《基因工程载体》PPT课件

《《基因工程载体》PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《基因工程载体》PPT课件（116页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、1 载 体 ： 这 种 能 与 目 的 基 因结 合 ， 且 有 完 整 的 复 制 和转 录 功 能 的 DNA大 分 子 称之 为 载 体 （ vector） 。 2 （ 1） 能 够 在 宿 主 细 胞 中 存 在 并 繁 殖 ， 有 功 能 良 好 的 复 制子 和 启 动 子 ， 使 插 入 基 因 复 制 和 表 达 ；（ 2） 具 有 多 个 限 制 性 内 切 酶 的 切 点 ， 且 切 点 是 单 一 的 ，这 样 可 将 多 个 外 源 DNA片 段 插 入 其 中 ；（ 3） 具 有 容 易 检 测 的 筛 选 标 记 ；（ 4） 载 体 DNA的 分 子 量 适 当 ，

2、 可 容 纳 较 大 的 外 源 DNA片 段 ，又 可 在 受 体 细 胞 内 扩 增 较 多 的 拷 贝 ；（ 5） 在 细 胞 内 稳 定 性 高 ， 这 样 可 以 使 重 组 体 可 以 稳 定 传代 而 不 易 丢 失 。 3 1. 克 隆 载 体 （ cloning vector） ： 主 要 是 对 目 的 基 因 克 隆 ，建 立 DNA文 库 和 cDNA文 库 ， 其 上 有 复 制 子 即 可 ；2. 表 达 载 体 （ expression vector） ： 能 使 目 的 基 因 在 宿主 细 胞 中 表 达 的 一 类 载 体 。 这 类 载 体 既 有 复 制

3、 子 ， 更 要有 强 启 动 子 ；3. 穿 梭 载 体 （ shuttle vector） ： 这 类 载 体 可 以 在 原 核 细胞 中 复 制 ， 也 可 在 真 核 细 胞 中 扩 增 和 表 达 。 4 5 6 7 单 链 切 割 连 接单 链 切 割 连 接 共 价 闭 合 环 形 DNA（ SC型 ）开 环 DNA（ oc型 ）线 性 DNA（ L型 ）环 形 双 链 的 质 粒 DNA分 子 具 有 三 种 不 同 构 型 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 lacZ-半 乳 糖 苷 酶分 解 半 乳 糖i P O调 控 蛋 白 P大 肠 杆 菌 的 -

4、半 乳 糖 苷 酶 基 因 lacZ系 统 18 a-互 补 显 色 反 应 （ 蓝 白 斑 筛 选 ）lacZ -半 乳 糖 苷 酶 -分 解 半 乳 糖i P O调 控 蛋 白 P -肽 段 分 解 X-gal 产 物 呈 现 蓝 色诱 导 剂 IPTG -半 乳 糖 苷 酶 基 因 lacZ突 变 体 M15 19 20 21 (五 )具 有 复 制 起 始 点 (origin, ori) 22 23 1.质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bp Origin of Replication ROPROI Sal I BamH I TcrPvu IPst I Pst

5、 I EcoR ICla IHind III Hind II Bal I Apr pBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 24 25 2.pUC质 粒 载 体 (1)来 自 pBR322质 粒 的 复 制 起 点 (ori)； (2)氨 卞 青 霉 素 抗 性 基 因 (Ampr)， 但 它 的 DNA核 苷 酸 序 列 已 经 发 生 了 变 化 ， 不 再 含 有 原 来的 限 制 酶 的 单 识 别 位 点 ； (3)大 肠 杆 菌 -半 乳 糖 苷 酶 (lacZ)的 启 动 子及 其 编 码 该 基 因 氨 基 端 -肽 链 的 DNA序 列

6、,此结 构 特 称 为 lacZ1基 因 ； (4)多 克 隆 位 点 (MCS)区 段 ： 位 于 lacZ 基 因中 的 靠 近 5 端 ， 内 含 十 几 个 单 一 的 限 制 性 内切 酶 识 别 切 割 位 点 ， 使 含 有 不 同 粘 端 的 目 的DNA片 段 可 方 便 地 定 向 插 入 载 体 中 。 但 它 并 不破 坏 lacZ 基 因 的 功 能 。 pBR3224363 bp Origin of ReplicationROP ROI Sal I BamH I TcrPvu IPst I Pst IEcoR ICla IHind III Hind II Bal I

