浆 法 物 理 破 碎 温 度 差 破 碎 法压 力 差 破 碎 法超 声 波 破 碎 法 化 学 破 碎 有 机 溶 剂 ：甲 苯 、 丙 酮丁 醇 、 氯 仿表 面 活 性 剂 ：T

14、riton、 Tween酶 促 破 碎 自 溶 法外 加 酶 制 剂 法通 过 机 械 运 动 产 生 的 剪 切力 ， 使 组 织 、 细 胞 破 碎 。使 组 织 、 细 胞 的 外 层 结 构 破坏对 细 胞 膜 的 作 用通 过 细 胞 本 身 的 酶 系 或 外 加 酶 制 剂 的 催 化 作 用 ， 使细 胞 外 层 结 构 受 到 破 坏 ， 细 胞 破 碎 方 法 及 其 原 理 (1) 机 械 (匀 浆 ) 法 (2) 超 声 波 法 处 理 的 主 要 问 题 是 超 声 空 穴 局 部 过 热 引起 酶 活 性 丧 失 ， 时 间 应 尽 可 能 短 ， 容 器周 围 以

15、 冰 浴 冷 却 处 理 。 (3) 冻 融 法 生 物 组 织 冰 冻 后 ， 胞 液 结 成 冰 晶 ， 使细 胞 壁 胀 破 。 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 ， 如 PMSF(苯 甲 基磺 酰 氟 )络 合 剂 EDTA、 还 原 剂 DTT (二 硫苏 糖 醇 )。(4) 渗 透 压 法(5) 酶 消 化 法 有 机 溶 剂 处 理 表 面 活 性 剂 处 理 与 细 胞 膜 中 的 磷 脂 及 脂 蛋 白 相 互 作 用 使 细 胞膜 结 构 破 坏 ， 增 加 膜 的 透 过 性 。 盐 溶 液 提 取酸 溶 液 提 取碱 溶 液 提 取有 机 溶 剂 提 取 温 度 ： 一

16、般 在 00C100C。 pH： 在 酶 的 稳 定 范 围 内 ， 远 离 等 电 点 pH。 缓 冲 液 ： 0.15mol/L氯 化 钠 、 0.020.05mol/L磷 酸 提 取 液 体 积 ： 一 般 为 原 料 体 积 的 1-5倍 。 保 护 剂 ： 底 物 、 辅 酶 、 某 些 抗 氧 化 剂 、 表 面 活 性 剂 等 。 酶 的 主 要 提 取 方 法提 取 方 法 使 用 的 溶 剂 或 溶 液 提 取 对 象盐 溶 液 提 取 0.02 0.5mol/L的盐 溶 液 在 低 浓 度 盐 溶 液 中 溶解 度 较 大 的 酶酸 溶 液 提 取 PH2 6的 水 溶 液

17、 在 稀 酸 溶 液 中 溶 解 度大 ， 且 稳 定 性 较 好 的酶碱 溶 液 提 取 PH8 12的 水 溶 液 稀 碱 溶 液 中 溶 解 度 大且 稳 定 性 较 好 的 酶有 机 溶 剂 提 取 可 与 水 混 溶 的 有 机溶 剂 与 脂 质 结 合 牢 固 或 含有 较 多 非 极 性 基 团 的酶 1、 沉 淀 分 离2、 离 心 分 离3、 萃 取 分 离4、 层 析 分 离GoGoGoGo 5、 电 泳 分 离Go 6、 过 滤 与 膜 分 离Go 1、 沉 淀 分 离溶 解 度 降 低 从 溶 液 中 沉 淀 析 出 沉 淀 分 离 方 法 分 离 原 理 盐 析 沉

18、淀 法 蛋 白 质 在 不 同 的 盐 浓 度 条 件 下 溶 解 度 不 同 ， 在 酶 液 中 添 加 一定 浓 度 的 中 性 盐等 电 点 沉 淀 法 等 电 点 时 溶 解 度 最 低 ， 不 同 的 两 性 电 解 质 有 不 同 的 等 电 点 有 机 溶 剂 沉 淀 法 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 度 不 同 复 合 沉 淀 法 在 酶 液 中 加 入 某 些 物 质 ， 使 它 与 酶 形 成 复 合 物 而 沉 淀 下 来 ，选 择 性 变 性 沉 淀 法 选 择 一 定 的 条 件 使 酶 液 中 存 在 的 某 些 杂 质 变 性 沉 淀 ， 而 不 影响 所 需

