《大肠杆菌基因工程》PPT课件

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1、大 肠 杆 菌 基 因 工 程 A 大 肠 杆 菌 作 为 表 达 外 源 基 因 受 体 菌 的 特征 大 肠 杆 菌 基 因 工 程大 肠 杆 菌 表 达 外 源 基 因 的 优势全 基 因 组 测 序 ， 共 有 4405个 开 放 型 阅 读框 架基 因 克 隆 表 达 系 统 成 熟完 善繁 殖 迅 速 、 培 养 简 单 、 操 作 方 便 、 遗 传稳 定被 美 国 FDA批 准 为 安 全 的 基 因 工 程 受 体生 物 A 大 肠 杆 菌 作 为 表 达 外 源 基 因 受 体 菌 的 特 征大 肠 杆 菌 基 因 工 程大 肠 杆 菌 表 达 外 源 基 因 的 劣势缺

2、乏 对 真 核 生 物 蛋 白 质 的 复 性 功 能缺 乏 对 真 核 生 物 蛋 白 质 的 修 饰 加 工系 统内 源 性 蛋 白 酶 降 解 空 间 构 象 不 正 确 的 异 源蛋 白细 胞 周 质 内 含 有 种 类 繁 多 的 内 毒 素 B 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 表 达 的原 理大 肠 杆 菌 基 因 工 程启 动子终 止子核 糖 体 结 合 位 点密 码子质 粒 拷 贝 数 启 动 子启 动 子 最 佳 距 离 的 探测 目 的 基因E EAE E启 动子 A 酶 切开Bal31酶解目 的 基因 启 动 子启 动 子 的 筛 选 Apr ori ga

3、lKpKO1 终 止 密 码子采 用 鸟 枪 法 战 略 ， 将 合 适 大 小 的DNA片 段克 隆 到 启 动 子 探 针 质 粒 pKO1上受 体 细 胞 染 色 体 DNA上 的 galE、galT与 质粒 上 报 告 基 因 galk的 表 达 产 物 联 合作 用 ，可 将 培 养 基 中 的 半 乳 糖 酵 解 成 红 色素 物 质转 化 galE+、 galT+、 galK-的 大 肠 杆 菌受 体 菌 株 含 有 外 源 启 动 子 活 性 的 重 组 克 隆 启 动 子启 动 子 的 构建 -35 区 序列 -10 区 序列PlLPrecAPtrpP lacPtraAPta

4、c启 动 子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C AT A T A A TPtac = 3 Ptrp = 11 Plac 启 动 子启 动 子 的 可 控性 P乳 糖 启 动 子 Plac的 可 控 性 ： O P O 高 效 转录 阻 遏 蛋白诱导乳 糖 异 丙 基 -b-D-硫 代 半 乳 糖 苷（ IPTG）野 生 型 的 Plac与 其 控 制 区Olac偶 联 在 一 起 ， 在 没

5、有 诱导 物存 在 时 ， 整 个 操 纵 子 处于 基 基 底 水 平 转录底 水 平 表 达 ； 诱 导 物 可以 使启 动 子 Plac介 导 的 转 录 大幅提 高 启 动 子启 动 子 的 可 控性 Plac乳 糖 启 动 子 Plac的 可 控 性 ： OP lac O 高 效 转录葡 萄 糖 代谢野 生 型 的 Plac上 游 附 近 拥有代 谢 激 活 因 子 （ CAP）结 合区 ， cAMP激 活 CAP，CAP 基 底 水 平 转录结 合 启 动 子 控 制 区 ， 进而 促进 Plac介 导 的 转 录 。 葡 萄糖代 谢 使 cAMP减 少 ， 也能 阻遏 Plac介

6、 导 的 转 录 。 因 此 ，基 因 工 程 中 使 用 的 乳 糖启 动子 均 为 抗 葡 萄 糖 代 谢 阻遏 的突 变 型 ， 即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP浓 度降 低Plac UV5 O 高 效 转录 启 动 子启 动 子 的 可 控性 Ptrp色 氨 酸 启 动 子 Ptrp的 可 控 性 ： Otrp除 去 色 氨酸色 氨 酸 启 动 子 Ptrp受 色 氨 酸 -阻 遏蛋 白 复 合 物 的 阻 遏 ， 转 录 呈 基 底状 态 。 在 培 养 系 统 中 去 除 色 氨 酸 基 底 水 平 转录或 者 加 入 3-吲 哚 丙 烯 酸 （ IAA） ，便 可

7、 有 效 地 解 除 阻 遏 抑 制 作 用 。在 正 常 的 细 菌 培 养 体 系 中 ， 除 去色 氨 酸 是 困 难 的 ， 因 此 基 因 工 程中 往 往 添 加 IAA诱 导 P trp介 导 的 目基 因 的 表 达 色 氨酸 或 加 3-吲 哚 丙烯 酸 高 效 转录阻 遏 蛋白 （ IAA）O trpPtrp 高 效 转录OtrpPtrp 启 动 子启 动 子 的 可 控性 l噬 菌 体 启 动 子 PlL的 可 控 性 ：噬 菌 体 启 动 子 PL受 CI阻 遏 蛋 白 阻遏 ， 很 难 直 接 诱 导 控 制 。 在 基 因工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型

8、的 cI突变 基 因 cI857控 制 PL。 cI857阻 遏 蛋在 42 时 失 活 脱 落 ， P L便 可 介 导目 的 基 因 的 表 达 。 但 在 大 型 细 菌培 养 罐 中 迅 速 升 温 非 常 困 难 ， 因此 常 使 用 一 个 双 质 粒 控 制 系 统 ，用 色 氨 酸 间 接 控 制 目 的 基 因 表 达 Ptrp A BcI857 PL 目 的 基因阻 遏 作用Ptrp A BPL 表达色 氨酸 终 止 子强 化 转 录 终 止 的 必 要 性 外 源 基 因 在 强 启 动 子 的 控 制 下 表 达 ， 容 易 发 生 转 录 过 头 现 象 ， 即 RN