7、 Apr 26 pUC18 / 19： 拷 贝 数 2000 - 3000 / cell用 于 基 因 克 隆 和 测 序 装 有 多 克 隆 位 点 （ MCS）正 选 择 颜 色 标 记 lacZ BamHI pUC182686 bpAp r lacZ ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396 452EcoRI SstI KpnI SmaI XbaI SalI PstI SphI HindIII 27 28 29 lacZlacZN端 C端 缺 陷 型 大 肠 杆 菌完 整 的 -半 乳 糖 苷 酶 3

8、0 pUC18 / 19： 正 选 择 标 记 lacZ 的 显 色 原 理pUC18/19 Plac lacZMCS b-半 乳 糖 苷 酶 的 a-肽 段ab O HHHOHH OH H OH CH2OH O N Cl Br ClBr Cl Br O N N 5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 基 -b-D-半 乳 糖 苷X-gal 31 32 3.pGEM系 列n 总 长 度 为 2743bpn 含 有 一 个 氨 卞 青 霉 素 抗 性 编 码 基 因 和 一 个 lacZ编 码 基 因n 一 段 含 有 EcoR I、 Sat I、 Kpn I、 Ava I、 Sma I、BamH I、

9、 XbaI、 Sall、 AccI、 Hinc I、 Pst II、Sph I和 Hind II等 识 别 序 列 的 多 克 隆 位 点 。n 此 序 列 结 构 几 乎 与 pUC18克 隆 载 体 的 完 全 一 样 。 33 pGEM系 列 与 pUC系 列 之 间 的 主 要 差 别n pGEM具 有 两 个 来 自 噬 菌 体 的 启 动 子 ， 即 T7启 动 子 和 SP6启动 子 ， 它 们 为 RNA聚 合 酶 的 附 着 作 用 提 供 了 特 异 性 的 识 别位 点 。n 由 于 这 两 个 启 动 子 分 别 位 于 Lac z 基 因 中 多 克 隆 位 点 区的

10、 两 侧 ， 故 若 在 反 应 体 系 中 加 入 纯 化 的 识 别 T7或 SP6启 动子 的 RNA聚 合 酶 ， 便 可 将 已 克 隆 的 外 源 基 因 在 体 外 转 录 出相 应 的 mRNA。n 质 粒 载 体 pGEM-3Z和 pGEM-4Z在 结 构 上 基 本 相 似 ， 两 者 之间 的 差 别 仅 仅 在 于 SP6和 T7这 两 个 启 动 子 的 位 置 互 换 、 方向 相 反 而 已 。 pGEM-3Z：多 拷 贝装 有 两 个 噬 菌 体 的 强 启 动 子装 有 多 克 隆 位 点 （ MCS）正 选 择 颜 色 标 记 lacZ用 于 外 源 基 因

11、 的 高 效 表 达 注 意 ： T7和 SP6启 动 子 特 异 性 地 由 噬 菌 体 DNA编 码 的 RNA聚 合2743 bp MCSlacZ PT7oriApr pGEM-3Z PSP6酶 所 识 别 ， 因 此 相 应 的 受 体 菌 必 须 表 达 噬 菌 体 RNA聚 合 酶 ， 如 ：E.coli BL21（ DE3） 等 35 (二 )表 达 载 体 36 37 38 39 该 载 体 具 有 以 下 优 点 ： 可 诱 导 ， 能 高 效 表 达 所 需 基 因 或 基 因 片 段 。 IPTG可 诱 导 tac启 动 子 进 行 高 效 表 达 。 融 合 蛋 白 极

12、 易 纯 化 。 GST分子 量 为 25kDa， 作 为 一 种 酶 在 大 肠 杆 菌 表 达 或 与外 源 基 因 融 合 表 达 时 ， 与 自 然 界 存 在 的 酶 具 有 相同 的 酶 活 性 ， 用 亲 和 层 析 法 (G1utathione Sepharose 4B)极 易 从 裂 解 液 中 分 离 纯 化 出 融 合蛋 白 ， 也 可 用 显 色 法 或 免 疫 学 方 法 方 便 地 检 测 外源 蛋 白 的 表 达 量 。 40 可 方 便 地 从 融 合 蛋 白 中 获 取 单 一 外 源 蛋 白 。 在pGEX多 克 隆 位 点 上 游 有 一 个 位 点 特

13、异 的 蛋 白 酶(如 凝 血 酶 、 prescission protease， Factor Xa)识 别 和 切 割 位 点 ， 可 方 便 地 将 所 需 蛋 白 从 融 合 蛋白 中 切 出 并 纯 化 。 所 以 ， 近 年 来 该 系 统 已 广 泛 地应 用 于 基 因 表 达 、 分 子 免 疫 学 、 疫 苗 生 产 及 DNA蛋 白 质 相 互 作 用 的 研 究 等 。 41 QIAexpress 6 His表 达 系 统n 该 系 统 为 Ni-NTA基 质 对 带 6个 组 氨 酸 残 基 的 重 组蛋 白 质 具 有 亲 和 层 析 的 高 效 原 核 表 达 系