19、的 酶 p介 电 常 数 降 低 、 使 酶 蛋 白 脱 水 有 机 溶 剂 法 温 度 pH 离 子 强 度 蛋 白 质 浓 度p 常 用 于 酶 的 沉 淀 分 离 的 有 机 溶 剂 有 乙 醇 、 丙 酮 、 异 丙 醇 、 甲 醇 等 。 必 须 与 水 完 全 混 溶 ; 不 与 蛋 白 质 发 生 反 应 ； 要 有 较 好 的 沉 淀 效 应 ； 溶 剂 蒸 汽 要 无 毒 ， 且 不 易 燃 。 阴 极 阳 极pH=pIpHpI带 正 电 荷 带 负 电 荷净 电 荷 为 零导 电 率 溶 解 度渗 透 压 粘 度达 到 最 低等 电 点 沉 淀 法原 因 :在 等 电 点

20、时 ， 蛋 白 质 分 子 以 双 极 离 子 存 在 ， 总 净电 荷 为 零 , 颗 粒 无 电 荷 间 的 排 斥 作 用 ,易 凝 集 成 大 颗 粒 ，因 而 最 不 稳 定 ， 溶 解 度 最 小 ， 易 沉 淀 析 出 。 电 泳 分离沉 淀 分 离 pH=pI 溶 解 度 最 小 等 电 点 沉 淀 与 分 离大 部 或 全 部 沉 淀 下 来 pHpI蛋 白 质 的 分 离沉 淀 出 来 的 蛋 白 质 可 保 持 天 然 构 象 ， 能 再 溶 解于 水 并 具 有 生 物 活 性 。 离 心 分 离离 心 力 使 不 同 大 小 、 不 同 密 度 的 物 质 分 离 。

21、颗 粒 大 小 、 密 度 和 特 性 的 不 同离 心 的 形 式 ：p 离 心 沉 降p 离 心 过 滤p 离 心 分 离 和 超 离 心 超 速 离 心 机 高 速 离 心 机 沉 降 离 心 机 萃 取 分 离利 用 物 质 在 两 相 中 的 溶 解 度 不 同 。 两 相 一 般 互不 相 溶 有 机 溶 剂 萃 取双 水 相 萃 取超 临 界 萃 取反 胶 束 萃 取 常 用 的 溶 剂 ： 醇 、 酮 、 丁 醇 、 苯 酚 等 。 萃 取 条 件 ： 00C100C。 接 触 时 间 尽 可 能 短 。 p利 用 生 物 物 质 在 双 水 相 体 系 中 的 选 择 性 分

22、 配 。 p影 响 分 配 的 因 素 ： 双 水 相 的 性 质 、 分 离 物 质 的 性 质 、 离 子 性 质 、 环 境 因 素 利 用 混 合 物 中 各 组 分 的 物 理 化 学 性 质 的 差 别 ， 使各 组 分 以 不 同 程 度 分 布 在 两 个 相 中 ， 并 以 不 同 速度 移 动 。 欲 分 离 的 混 合 溶 液 自 柱 顶加 入 洗 脱 剂 。解 吸 、 吸 附 、 再 解 吸 、 再吸 附 吸 附 层 析 洗 脱 剂 的 选 择 极 性 种 类 有 ： 醇 、 酮 、 酚 等 。洗 脱 剂 的 选 择 要 注 意 下 列 各 点 ：p洗 脱 剂 不 会

23、与 吸 附 剂 起 化 学 反 应 ， 不 会 使 吸 附 剂溶 解 ；p洗 脱 剂 对 混 合 液 中 的 各 组 分 的 溶 解 度 大 ， 粘 度 小 ，流 动 性 好p纯 度 离 子 交 换 剂 上 的 可 解 离 基团 （ 活 性 基 团 ） 对 各 种 离子 的 亲 和 力 不 同阳 离 子 交 换 剂阴 离 子 交 换 剂 离 子 交 换 层 析 凝 胶 过 滤分 子 筛 层 析以 各 种 多 孔 凝 胶 为 固 定相 ， 利 用 流 动 相 中 所 含各 种 组 分 的 相 对 分 子 质量 不 同 凝 胶 层析 溶 质 分 子 的 大 小 操 作 方 便 ， 不 会 使 物