9、A聚 合 酶 滑 过终 止 子 结 构 继 续 转 录 质 粒 上 邻 近 的 DNA序 列 ， 形 成 长 短 不 一 的 mRNA混 合 物 过 长 转 录 物 的 产 生 在 很 大 程 度 上 会 影 响 外 源 基 因 的 表 达 ， 其 原 因 如 下 ： 转 录 产 物 越 长 ， RNA聚 合 酶 转 录 一 分 子 mRNA所 需 的 时 间 就 相 应 增 加 ， 外 源 基 因 本身 的 转 录 效 率 下 降 ； 如 果 外 源 基 因 下 游 紧 接 有 载 体 上 的 其 它 重 要 基 因 或 DNA功 能 区 域 ， 如 选 择 性 标 记 基因 和 复 制 子

10、 结 构 等 ， 则 RNA聚 合 酶 在 此 处 的 转 录 可 能 干 扰 质 粒 的 复 制 及 其 它 生 物 功 能 ，甚 至 导 致 重 组 质 粒 的 不 稳 定 性 ； 过 长 的 mRNA往 往 会 产 生 大 量 无 用 的 蛋 白 质 ， 增 加 工 程 菌 无 谓 的 能 量 消 耗 ； 更 为 严 重 的 是 ， 过 长 的 转 录 物 往 往 不 能 形 成 理 想 的 二 级 结 构 ， 从 而 大 大 降 低 外 源 基因 编 码 产 物 的 翻 译 效 率 终 止 子强 终 止 子 的 选 择 与 使 用 目 前 外 源 基 因 表 达 质 粒 中 常 用 的

11、 终 止 子 是来 自 大 肠 杆 菌 rRNA操 纵 子 上 的 rrnT1T2以 及T7噬 菌 体 DNA上 的 Tf。 对 于 一 些 终 止 作 用 较弱 的 终 止 子 ， 通 常 可 以 采 用 二 聚 体 终 止 子 串联 的 特 殊 结 构 ， 以 增 强 其 转 录 终 止 作 用 终 止 子 也 可 以 象 启 动 子 那 样 ， 通 过 特 殊 的探 针 质 粒 从 细 菌 或 噬 菌 体 基 因 组 DNA中 克 隆筛 选 pCP1Apr ori Tcr筛 选 Ap r、 Tcs的 转 化 子 核 糖 体 结 合 位 点 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 细 胞 中

12、的 高 效 表 达 不 仅 取 决 于转 录 启 动 的 频 率 ， 而 且 在 很 大 程 度 上 还 与 mRNA的 翻 译起 始 效 率 密 切 相 关 。 大 肠 杆 菌 细 胞 中 结 构 不 同 的 mRNA分 子 具 有 不 同 的 翻 译 效 率 ， 它 们 之 间 的 差 别 有 时 可 高 达数 百 倍 。 mRNA翻 译 的 起 始 效 率 主 要 由 其 5 端 的 结 构序 列 所 决 定 ， 称 为 核 糖 体 结 合 位 点 （ RBS） 核 糖 体 结 合 位 点大 肠 杆 菌 核 糖 体 结 合 位 点 包 括 下 列 四 个 特 征 结 构 要 素 ：位 于

13、 翻 译 起 始 密 码 子 上 游 的 6-8个 核 苷 酸 序 列 5 UAAGGAGG 3， 即Shine-Dalgarno（ SD） 序 列 ， 它 通 过 识 别 大 肠 杆 菌 核 糖 体 小 亚 基 中 的 16S rRNA 3端 区 域 3 AUUCCUCC 5并 与 之 专 一 性 结 合 ， 将 mRNA定 位 于 核糖 体 上 ， 从 而 启 动 翻 译 ；翻 译 起 始 密 码 子 ， 大 肠 杆 菌 绝 大 部 分 基 因 以 AUG作 为 阅 读 框 架 的 起 始 位 点 ，但 有 些 基 因 也 使 用 GUG或 UUG作 为 翻 译 起 始 密 码 子 ；SD

14、序 列 与 翻 译 起 始 密 码 子 之 间 的 距 离 及 碱 基 组 成 ； 基 因 编 码 区 5 端 若 干 密 码 子 的 碱 基 序 列 核 糖 体 结 合 位 点 的 结 构 核 糖 体 结 合 位 点核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响SD序 列 的 影 响 ： 一 般 来 说 ， mRNA与 核 糖 体 的 结 合 程 度 越 强 ， 翻 译的 起 始 效 率 就 越 高 ， 而 这 种 结 合 程 度 主 要 取 决 于 SD序 列与 16S rRNA的 碱 基 互 补 性 ， 其 中 以 GGAG四 个 碱 基 序列 尤 为 重 要 。 对

15、 多 数 基 因 而 言 ， 上 述 四 个 碱 基 中 任 何 一个 换 成 C或 T， 均 会 导 致 翻 译 效 率 大 幅 度 降 低 核 糖 体 结 合 位 点核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响SD序 列 与 起 始 密 码 子 之 间 的 序 列 的 影 响 ： SD序 列 下 游 的 碱 基 若 为 AAAA或 UUUU， 翻 译 效 率最 高 ； 而 CCCC或 GGGG的 翻 译 效 率 则 分 别 是 最 高 值 的50%和 25%。 紧 邻 AUG的 前 三 个 碱 基 成 份 对 翻 译 起 始 也有 影 响 ， 对 于 大 肠 杆 菌

16、b-半 乳 糖 苷 酶 的 mRNA而 言 ， 在这 个 位 置 上 最 佳 的 碱 基 组 合 是 UAU或 CUU， 如 果 用UUC、 UCA或 AGG取 代 之 ， 则 酶 的 表 达 水 平 低 20倍 核 糖 体 结 合 位 点核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响SD序 列 与 起 始 密 码 子 之 间 的 距 离 的 影 响 ： SD序 列 与 起 始 密 码 子 之 间 的 精 确 距 离 保 证 了 mRNA在 核 糖 体 上 定 位 后 ， 翻 译 起 始 密 码 子 AUG正 好 处 于 核 糖体 复 合 物 结 构 中 的 P位 ， 这