14、 统 ，n 优 点 ： 6 His比 其 它 标 记 更 小 ， 可 用 于 任 何 表达 系 统 ， 包 括 酵 母 、 杆 状 病 毒 和 哺 乳 动 物 细 胞 表达 系 统 ， 不 影 响 蛋 白 质 的 结 构 和 功 能 ， 无 需 蛋 白酶 把 6 His切 除 。 生 理 pH条 件 下 6 His不 带 电荷 ， 所 以 不 影 响 蛋 白 质 的 分 泌 。 因 5 His免 疫原 性 差 ， 所 以 无 需 去 除 6 His, 重 组 蛋 白 可 直 接用 作 抗 原 产 生 所 需 抗 体 。 42 43 44 GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGAT A

15、 CG环 化 作 用 45图 3-1 噬 菌 体 基 因 组 结 构 46 47 基 因 组 分 为 几 个 不 连 续 的 区 域 ， 三 个 片 段 组 成 ： 48 49 50 调 节 元 件 或 调 节 基 因 产 物 及 功 能PL,OL, PR,OR 左 右 向 转 录 的 启 动 子 和 操 纵 子tR (1,2,3,4,5) 右 向 转 录 的 终 止 子tL(1,2) 左 向 转 录 的 终 止 子PRE C 蛋 白 建 立 启 动 子 ， 受 C 蛋 白 调 控PI int基 因 启 动 子 ， 受 C 蛋 白 调 控PaQ Q蛋 白 反 义 RNA启 动 子 ， 受 C

16、蛋 白 调 控P RM C 蛋 白 基 因 维 持 启 动 子 ， 受 C 浓 度 调 控PR 晚 期 转 录 的 启 动 子nutL, nutR N蛋 白 左 右 两 个 反 终 止 结 合 位 点qut Q蛋 白 反 终 止 结 合 位 点cro PL和 PR的 阻 遏 蛋 白 ， 并 可 阻 遏 PE， 抑 制 CI 表 达cI PL 和 PR 的 主 要 的 阻 遏 物 ， 并 可 自 主 调 控 PRMc 可 以 启 动 PRE 、 PI 和 PAQ， 使 进 入 溶 原 化 途 径 51 c 和 C 组 成 复 合 物 ， 启 动 PE产 生 c 及 cro的 反 义 RNAN t

17、R1, tR2及 tL1的 反 终 止 蛋 白Q tR4的 反 终 止 蛋 白 . O, P DNA复 制 所 需 的 蛋 白S, R, R2 裂 解 宿 主 所 需 的 裂 解 酶int 整 合 酶 ， 使 整 合 到 宿 主 的 染 色 体 中xis 切 除 酶 ， 帮 助 在 att位 点 和 宿 主 连 接bet, exo 重 组 蛋 白 ， 帮 助 和 宿 主 进 行 重 组W, B, N u3, C, D, E, F , F ,Z 头 部 蛋 白 基 因U, V, G, T, H, M, L, K, I, J 尾 部 蛋 白 基 因 cos (cohesive) 12bp的 回 文

18、 序 列 ， 由 线 状 连 接 成 环 状 的 连 接 点 ， A蛋 白 切 割位 点A 末 端 酶 ， 识 别 cos位 点 ， 包 装 时 将 环 连 体 切 成 单 个 的 基 因 组 52 53 噬 菌 体 立 即 进 行 PL和 PR启 动 子 启 动 的 N和 ro基 因 转 录 。 早 期 转 录 产 生 的 N蛋 白 可 使RNA聚 合 酶 越 过 早 期 终 止 子 而 启 动 O、 P和 Q基 因 转 录 。O、 P产 物 与 复 制 有 关 ，Q基 因 蛋 白 则 与 噬 菌 体 的 头 、 尾 部 包 装 和 溶 菌 有 关 。 DNA进 入 复 制 和 滚 环 式