24、质 变 性 ， 反 复 使 用 凝 胶 层 析 剂 的 容 量 比 较 低 葡 聚 糖 凝 胶 琼 脂 糖 凝 胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 生 物 分 子 与 配 基 之 间 所 具有 的 专 一 而 又 可 逆 的 亲 和力酶 与 底 物酶 与 竞 争 性 抑 制 剂抗 原 与 抗 体酶 RNA与 互 补 的 RNA分 子 或片 段 RNA与 互 补 的 DNA分 子或 片 段 亲 和 层析 根 据 欲 分 离 组 分 与 配 基 的 结 合 特 性 ,亲 和 层 析可 以 分 为 ：共 价 亲 和 层 析 疏 水 层 析金 属 离 子 亲 和 层 析 免 疫 亲 和 层 析染 料 亲

25、和 层 析 凝 集 素 亲 和 层 析 分 配 层 析利 用 各 组 分 在 两 相 中 的 分 配 系 数 不 同固 定 相 、 流 动 相 在 流 动 相 的 带 动 流 经 固 定 相 动 态 分 配 。 纸 上 层 析 分 配 薄 层 层 析 分 配 气 相 层 析 电 泳 分 离使 用 的 支 持 体 的 不 同 ： 薄 层 电 泳 纸 层 析 薄 膜 电 泳 凝 胶 电 泳 自 由 电 泳 等 电 聚 焦 电 泳 本 身 所 带 的 净 电 荷 量 、 颗 粒 形状 颗 粒 大 小 、 电 场 强 度 、 溶 液pH值 、 离 子 强 度 、 支 持 体 的 特性 过 滤 与 膜

26、分 离借 助 于 过 滤 介 质 ， 滤 纸 、 滤 布 、 纤 维过 滤 非 膜 过 滤 ： 采 用 高 分 子 膜 以 外 的 物 质 作 为 过 滤 介 质 膜 过 滤 ： 采 用 各 种 高 分 子 膜 为 过 滤 介 质 膜 分 离 过 程 中 ， 薄 膜 的 作 用 是 选 择 性 地 让 小 于其 孔 径 的 物 质 颗 粒 或 分 子 通 过 ， 而 把 大 于 其 孔 径的 颗 粒 截 留 。膜 分 离 加 压 膜 分 离 微 滤超 滤反 渗 透电 场 膜 分 离 电 渗 析 离 子 交 换 膜 电 渗 析 扩 散 膜 分 离 透 析 酶 的 产 量 是 以 活 力 单 位

27、表 示 ， 比 活 力 、 总 活 力 酶 活 力 的 测 定 酶 活 力 (Enzyme activity)： 酶 催 化 反 应 的 能 力 ，酶 的 含 量 。 1 min催 化 1mol底 物 转 化 为 产 物 的 酶 量 为 该 酶的 一 个 活 力 单 位 ( 国 际 单 位 ) ， 温 度 为 25 ， 其它 条 件 (pH、 离 子 强 度 ) 采 用 最 适 条 件 。 酶 的 总 活 力 为 样 品 的 全 部 酶 活 力 。 总 活 力 = 酶 活 力 总 体 积 (mL) 或 = 酶 活 力 总 质 量 (g) 比 活 力 (Specific activity) ：

28、单 位 蛋 白 质 所含 有 的 酶 活 力 。 酶 纯 度 回 收 率 (Yield percent) ： 提 纯 前 与 提 纯 后酶 的 总 活 力 之 比 。 酶 的 损 失 程 度 提 纯 倍 数 ： 提 纯 前 后 两 者 比 活 力 之 比 。酶 活 力 是 一 般 采 用 测 定 产 物 的 生 成 量 电 泳 法 层 析 法 沉 降 法 分 光 光 度 计 法 结 晶 法 免 疫 法 1、 电 泳 法 ：仅 有 一 条 区 带 2、 层 析 法 ： 经 层 析 后 各 部 分 比 活 力 一 致 3、 免 疫 化 学 法 ： 免 疫 电 泳 4、 超 速 离 心 沉 降 分 析 法 5、 分 光 光 度 法 ： 根 据 A280/A260应 为 的 比值 确 定 ， 纯 酶 的 比 值 为 1.75 6、 结 晶 法 底 物 、 抑 制 剂 和 辅 酶 ， 不 稳 定 状 态 稳定 状 态 。 巯 基 酶 ， 加 入 SH保 护 剂 。 GSH、DTT Ca2+保 护 淀 粉 酶 ， Mn2+稳 定 溶 菌酶 ， Cl 稳 定 透 明 质 酸 酶 。