17、是 翻 译 启 动 的 前 提 条 件 。 在很 多 情 况 下 ， SD序 列 位 于 AUG之 前 大 约 七 个 碱 基 处 ， 在此 间 隔 中 少 一 个 碱 基 或 多 一 个 碱 基 ， 均 会 导 致 翻 译 起 始效 率 不 同 程 度 的 降 低 核 糖 体 结 合 位 点核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响起 始 密 码 子 及 其 后 续 若 干 密 码 子 的 影 响 ： 大 肠 杆 菌 中 的 起 始 tRNA分 子 可 以 同 时 识 别 AUG、 GUG和UUG三 种 起 始 密 码 子 ， 但 其 识 别 频 率 并 不 相 同

18、， 通 常 GUG为 AUG的 50%而 UUG只 及 AUG的 25%。 除 此 之 外 ， 从 AUG开 始 的 前 几 个密 码 子 碱 基 序 列 也 至 关 重 要 ， 至 少 这 一 序 列 不 能 与 mRNA的 5 端非 编 码 区 形 成 茎 环 结 构 ， 否 则 便 会 严 重 干 扰 mRNA在 核 糖 体 上 的 准 确定 位 目 前 广 泛 用 于 外 源 基 因 表 达 的 大 肠 杆 菌 表 达 型 质 粒 上 ， 均 含 有 与 启 动 子 来 源 相 同 的 核 糖 体 结 合 位 点 序 列 ， 序 列 和 间 隔 是 最 佳 的 密 码 子生 物 体 对

19、 密 码 子 的 偏 爱 性 不 同 的 生 物 ， 甚 至 同 种 生 物 不 同 的 蛋 白 质 编 码 基 因 ， 对 简并 密 码子 使 用 频 率 并 不 相 同 ， 具 有 一 定 的 偏 爱 性 ， 其 决 定 因 素 是 ： 生 物 基 因 组 中 的 碱 基 含 量 在 富 含 AT的 生 物 （ 如 单 链DNA噬 菌 体fX174） 基 因 组 中 ， 密 码 子 第 三 位 上 的 U和 A出 现 的 频 率 较 高 ；而 在 GC丰 富 的 生 物 （ 如 链 霉 菌 ） 基 因 组 中 ， 第 三 位 上 含 有 G或 C的 简并 密 码 子占 90%以 上 的 绝

20、 对 优 势 密 码 子 与 反 密 码 子 相 互 作 用 的 自 由 能 中 等 强 度 规 律 细 胞 内 tRNA的 含 量如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等 使 用 少 ；如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG等 使 用 多 ； 密 码 子密 码 子 偏 爱 性 对 外 源 基 因 表 达 的影 响 由 于 原 核 生 物 和 真 核 生 物 基 因 组 中 密 码 子 的 使 用 频 率具 有 较 大 程大 的 差 异 性 ， 因 此 外 源 基 因 尤 其 是 高 等 哺 乳 动 物 基 因

21、 在 大肠 杆 菌 中 高 效 翻 译 的 一 个 重 要 因 素 是 密 码 子 的 正 确 选 择 。 一 般 而 言 ，有 两 种 策 略可 以 使 外 源 基 因 上 的 密 码 子 在 大 肠 杆 菌 细 胞 中 获 得 最 佳 表达 ： 外 源 基 因 全 合成同 步 表 达 相 关 tRNA编 码基 因 密 码 子密 码 子 偏 爱 性 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响按 照 大 肠 杆 菌 密 码 子 的 偏 爱 性 规 律 ， 设 计 更 换 外 源 基因 中 不 适 宜 的 相 应 简 并 密 码 子 ， 重 组 人 胰 岛 素 、 干 扰素 以 及 生 长 激 素

22、在 大 肠 杆 菌 中 的 高 效 表 达 均 采 用 了 这种 方 法 外 源 基 因 全 合 成 密 码 子密 码 子 偏 爱 性 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响 对 于 那 些 含 有 不 和 谐 密 码 子 种 类 单 一 、 出 现 频 率 较 高 、而 本 身 分 子 量 又 较 大 的 外 源 基 因 而 言 ， 则 选 择 相 关 tRNA编码 基 因 同 步 克 隆 表 达 的 策 略 较 为 有 利 。 例 如 ， 在 人 尿 激 酶 原cDNA的 412个 密 码 子 中 ， 共 含 有 22个 精 氨 酸 密 码 子 ， 其 中 7个 AGG、 2个 AGA，

23、而 大 肠 杆 菌 受 体 细 胞 中 tRNA AGG和tRNAAGA的 丰 度 较 低 。 为 了 提 高 人 尿 激 酶 原 cDNA在 大 肠 杆菌 中 的 高 效 表 达 ， 将 大 肠 杆 菌 的 这 两 个 tRNA编 码 基 因 克 隆在 另 一 个 高 表 达 的 质 粒 上 。 由 此 构 建 的 大 肠 杆 菌 双 质 粒 系 统有 效 地 解 除 了 受 体 细 胞 对 外 源 基 因 高 效 表 达 的 制 约 作 用同 步 表 达 相 关 tRNA编 码 基 因 质 粒 拷 贝 数质 粒 拷 贝 数 对 细 菌 生 长 代 谢 的 影 响 目 前 实 验 室 里 广

24、 泛 使 用 的 表 达 型 质 粒 在 每 个 大 肠 杆 菌 细 胞中 可 达 数 百 甚 至 上 千 个 拷 贝 ， 质 粒 的 扩 增 过 程 通 常 发 生 在 受 体细 胞 的 对 数 生 长 期 内 ， 而 此 时 正 是 细 菌 生 理 代 谢 最 旺 盛 的 阶 段 。质 粒 分 子 的 过 度 增 殖 以 及 其 后 目 的 基 因 的 高 效 表 达 势 必 会 影 响受 体 细 胞 的 生 长 代 谢 ， 进 而 导 致 重 组 质 粒 的 不 稳 定 性 以 及 目 的基 因 宏 观 表 达 水 平 的 下 降 解 决 上 述 难 题 的 一 种 有 效 策 略 是