19、复 制 ， 同 时 进 行 包 装 ， 最 后 导 致 细 菌 溶 解 ， 释 放 出 子 代 噬 菌 体 。经 过 40 45min 的 生 长 循 环 ， 释 放 出 约 100 个 感 染 性 噬 菌 体 颗 粒 （ 每 个 细 胞 ） ， 成熟 后 使 细 菌 裂 解 ， 释 放 出 许 多 新 的 有 感 染 能 力 的 病 毒 颗 粒 。 54 （ 二 ） 溶 源 性 生 长 ： 55 基 因 组 太 大 （ 49kb） ； 酶 切 点 太 多 ， 它 有 5个 BamH1位 点 （ GGATCC） ， 6个 Bg 位 点（ AGATCT） ， 5个 EcoR 位 点 （ GAAT

20、TC） 。 野 生 型 只 能 接 纳 一 定 长 度 的 DNA。 若 相 当 于 噬 菌 体 的 75-105%，那 么 只 能 接 纳 49kb 5%=2.45kb的 DNA。 切 去 非 必 须 区 段 ， 在 切 去 的 同 时 ， 加 载 目 的 基 因 （ 2.5kb或 更 大 ） ； 去 处 太 多 的 酶 位 点 ， 每 种 酶 只 留 1-2个 切 口 ； 增 加 标 记 基 因 （ remarke gene） 。(4) 引 入 无 义 突 变 噬 菌 体 的 缺 陷 ： 56 57 1. 噬 菌 体 载 体 的 类 型置 换 型 载 体 ： 可 被 外 源 DNA置 换

21、的 噬 菌 体 非必 需 区 两 侧 有 一 对 限 制 性 酶 切 位 点 的 载 体 ，称 为 置 换 型 载 体 。 插 入 型 载 体 ： 有 一 类 只 含 一 个 限 制 性 位 点 可 供 插入 外 源 DNA的 载 体 ， 这 类 噬 菌 体 载 体 称 插 入 型载 体 。 58 置 换 型 载 体n 特 殊 性 质 ： 中 间 区 域 约 长 18kb， 这 一 段 DNA可 以被 外 源 置 换 而 不 会 影 响 噬 菌 体 裂 解 生 长 的 能 力 。只 有 DNA的 长 度 大 于 野 生 型 噬 菌 体 DNA长 度 的75 而 不 超 过 其 105 时 ，

22、才 能 被 包 装 成 噬 菌 体颗 粒 ， 当 DNA的 长 度 短 于 野 生 型 的 75%或 超 过 105%时 ， 噬 菌 体 的 活 性 就 急 剧 下 降 ， 因 此 要 求 载 体DNA和 外 源 DNA长 度 之 和 在 39 53kb之 间 。 59 这 一 特 殊 性 质 作 为 选 择 标 记 ：n 重 组 子 被 包 装 ： 当 EcoR 切 开 DNA后 ， 目 的 基因 可 以 连 接 于 左 右 两 臂 之 间 ， 形 成 足 够 长 度 的DNA片 段 而 被 包 装 。n 非 重 组 子 不 被 包 装 ： 如 果 没 有 外 源 DNA插 入 ， 由左 右

23、 两 臂 直 接 融 合 起 来 的 缺 损 基 因 ， 由 于 长 度 不足 ， 不 能 包 装 。 60 Xgal蓝 色 噬 菌 斑 试 验n 区 分 重 组 噬 菌 体 形 成 的 噬 菌 斑 和 重 新 恢 复 的 载 体 噬 菌 体 形 成 的 噬 菌 斑 的 方 法 ：n 噬 菌 体 载 体 带 有 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 的 基 因 ， 当 这 种 噬 菌 体 感 染 lac宿 主 细 胞并 在 含 有 X-gal的 培 养 基 上 生 长 时 ， 半 乳 糖 苷 酶 与 X-gal反 应 的 产 物 为 不 溶 性的 靛 蓝 染 料 。 61 加 装 选 择 标 记 la

24、cZlacZ基 因 编 码 b-半 乳 糖 苷 酶 ， 能 催 化 无 色 的 X-gal生 成 蓝 色 化 合 物 。 当 外 源 基 因 插 入 到 lacZ基 因 中 ， 基 因 灭 活 ， 不 能 合 成 蓝 色 化 合 物 ； 而空 载 体 l-DNA则 产 生 蓝 色 透 明 斑 62 63 插 入 型 载 体 ：n 有 一 类 只 含 一 个 限 制 性 位 点 可 供 插 入 外 源 DNA的载 体 ， 这 类 噬 菌 体 载 体 称 插 入 型 载 体 。 失 去 了 非 必 需 区 仅 保 留 了 EcoR 的 单 一 切 点 切 点 又 位 于 报 告 基 因 上 ， 故