25、将 重 组 质 粒 的 扩 增 纳 入 可控 制 的 轨 道 质 粒 拷 贝 数质 粒 扩 增 时 序 的 控制 pCP3拥 有 一 个 温 度 可 诱 导 型 的 复制 子 pCP3PL MCS oriAp r在 28 时 ， 每 个 细 胞 的 质 粒 拷 贝 数为 60在 42 时 ， 拷 贝 数 迅 速 增 至 300 - 600在 此 温 度 下 ， 受 体 细 胞 染 色 体 上 的CI基 因 表 达 的 温 度 敏 感 型 阻 遏 蛋白 失 活 因 此 ， 用 一 种 手 段 同 时 控 制质 粒 拷 贝 数 和 基 因 的 表 达 C 大 肠 杆 菌 基 因 工 程 菌 的 构

26、 建 策 略大 肠 杆 菌 基 因 工 程包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的表 达分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表达融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表达整 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达蛋 白 酶 抗 性 或 缺 陷 型 表 达 系 统 的 构 建 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达包 涵 体 及 其 性 质 在 某 些 生 长 条 件 下 ， 大 肠 杆 菌 能 积 累 某 种 特 殊 的 生 物 大 分 子 ， 它们 致 密 地 集 聚 在 细 胞 内 ， 或 被 膜 包 裹 或 形 成 无 膜 裸 露 结 构 ， 这 种 水 不溶 性 的

27、 结 构 称 为 包 涵 体 （ Inclusion Bodies， IB） 。 富 含 蛋 白 质 的 包涵 体 多 见 于 生 长 在 含 有 氨 基 酸 类 似 物 培 养 基 的 大 肠 杆 菌 细 胞 中 ， 由 这些 氨 基 酸 类 似 物 所 合 成 的 蛋 白 质 往 往 会 丧 失 其 理 化 特 性 和 生 物 功 能 ，从 而 集 聚 形 成 包 涵 体 。 由 高 效 表 达 质 粒 构 建 的 大 肠 杆 菌 工 程 菌 大 量 合成 非 天 然 性 的 同 源 或 异 源 蛋 白 质 ， 后 者 在 一 般 情 况 下 也 以 包 涵 体 的 形式 存 在 于 细

28、菌 细 胞 内 。 除 此 之 外 ， 包 涵 体 中 还 含 有 少 量 的 DNA、 RNA 和 脂 多 糖 等 非 蛋 白 分 子 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达以 包 涵 体 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点能 简 化 外 源 基 因 表 达 产 物 的 分 离 操 作 包 涵 体 表 达 形 式 的 优 点 ：包 涵 体 的 水 难 溶 性 及 其 密 度 远 大 于 其 它 细 胞 碎 片 和 细 胞成 分 ， 菌 体 经 超 声 波 裂 解 后 ， 直 接 通 过 高 速 离 心 即 可 将重 组 异 源 蛋 白 从 细 菌 裂 解 物 中 分 离 出

29、来能 在 一 定 程 度 上 保 持 表 达 产 物 的 结 构 稳 定 在 形 成 包 涵 体 之 后 ， 大 肠 杆 菌 的 蛋 白 酶 降 解 作 用 基 本 上对 异 源 重 组 蛋 白 的 稳 定 性 已 构 不 成 威 胁 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达以 包 涵 体 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点包 涵 体 表 达 形 式 的 缺 点 ： 以 包 涵 体 形 式 表 达 的 重 组 蛋 白 丧 失 了 原 有 的 生 物 活 性 ，必 须 通 过 有 效 的 变 性 复 性 操 作 ， 才 能 回 收 得 到 具 有 正 确 空 间构 象 （ 因 而

30、具 有 生 物 活 性 ） 的 目 标 蛋 白 ， 因 此 包 涵 体 变 复 性操 作 的 效 率 对 目 标 产 物 的 收 率 至 关 重 要 。 然 而 ， 这 也 是 一 个技 术 难 题 ， 尤 其 当 目 标 蛋 白 分 子 中 的 Cys残 基 数 目 较 高 时 ，体 外 复 性 蛋 白 质 的 成 功 率 相 当 低 ， 一 般 不 超 过 30% 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达以 包 涵 体 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 操 作 如 果 未 进 行 特 殊 设 计 （ 如 分 泌 型 表 达 或 融 合 型 表 达 ） ，外 源 基 因 在 大 肠 杆

31、菌 中 表 达 的 蛋 白 量 占 细 胞 总 蛋 白 量 20%以上 时 ， 表 达 产 物 一 般 倾 向 于 形 成 包 涵 体 。 因 此 ， 以 包 涵 体 形式 表 达 目 的 基 因 操 作 的 关 键 就 是 选 择 高 表 达 的 载 体 。 事 实 上 ，这 种 高 表 达 率 也 是 包 涵 体 法 的 长 处 所 在 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操 作C 共 价 修 饰 的 蛋 白 质蛋 白 质 变 性 复 性 的 动 力 学 原 理 ： C1 C2 Cn CU I 1 I n NX1 X2 Xn XAg Ag Ag A

32、gI 有 效 变 复 性 过 程 中 的 中 间 状 态X 脱 离 有 效 变 复 性 过 程 而 进 入 集 聚 的 中 间 状 态N 天 然 状 态 的 蛋 白 质U 变 性 状 态 的 蛋 白 质A 集 聚 状 态 的 蛋 白 质 在 细 菌 细 胞 内 ， 集 聚 状 态 和 共 价 修 饰 的 蛋 白 质 不 能 进 入 复 性 过 程 ， 因 此 永 远 成 为无 活 性 的 蛋 白 质 。 包 涵 体 中 的 蛋 白 质 就 属 于 这 两 种 状 态 ， 因 此 需 要 在 体 外 进 行 人工 变 性 （ 解 除 共 价 修 饰 和 驱 散 集 聚 体 ） 复 性 操 作 包

33、 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操 作包 涵 体 的 溶 解 与 变 性 ： 包 涵 体 的 溶 解 与 变 性 的 主 要 任 务 是 拆 开 错 配 的 二 硫 键 和 次 级 键在 人 工 条 件 下 ， 使 包 涵 体 溶 解 并 重 新 进 入 复 性 途 径 中 。 能 有 效 促 进包 涵 体 溶 解 变 性 的 试 剂 和 条 件 包 括 ： 清 洗 剂 SDS、 正 十 二 醇 肌 氨 酸 ， 廉 价 ， 但 影 响 复 性和 纯 化 促 溶 剂 盐 酸 胍 、 尿 素 ， 前 者 昂 贵 ， 尿 素 便 宜 ， 但 常 被自 发

34、形 成 的 氰 酸 盐 污 染 ， 后 者 能 与 多 肽 链 中 的氨 基 反 应 混 合 溶 剂 如 尿 素 与 醋 酸 、 二 甲 基 砜 等 联 合 使 用 ， 溶解 力 增 强 极 端 pH 廉 价 ， 但 许 多 蛋 白 质 在 极 端 pH 条 件 下 发 生 修饰 反 应 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操作 包 涵 体 的 复 性 与 重 折 叠 （ refolding） ： 包 涵 体 的 复 性 与 重 折 叠 的 主 要 任 务 是 ：通 过 次 级 键 的 形 成 使 蛋 白 质 复 性将 多 肽 链 中 被 拆 开 的

35、游 离 巯 基 重 新 折 叠 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操 作包 涵 体 的 复 性 与 重 折 叠 （ refolding） ： 复 性 操 作 包 涵 体 复 性 操 作 的 方 法 包 括 ：分 段 稀 释 法 ， 逐 步 降 低 变 性 剂 的 浓 度 ， 防 止 二 次 集聚 的 发 生一 步 稀 释 法 ， 蛋 白 复 性 与 浓 度 无 关 ， 但 集 聚 与 浓 度关 系 很 大试 剂 添 加 法 ， 精 氨 酸 、 甘 氨 酸 、 甘 油 、 蔗 糖 、 PEG、Ca 2+蛋 白 修 饰 法 ， 氨 基 柠 檬 酸 酐 酰

36、 化 ， 蛋 白 带 负 电 ， 抑制 集 聚产 物 隔 离 法 ， 将 变 性 的 蛋 白 分 子 固 定 化 ， 避 免 其 相互 碰 撞分 子 伴 侣 法 ， GroEL、 GroES、 DnaK， 固 定 化 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的表 达包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操作 包 涵 体 的 复 性 与 重 折 叠 （ refolding） ： 二硫 键 形 成在 包 涵 体 变 性 体 系 中 ， 始 终 存 在 着 还 原 剂 ， 使 多 肽 链 中 的 巯 基 保 持还 原 状 态 ， 防化 学 氧 化 法 （ A） 需 要 电 子 受 体 ， 最 廉 价 的 电

37、子 受 体 为 空 气 ，二 硫 键 形 成 是二 硫 键 交 换 （ B） 需 要 还 原 型 和 氧 化 型 谷 胱 甘 肽 （ GSH和GSSG） ， 二 硫 键止 二 硫 键 错 配 导 致 严 重 的 集 聚 。 在 变 性 操 作 结 束 后 ， 这 些 游 离 型 的巯 基 必 须 重 新配 对 形 成 二 硫 键 ， 此 时 多 肽 链 也 重 新 发 生 折 叠 。 形 成 二 硫 键 的 方 式主 要 有 ： 随 机 的 ， 仅 适 用 于 那 些 不 含 游 离 半 胱 氨 酸 残 基 的 蛋 白 质的 重 折 叠 形 成 相 对 特 异 ， 因 此 适 用 性 较 广

38、， 重 折 叠 效 果 好HS HS S S + 2e+ 2H+A HSHS S-S-R HS+ BR-S-S-R S S2R-SH 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表达 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 的 异 源 蛋 白 按 其 在 细 胞 中 的 定 位 可 分 为 两 种形 式 ： 即 以 可 溶 性 或 不 溶 性 （ 包 涵 体 ） 状 态 存 在 于 细 胞 质 中 ； 或 者 通 过 运 输 或 分 泌 方 式 定 位 于 细 胞 周 质 ， 甚 至 穿 过 外 膜 进 入培 养 基 中 。 蛋 白 产 物 N端 信 号 肽 序 列 的 存 在 是 蛋 白 质 分 泌 的 前 提

39、 条 件 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表达以 分 泌 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优缺 点分 泌 表 达 形 式 的 优点 ： 目 的 蛋 白 稳 定 性 高 重 组 人 胰 岛 素 原 若 分 泌 到 细 胞 周中 ， 其 稳 稳 定 性 大 约 是 在 细 胞 质 中 的 10倍目 的 蛋 白 易 于 分 离目 的 蛋 白 末 端 完 整 相 当 多 的 真 核 生 物 成 熟 蛋 白 N端并 不 含 有 甲 硫 氨 酸 残 基 。 当 这 些 真 核 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 表 达时 ， 蛋 白 质 N端 的 甲 硫 氨 酸 残 基 往 往 不 能 被 切 除 。 如

40、 若 将 外 源基 因 与 大 肠 杆 菌 的 信 号 肽 编 码 序 列 重 组 在 一 起 ， 一 旦 分 泌 型 表达 ， 其 N端 的 甲 硫 氨 酸 残 基 便 可 在 信 号 肽 的 剪 切 过 程 中 被 有 效 除 去 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表 达以 分 泌 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点分 泌 表 达 形 式 的 缺 点 ： 相 对 其 它 生 物 细 胞 而 言 ， 大 肠 杆 菌 的 蛋 白 分 泌 机 制并 不 健 全 。 外 源 真 核 生 物 基 因 很 难 在 大 肠 杆 菌 中 进 行 分泌 型 表 达 ， 少 数 外 源 基 因 既

41、便 能 分 泌 表 达 ， 但 其 表 达 率通 常 要 比 包 涵 体 方 式 低 很 多 ， 因 此 目 前 用 于 产 业 化 的 异源 蛋 白 分 泌 型 重 组 大 肠 杆 菌 尽 管 有 ， 但 并 不 普 遍 。 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表 达蛋 白 质 的 分 泌 机 制原 核 细 菌 周 质 中 含 有 多 种 分 子 伴 侣 可阻 止 分 泌 蛋 白 的 随 机 折 叠 ， 分 泌 在 细胞 周 质 或 培 养 基 中 的 重 组 蛋 白 很 少 形成 分 子 间 的 二 硫 键 交 联 ， 因 此 与 包 涵体 相 比 ， 分 泌 型 重 组 蛋 白 具 有 较