25、 在 切 开 DNA并 插 入 外源 基 因 后 ， 报 告 基 因 失 活 ， 即 可 依 此 进 行 重 组 体的 筛 选 可 插 入 长 度 为 10kb的 外 源 DNA 64 插 入 型 载 体 -n c 基 因 内 保 留 Hind 和 EcoR 单 酶 切 位 点 ， 当 有 外 源DNA在 这 酶 切 位 点 插 入 时 ， 使 c 基 因 失 活 ， 感 染 hf -大 肠 杆 菌 后 可 形 成 空 斑 。 65 插 入 型 载 体 - 66 注 意 ： 噬 菌 载 体 作 为 载 体 ， 其 重 组 噬 菌 体 DNA大 小 只 能 ： 38kb 52kb。体 外 包 装

26、 ： 噬 菌 载 体 + 尾 部 蛋 白 + 头 部 蛋 白 67 68 1.粘 粒 的 组 成 及 性 质 ：n 它 的 大 小 一 般 5-7kb 左 右 ， 用 来 克 隆 大 片 段 DNA 克 隆 的 最 大 DNA 片 段 可 达 45kbn 质 粒 复 制 起 点 （ colE1） 象 质 粒 一 样 转 化 和 增殖n 抗 性 标 记 amprn cos位 点n 有 的 粘 粒 载 体 含 有 两 个 cos位 点 69 pHC796400 bp Tcrl fragmentcosoriApr PstI BamHI SalIl-DNA cos序 列 和 质 粒 复 制 子 的co

27、s site - carrying plasmid 1.8 kb的 l-DNA片 段 + pBR322片 段 装 载 范 围 为 31 - 45 kb 70 2.柯 斯 质 粒 pHC79系 71 3.柯 斯 质 粒 有 以 下 优 越 性 ： 72 73 4.采 用 柯 斯 质 粒 作 载 体 的 困 难 74 75 76 77 四 、 M13 噬 菌 体 载 体n 单 链 DNA噬 菌 体 是 一 类 丝 状 的 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 ，由 单 链 环 状 DNA分 子 外 面 包 裹 上 一 层 蛋 白 质 外 壳而 成 。n M13噬 菌 体 是 单 链 DNA噬 菌 体 中 的

28、 一 个 典 型 的 代 表 。 78 1.M13噬 菌 体 的 组 成 和 结 构n M13噬 菌 体 颗 粒 是 丝 状 的 ， 只 感 染 雄 性 大 肠 杆 菌 。感 染 宿 主 后 不 裂 解 宿 主 细 胞 ， 而 是 从 感 染 的 细 胞中 分 泌 出 噬 菌 体 颗 粒 ， 宿 主 细 胞 仍 能 继 续 生 长 和分 裂 。 79 80 n 单 链 DNA， 由 6407碱 基 组 成 。n 90%以 上 的 序 列 可 编 码 蛋 白 质 ， 共 有 11个 编 码 基 因n 基 因 之 间 的 间 隔 区 多 为 几 个 碱 基 。 较 大 的 间 隔 位 于 基 因

29、和 基 因 以 及 基 因 和 基 因 之 间 ， 其 间 有 调 节 基 因 表 达 和 DNA合 成 的 元 件 。2.M13噬 菌 体 的 基 因 组n 编 码 3类 蛋 白 质 ： 复 制 蛋 白 （ 基 因 ， 和 ） 形 态 发 生 蛋 白 （ 基 因 ， 和 ） 结 构 蛋 白 （ 基 因 、 、 、 和 ） 81 3. M13噬 菌 体 载 体 的 构 建 M13噬 菌 体 作 为 载 体 具 有 几 个 重 要 的 特 点 ： M13噬 菌 体 的 感 染 与 释 放 不 会 杀 死 宿 主 菌 ， 仅 导 致 宿 主 菌生 长 缓 慢 ； M13噬 菌 体 DNA在 宿 主

30、 菌 内 既 可 以 是 单 链 也 可 以 是 双 链 ，通 过 感 染 或 转 化 的 方 法 能 将 M13噬 菌 体 DNA导 人 宿 主 菌 中 ； M13噬 菌 体 的 包 装 不 受 DNA大 小 的 限 制 ， 其 噬 菌 体 颗 粒 的大 小 可 随 DNA的 大 小 而 改 变 ， 即 使 DNA的 大 小 比 本 身 DNA的大 小 超 出 6倍 ， 仍 能 进 行 包 装 。 82 M13噬 菌 体 作 为 载 体 具 有 几 个 重 要 的 特 点 ： M13噬 菌 体 在 用 作 载 体 时 是 利 用 其 双 链 状 态 的 RF DNA： 单 链 DNA的 酶

31、切 和 连 接 是 比 较 困 难 的 。 外 源 片 段 插 入 位 点 在 基 因 和 基 因 之 间 的508bp间 隔 区 -M13不 像 噬 菌 体 基 因 组 那 样 含 有 较 大 的 可替 代 区 。 它 的 基 因 组 中 绝 大 多 数 为 必 需 基 因 ， 只 有 两 个 间 隔 区 可用 来 插 入 外 源 DNA（ 基 因 / 和 基 因 / 之 间 ） 。 83 4.mp系 列 载 体 84 85 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13 DNA载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNA III VI I IV

32、II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker 86 87 n 如 果 将 未 置 换 的 载 体 转 人 携 带 有 F 附 加 体 的 宿 主 菌 中 ，并 放 在 含 有 异 丙 基 硫 代 - -D-半 乳 糖 苷 (IPTG)和 X-gal的培 养 基 上 ， 就 会 产 生 蓝 色 噬 斑n 在 M13mp1的 LacZ区 域 插 入 外 源 基 因 片 段 ， 便 会 破 坏 -互补 作 用 ， 结 果 产 生 的 克 隆 重 组 体 仅 形 成 淡 蓝 色 或 无 色 的噬 斑n 通 过 观 察 噬 斑 颜 色 的 变 化 ， 就 能 很 容

33、 易 识 别 和 挑 选 重 组体 。 88 89 M13mp18 和 M13mp19n 这 两 个 载 体 含 有 13 个 不 同 的 酶 切 位 点 ， 可 供 插 入 由 多 种 各 不相 同 的 限 制 酶 切 割 而 成 的 DNA 片 段 ， 这 两 种 载 体 只 是 在 lacZ 区 内 不 对 称 的 多 克 隆 区 的 方 向 上 有 所 不 同 。n 当 RF DNA被 两 种 不 同 的 限 制 酶 切 割 以 后 ， M13mp18 和 M13mp19 轻 易 不 能 重 新 环 化 。 仅 当 连 接 混 合 液 中 含 有 带 匹 配 末 端 的 外 源双 链

34、DNA片 段 时 ， 方 可 闭 合 成 环 。 90 M13mp18 和 M13mp19n 这 一 片 段 在 M13mp18 和 M13mp19 中 将 以 两 个 互 为 相 反 的 方 向 插 入 。 这 样 一来 ， 在 M13mp18 的 正 链 中 含 有 外 源 DNA 双 链 的 其 中 一 条 链 ， 而 在 M13mp19 正 链 中 则 含 有 外 源 DNA 的 另 一 条 链 ， 即 M13mp18 重 组 体 的 子 代 噬 菌 体 内 含有 外 源 DNA 的 一 条 链 ， M13mp19重 组 体 的 子 代 噬 菌 体 内 则 含 有 它 的 互 补 链

35、。n 故 用 M13mp18 和 M13mp19 作 为 一 对 载 体 ， 就 可 能 用 一 个 引 物 （ 通 用 引 物 ） ，从 所 插 入 DNA 片 段 的 任 一 端 开 始 ， 测 定 互 为 相 反 的 两 条 链 的 DNA 序 列 ， 并可 制 备 只 与 外 源 DNA的 任 意 一 条 链 互 补 的 DNA探 针 。 91 M13噬 菌 体 产 生 单 双 链 DNA的 机 制 ：1、 以 （ +） 链 DNA为 摸 板 ， 合 成 互 补 （ ） 链 ， 该 双 链 称 复 制 型 DNA（ RFDNA） 。2、 RFDNA在 宿 主 细 胞 内 能 快 速 增

36、 殖 ， 可 增 加 到 每 个 细 胞 约 200个 拷 贝 。3、 单 链 特 异 的 DNA结 合 蛋 白 结 合 在 （ +） 链 上 ， 从 而 阻 断 了 其 互 补 链 ，即 （ ） 链 的 合 成 ， 这 样 ， 细 胞 就 会 不 断 的 合 成 （ +） 链 DNA 。4、 游 离 出 来 的 （ +） 链 DNA先 与 基 因 V的 编 码 产 物 形 成 特 异 的 DNA-蛋 白质 复 合 物 ， 然 后 转 移 到 寄 主 细 胞 膜 ， 同 时 基 因 V的 蛋 白 质 从 （ +） DNA链 上 脱 落 下 来 ， 余 下 的 M13（ +） 链 DNA则 是