42、高 比例 的 正 确 构 象 ， 生 物 活 性 的 回 收 率 增加 ， 且 对 蛋 白 酶 不 敏 感 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表达分 泌 型 目 的 蛋 白 表 达 系 统 的构 建 包 括 大 肠 杆 菌 在 内 的 绝 大 多 数 革 兰 氏 阴 性 菌 不 能 将 蛋白 质 直 接 分泌 到 胞 外 ， 但 有 些 革 兰 氏 阴 性 菌 能 将 细 菌 的 抗 菌 蛋 白 （ 细菌 素 ） 分 泌到 培 养 基 中 ， 这 一 过 程 严 格 依 赖 于 细 菌 素 释 放 蛋 白 ， 它 激活 定 位 于 膜上 的 磷 酸 酯 酶 ， 导 致 细 菌 内 外 膜 的 通

43、 透 性 增 大 。 因 此 ， 只 要 将 细 菌 素 释 放 蛋 白 编 码 基 因 克 隆 在 一 个 合适 的 质 粒 上即 可 构 建 完 全 分 泌 型 的 受 体 细 胞 。 此 时 ， 用 另 一 种 携 带 大肠 杆 菌 信 号肽 编 码 序 列 和 目 的 基 因 的 表 达 质 粒 转 化 上 述 完 全 分 泌 型 受体 细 胞 ， 并使 用 相 同 性 质 的 启 动 子 介 导 目 的 基 因 的 转 录 ， 则 可 实 现 目的 蛋 白 从 重组 大 肠 杆 菌 中 的 完 全 分 泌 。 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达 除 了 直 接 表 达 异 源 蛋

44、白 外 ， 还 可 将 外 源 基 因 与 受 体 菌 自身 的 蛋 白 质 编 码 基 因 拼 接 在 一 起 ， 并 作 为 一 个 开 放 型 阅 读 框架 进 行 表 达 。 由 这 种 杂 合 基 因 表 达 出 的 蛋 白 质 称 为 融 合 蛋 白 。在 这 种 融 合 蛋 白 结 构 中 ， 通 常 受 体 细 菌 的 蛋 白 部 分 位 于 N端 ，异 源 蛋 白 位 于 C端 。 通 过 在 DNA水 平 上 人 工 设 计 引 入 的 蛋 白 酶切 割 位 点 或 化 学 试 剂 特 异 性 断 裂 位 点 ， 可 以 在 体 外 从 纯 化 的融 合 蛋 白 分 子 中

45、 释 放 回 收 异 源 蛋 白 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达以 融 合 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优缺 点 目 的 蛋 白 稳 定 性 高 尤 其 对 分 子 量 较 小 的 多 肽 效 果 更佳目 的 蛋 白 易 于 分 离 利 用 受 体 蛋 白 成 熟 的 抗 体 、 配 体 、底 物 进目 的 蛋 白 表 达 率 高 与 受 体 蛋 白 共 用 一 套 完 善 的 表 达元 件 胞 内 形 成 良 好 的 空 间 构 象 ， 且 大 多 具 有 水 溶 性 目 的 蛋 白 。 在 实 际 生 产 中 ， 产 品 主 要 的 成 本 往 往 就 在 该 工 段 行 亲

46、 和 层 析 ， 可 以 快 速 获 得 纯 度 较 高 的 融 合 蛋 白目 的 蛋 白 溶 解 性 好 由 于 受 体 蛋 白 的 存 在 ， 融 合 蛋 白往 往 能 在目 的 蛋 白 需 要 回 收 融 合 蛋 白 需 要 裂 解 和 进 一 步 分 离 ，才 能 获 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达融 合 型 目 的 蛋 白 表 达 系 统 的构 建融 合 蛋 白 表 达 质 粒 的 构 建 原则 ： 受 体 细 胞 的 结 构 基 因 能 高 效 表 达 ， 且 其 表 达 产 物 可 以通 过 亲 和层 析 进 行 特 异 性 简 单纯 化两 个 结 构 基 因 拼 接 位

47、点 处 的 序 列 设 计 十 分 重 要 ， 它 直接 决 定 着为 目 的 蛋 白 分 离 回 收 创 造 条 件外 源 基 因 应 装 在 受 体 蛋 白 编 码 基 因 的 下 游 ， 为 融 合 蛋白 提 供 终止 密 码 子 。 在 某 些 情 况 下 ， 并 不 需 要 完 整 的 受 体 结 构基 因 ， 目的 是 尽 可 能 避 免 融 合 蛋 白 分 子 中 两 种 组 份 的 分 子 量 过于 接 近 ，融 合 蛋 白 的 裂 解 工艺两 个 蛋 白 编 码 序 列 应 保 持 一 致 的 翻 译 阅 读 框 架 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达融 合 型 目 的 蛋

48、 白 表 达 系 统 的构 建用 于 融 合 蛋 白 构 建 的 受 体 蛋白 ： 谷 胱 甘 肽 转 移 酶 （ GST） 维 持 良 好 空 间 构 象硫 氧 化 还 原 蛋 白 （ TrxA） 维 持 良 好 空 间 构 象 pTrxFus麦 芽 糖 结 合 蛋 白 （ MBP） 促 进分 泌金 黄 色 葡 萄 球 菌 蛋 白 A（ SAPA） 免 疫 亲 和 层 析 pRIT2T外 膜 蛋 白 （ OmpF） 促 进 分泌 -半 乳 糖 苷 酶 （ LacZ） 免 疫 亲 和 层 析泛 素 蛋 白 （ Ubi） 维 持 良 好 空 间 构 象 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达目 的

49、 蛋 白 的 回收 融 合 蛋 白 中 受 体 蛋 白 部 分 的 存 在 可 能 会 影 响 目 的蛋 白 的 空 间 构 象 和 生 物 活 性 ， 如 果 将 之 注 入 人 体 还 会导 致 免 疫 反 应 ， 因 此 在 制 备 和 生 产 药 用 目 的 蛋 白 时 ，将 融 合 蛋 白 中 的 受 体 蛋 白 部 分 完 整 除 去 是 必 不 可 少 的工 序 。 融 合 蛋 白 的 位 点 专 一 性 断 裂 方 法 有 两 种 ： 化 学 断 裂 法 酶 促 裂 解 法 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达目 的 蛋 白 的 回 收 用 于 蛋 白 位 点 专 一 性 化

50、 学 断 裂 的 最 佳 试 剂 为 溴 化 氰 （ CNBr） 它 与 多 肽链 中 的 甲 硫 氨 酸 残 基 侧 链 的 硫 醚 基 反 应 ， 生 成 溴 化 亚 氨 内 酯 ， 后 者 不 稳 定 ，在 水 的 作 用 下 肽 键 断 裂 ， 形 成 两 个 多 肽 降 解 片 段 其 中 上 游 肽 段 的 甲 硫 氨 酸残 基 转 化 为 高 丝 氨 酸 残 基 ， 而 下 游 肽 段 N端 的 第 一 位 氨 基 酸 残 基 保 持 不 变 。这 一 方 法 的 优 点 是 回 收 率 高 （ 可 达 到 85%以 上 ） ， 专 一 性 强 ， 而 且 所 产 生的 目 的

51、蛋 白 的 N端 不 含 甲 硫 氨 酸 ， 与 真 核 生 物 细 胞 中 的 成 熟 表 达 产 物 较 为接 近 。化 学 断 裂 法 ： 然 而 ， 如 果 异 源 蛋 白 分 子 内 部 含 有 甲 硫 氨 酸 残 基 ， 则 不 能 用 此 方 法 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达目 的 蛋 白 的 回收 酶 促 裂 解 法 ： 单 残 基 位点 蛋 白 内 切酶 切 割 位点梭 菌 蛋 白 酶 Arg-C葡 萄 球 菌 蛋 白 酶 Glu-C假 单 孢 菌 蛋 白 酶 Lys-C猪 胰 蛋 白 酶 Arg-C Lys-C蛋 白 酶 酶 促 裂 解 法 的 特 点 是 断 裂

52、效率 更 高 ，同 时 每 种 蛋 白 酶 均 具 有 相 应 的 断 裂位 点 决 定簇 ， 因 此 可 供 选 择 的 专 一 性 断 裂 位点 范 围 较广 。 几 种 断 裂 位 点 专 一 性 最 强 的 商品 化 蛋 白酶 分 别 在 多 肽 链 中 的 精 氨 酸 、 谷 氨 酸 、 赖 氨酸 残 基 处 切 开 酰 胺 键 ， 形 成 不 含 上述 残 基 的下 游 断 裂 肽 段 ， 与 溴 化 氰 化 学 断 裂法 相 似 。用 上 述 蛋 白 酶 裂 解 融 合 蛋 白 的 前 提条 件 是 外源 蛋 白 分 子 内 部 不 能 含 有 精 氨 酸 、 谷 氨 酸 或赖

53、氨 酸 残 基 ， 如 果 外 源 基 因 表 达 产 物 为 小 分 子 多 肽 ， 这 一 限 制 条 件并 不 苛 刻 ， 但大 分 子 量 的 异 源 蛋 白 来 说 ， 上 述 三 种 氨 基 酸 残 基 的 出 现 频 率 是 相 当高 的 Arg CN N C受 体 蛋白 目 的 蛋白 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表达目 的 蛋 白 的 回收 酶 促 裂 解 法 ： 多 残 基 位点 为 了 克 服 仅 切 单 一 氨 基 酸 残 基 的 蛋 白 酶 所 带 来 的 应 用 局 限 性 ， 可 在 受体 蛋 白 编 码 序 列 与 不 含 起 始 密 码 子 的 外 源 基

54、因 之 间 加 装 一 段 编 码 寡 肽 序 列（ Ile-Glu-Gly-Arg） 的 人 工 接 头 片 段 ， 该 寡 肽 为 具 有 蛋 白 酶 活 性 的 凝 血 因子 Xa的 识 别 和 作 用 序 列 ， 其 断 裂 位 点 在 Arg的 C末 端 。 纯 化 后 的 融 合 蛋 白 用Xa处 理 ， 即 可 获 得 不 含 上 述 寡 肽 序 列 的 目 的 蛋 白 。 由 于 Xa的 识 别 作 用 序 列由 四 个 氨 基 酸 残 基 组 成 ， 大 多 数 蛋 白 质 中 出 现 这 种 寡 肽 序 列 的 概 率 极 少 ， 因此 这 种 方 法 可 广 泛 用 于

55、从 融 合 蛋 白 中 回 收 各 种 不 同 大 小 的 目 的 蛋 白 产 物 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达目 的 蛋 白 的 回 收酶 促 裂 解 法 ： 多 残 基 位 点启 动子 受 体 基因 接头 目 的 基因Met Arg StopLysGluIle-Glu-gly-Arg Ar gLysGluIle-Glu-gly-Arg表 达 亲 和 层析酶 解 回收 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达目 的 蛋 白 的 回 收酶 促 裂 解 法 ： 多 残 基 位 点 Pinpoint Xa tac 生 物 素 结 合 肽 编 码序 列Xa因 子 识 别 位 点 编 码序 列

56、SP6T7Aprori MCS ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCXa-1 Ile Glu Gly Arg GluATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CXa-2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCX

57、a-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotIXa因 子 切 割位 点 寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表 达 从 理 论 上 讲 ， 外 源 基 因 的 表 达 水 平 与 受 体 细 胞 中 可 转 录 基 因 的 拷贝 数 （ 即 基 因 剂 量 ） 呈 正 相 关 。 然 而 重 组 质 粒 除 了 含 有 外 源 基 因 外 ，还 携 带 其 它 的 可 转 录 基 因 ， 如 作 为 筛 选 标 记 的 抗 生 素 抗 性 基 因 等 。 随着 重 组 质 粒 拷 贝 数 的 不 断 增 加 ， 受 体 细 胞 内 的

58、 大 部 分 能 量 和 原 料 被 用于 合 成 所 有 的 重 组 质 粒 编 码 蛋 白 ， 而 细 胞 的 正 常 生 长 代 谢 却 因 能 量 不济 受 到 影 响 ， 因 此 通 过 增 加 质 粒 拷 贝 数 提 高 外 源 基 因 表 达 产 物 的 产 量往 往 不 能 获 得 满 意 的 效 果 。 另 一 种 通 过 增 加 外 源 基 因 剂 量 而 提 高 目 标 蛋 白 产 量 的 有 效 方 法 是构 建 寡 聚 串 联 型 异 源 蛋 白 表 达 载 体 ， 即 将 多 拷 贝 的 外 源 基 因 克 隆 在 一 个 低 拷 贝 质 粒 上 ， 以 取 代 单