37、从 其 感 染 的 寄 主 细 胞 的 细胞 膜 溢 出 的 过 程 中 ， 被 外 壳 蛋 白 包 装 成 病 毒 颗 粒 的 。 92 + +- +- +-+- +-+- 单 链 结 合 蛋 白RF型 DNA 复 制 约200copy+ + + 以 -链 DNA为 模板 合 成 +链 DNA 93 94 第 三 节 其 他 载 体 95 病 毒 载 体 概 述 （ 1）要 求 ： 1、 携 带 外 源 基 因 并 能 包 装 成 感 染 性 病 毒 颗 粒 2、 介 导 外 源 基 因 转 移 和 表 达 3、 对 机 体 不 致 病容 量 ： 自 身 基 因 组 大 小 的 105%11

38、0% 类 型 ： 1、 重 组 型 病 毒 载 体 2、 无 病 毒 基 因 的 病 毒 载 体 复 制 缺 陷 型 可 复 制 型 复 制 缺 陷 型组 成 ： 1、 病 毒 复 制 和 包 装 元 件 2、 病 毒 基 因 3、 插 入 的 外 源 基 因 或 元 件 4、 病 毒 外 壳 /外 膜 用 途 ： 基 因 转 移 和 表 达 1、 基 因 治 疗 2、 疫 苗 3、 器 官 移 植 4、 组 织 工 程 5、 转 基 因 动 物 6、 基 因 功 能 研 究 一、病毒载体 96 病 毒 载 体 概 述 （ 2）优 点 ： 1、 利 用 病 毒 天 然 的 感 染 性 进 入

39、细 胞 ， 转 导 效 率 高 ； 2、 复 杂 的 装 配 过 程 由 细 胞 完 成 ； 3、 不 同 的 病 毒 载 体 具 有 不 同 的 表 达 特 点 。存 在 的 问 题 ： 1、 安 全 性2、 靶 向 性3、 有 效 性 细 胞 毒 性染 色 体 毒 性免 疫 毒 性转 导 靶 向 性转 录 靶 向 性 转 导 效 率靶 向 性基 因 表 达 水 平 和 持 续 时 间表 达 的 可 调 控 性 97 病 毒 载 体 生 物 学 特 性 适 用 范 围反 转 录 病 毒 载 体 单 链 R N A 病 毒 810kb 可 感 染 分 裂 细 胞 ；整 合 到 染 色 体 中

40、；表 达 时 间 较 长 ；有 致 癌 的 危 险 ； E x vivo 基 因 治 疗 ；肿 瘤 基 因 治 疗 。腺 病 毒 载 体 双 链 D N A 病 毒 36k b 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ；不 整 合 到 染 色 体 中 ；外 源 基 因 表 达 水 平 高 ；表 达 时 间 较 短 ；免 疫 原 性 强 ； In vivo 基 因 治 疗 ；肿 瘤 基 因 治 疗 ；疫 苗 。A AV 病 毒 载 体 单 链 D N A 病 毒 5kb 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ；整 合 到 染 色 体 中 ；无 致 病 性 ； 免 疫 原 性 弱 ；可

41、长 期 表 达 外 源 基 因 ；在 骨 骼 肌 、 心 肌 、 肝 脏 、 视 网 膜 等 组 织 中 表 达 较 高 ； In vivo 基 因 治疗 ；E x vivo 基 因 治 疗 ；遗 传 病 基 因 治 疗 ； 获 得 性 慢 性 疾 病 的基 因 治 疗 。H SV 病 毒 载 体 双 链 D N A 病 毒 152k b 具 有 嗜 神 经 性 ； 可 逆 轴 突 传递 ；可 潜 伏 感 染 ；容 量 大 ；可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 神 经 系 统 疾 病 的 基因 治 疗 ；肿 瘤 的 基 因 治 疗 。 常 用 的 病 毒 载 体 的 特 点 ： 9

42、8 Ti质 粒 是 一 种 细 菌 质 粒 ， 它 自 然 存 在 于 土 壤 农 杆 菌 细 胞中 。 土 壤 农 杆 菌 可 感 染 大 多 数 双 子 叶 植 物 的 受 伤 部 位 ， 使 之产 生 冠 瘿 瘤 (grown gall tumors)。 致毒区 Ti质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与Ti质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 Ti 质 粒 。 Ti质 粒 的 一 部 分DNA叫 做 转 移 DNA（ T-DNA） ， 当 T-DNA整 合 到 宿主 植 物 细 胞 的 染 色 体 后 ， 就