59、 拷 贝 外 源 基 因 在 高 拷 贝 载 体 上 表 达 的 策 略 寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表 达以 寡 聚 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点目 的 蛋 白 高 效 表达在 不 提 高 质 粒 拷 贝 数 的 前 提 下 ， 增 加 目 的 基 因 的 拷 贝数 ， 可 以稳 定 表 达 小 分 子 短肽在 一 定 程 度 上 改 善 表 达 量目 的 产 物 回 收 困难短 肽 由 于 缺 乏 有 效 的 空 间 结 构 ， 在 细 菌 细 胞 中 的 半 衰期 较 短 。串 联 短 肽 具 有 与 蛋 白 质 相 似 的 长 度 及 空 间 结 构 ， 因 而抗

60、 蛋 白 酶降 解 的 能 力 大 幅 度 提 高寡 聚 短 肽 需 要 裂 解 和 进 一 步 分 离 ， 才 能 获 最 终 分 子 ，但 裂 解 后的 短 肽 分 子 容 易 出 现 序 列 不 均 一 性 寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表达寡 聚 型 目 的 蛋 白 表 达 系 统 的 构建 P SD gene gene gene gene T1 T2H 2N COOHMet Met Met Met mRNACNBr 基 本 策 略 ： 寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表达寡 聚 型 目 的 蛋 白 表 达 系 统 的 构建构 建 举 例 ：P SD T1 T2EcoRI BamHI

61、AATTCAGATCT GTCTAGAGCCTAGEcoRI Bgl II BamHIEcoRI BamHIBgl II GATCT AGCCTAGEcoRI BamHIBgl IIEcoRI BamHIBgl IIEcoRI + BamHIBgl II + BamHI BamHI 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达以 整 合 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优缺 点 目 的 基 因 稳 定 表达整 合 型 的 目 的 基 因 随 受 体 细 胞 染 色 体 DNA的 复 制 而 复 制 ，在 大多 数 情 况 下 相 当 稳 定 ， 工 程 菌 在 没 有 选 择 压 力 存 在 下可

62、 以 连 续目 的 基 因 表 达 率 低单 拷 贝 整 合 的 目 的 基 因 表 达 率 受 到 限 制 ， 此 时 可 通 过强 化 表 达元 件 而 加 以 补 偿培 养 而 不 丢 失 目 的 基 因 表 达 盒 ， 这 对 以 改 良 物 种 遗 传性 状 为 目的 的 基 因 工 程 案 例 特 别 有 意 义 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 在 生 物 体 细 胞 尤 其 是 原 核 细 菌 细 胞 内 ， 广 泛 存在 着 DNA的 遗 传 重 组 机 制 ， 其 可 能 的 生 物 学 功 效 是促 进 生 物 种 群 的 进 化

63、 。 细 胞 内 的 遗 传 重 组 可 分 为 两大 类 ： 转 位 因 子 依 赖型同 源 序 列 依 赖型 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 转 位 因 子 是 指 生 物 细 胞 内 天 然 存 在 的 一 类 无 复 制 能 力的 DNA可 移 动 因 子 ， 不 同 生 物 种 群 拥 有 结 构 不 同 的 转 位因 子 ， 例 如 ： 转 位 因 子 依 赖 型 的 体 内 重 组 ： 转 位 因 子家 族 噬 菌 体 G片 段 （ G-Fragment） 原 核 细 菌 插 入 顺 序 （ IS） 真 核 细 菌 转 座 子 （ Tn

64、、Ty） 高 等 植 物 可 移 动 因 子 （ Ac、Ds） 高 等 动 物 跳 跃 基 因 （ mobil gene） 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 转 位 因 子 依 赖 型 的 体 内 重 组 ： 转 位 因 子的 结 构IS（ 1 kb）Ty（ 5 kb）Tn（ 2 - 20 kb）ACCATGGTT TTGGTACCA抗 药 性 基因 转 位 酶 基因 识 别 位点 阻 遏 基因IR IRIR IRIS IS 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 转 位 因 子 依 赖 型 的 体 内 重 组 ：

65、整 合 形 式 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 在 很 多 原 核 细 菌 细 胞 中 ， 染 色 体 DNA链 上 的 两 个 同 源 区 之 间可 发 生 所 谓 的 同 源 重 组 ， 其 频 率 与 细 菌 种 类 、 两 个 同 源 区 之 间 的 距离 、 同 源 区 的 长 度 、 同 源 程 度 密 切 相 关 。 一 般 地 说 ， 距 离 越 远 、 长度 越 长 、 同 源 性 越 高 ， 重 组 的 频 率 也 就 越 高 ， 反 之 亦 然 。 同 源 重 组 有 整 合 和 交 换 两 种 形 式 ， 前 者 只 需 要

66、一 个 断 裂 位 点 ，而 后 者 涉 及 两 个 断 裂 位 点同 源 序 列 依 赖 型 的 体 内 重 组 ： 基 本 形 式 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 同 源 序 列 依 赖 型 的 体 内 重 组 ： 同 源 整 合 ori 目 的 基因同 源 区域标 记 基因 整 合 位点染 色 体DNA 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表达DNA体 内 重 组 的 基 本 原理 同 源 序 列 依 赖 型 的 体 内 重 组 ： 同 源 交 换 ori目 的 基因同 源 区域 标 记 基因交 换 区域染 色 体DNAori 标 记 基因 + 蛋 白 酶 抗 性 或 缺 陷 型 表 达 系 统 的 构 建 无 论 是 在 真 核 生 物 还 是 在 原 核 细 胞 中 ， 重 组 目 的 蛋 白表 达 后 都 会 面 临 被 降 解 的 命 运 ， 其 稳 定 性 甚 至 还 不 如 半 衰期 较 短 的 受 体 细 胞 内 源 性 蛋 白 质 。 在 大 多 数 情 况 下 ， 重 组 目 的 蛋 白 的 不 稳 定 性 可 归 结 为