43、诱 导 出 根 瘤 ， 并 使 根 瘤 细 胞合 成 冠 瘿 碱 (opine),作 为 土壤 农 杆 菌 的 碳 源 和 氮 源 。 二 、 Ti质 粒 99 （1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。 T-DNA两 端 各 有 一 段 25bp的 重 复 序 列 (LB, RB)。 T-DNA携 带 的 致 瘤 基 因 是 一 些 与 激 素 合 成 有 关 的 基 因 ， 由 于 激 素合 成 基 因 使 细 胞 处 于 不 停 的 分 裂 状 态 ， 形 成 冠 瘿 瘤 ， 不 能进 行

44、 细 胞 分 化 。Ti质 粒 改 造 后 才 能 应 用 于 植 物 的 基 因 工 程 。 保 留 T-DNA两 端 的 末 端 序 列 ， 然 后 用 外 源 DNA插 入 或 直 接 取 代 野 生 型T-DNA的 部 分 基 因 ， 使 转 化 的 植 物 细 胞 不 具 有 成 瘤 能 力 。 100 （ 2） Vir区 （ virolence region）Vir区 段 上 的 基 因 与 T-DNA从 细 菌 转 移 到 植 物 细 胞 的 遗 传 过 程有 关 ， 区 段 上 的 基 因 能 够 使 农 杆 菌 表 现 出 毒 性 ， 故 称 之 为 毒性 区 。 Vir区

45、段 总 长 度 大 约 35kb， 由 7个 互 补 群 组 成 ， 分 别 命名 为 VirA、 VirB、 VirC、 VirD、 VirE、 VirG和 VirH。（ 3） Con区 (regions encoding conjugations) 该 区 段 上 存 在 着 与 细 菌 间 接 合 转 移 的 有 关 基 因 （ tra） ， 调 控Ti质 粒 在 农 杆 菌 之 间 的 转 移 。 （ 4） Ori区 (origin of replication) 该 区 段 基 因 调 控 Ti质 粒 的 自 我 复 制 ， 故 称 之 为 复 制 起 始 区 。 101 （ 1）

46、双 元 载 体 系 统 （ binary vector）具 有 两 个 质 粒 穿 梭 质 粒 和 Ti质 粒 。（ 2） 共 整 合 载 体 （ integrated vector）共 整 合 载 体 系 统 包 括 在 T-DNA上 的 激 素 合 成 区 经过 突 变 后 的 Ti质 粒 和 中 间 载 体 两 部 分 。Ti质 粒 的 衍 生 载 体 102 三 、 酵 母 人 工 染 色 体 载 体 （ yeast artificial chromosome, YAC） 四 、 细 菌 人 工 染 色 体 （ bacterial artificial chromosome, BAC）

47、 动 物 病 毒 DNA改 造 的 载 体 （ 如 腺 病 毒 、 腺 病 毒 相 关 病 毒 、逆 转 录 病 毒 ） 103 人 基 因 组 十 分 庞 大 ， 约 含 4 109bp， 建 立和 筛 选 人 的 基 因 组 文 库 ， 要 求 有 容 量 更 大 的载 体 ， 酵 母 人 工 染 色 体 （ yeast artificial chromosome,YAC） 载 体 应 运 而 生 。 YAC含有 酵 母 染 色 体 端 粒 （ telesome） 、 着 丝 点(centromere)及 复 制 起 点 等 功 能 序 列 ， 可 插入 长 度 达 200-500kb的

48、外 源 DNA， 导 入 酵 母细 胞 可 以 随 细 胞 分 裂 周 期 复 制 繁 殖 供 作 克 隆， 成 为 人 基 因 组 研 究 计 划 的 重 要 104 the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome 105 106 正 常 酵 母 人 工 染 色 体 含 有 ：* 四 膜 虫 端 粒 （ tel)* 酵 母 自

49、主 复 制 序 列 （ ARS)* 酵 母 着 丝 点 (CEN)酵 母 的 选 择 标 记 (TRP1、 URA1) YAC载 体 107 BAC载 体 108 Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and

50、 regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. 109 110 PAC载 体 111 四 种 常 用 载 体 的 比 较* 外 源

51、DNA如 超 过 10kb， 则 重 组 质 粒 的 转 化 率 和 DNA得 率 都 非 常 低* 已 有 个 别 材 料 可 用 于 此 目 的 112 质 粒 和 噬 菌 体 载 体 只 能 在 细 菌 中 繁 殖 ， 不 能 满 足真 核 DNA重 组 需 要 。 感 染 动 物 的 病 毒 可 改 造 用 作 动物 细 胞 的 载 体 。 由 于 动 物 细 胞 的 培 养 和 操 作 较 复 杂 、花 费 也 较 多 ， 因 而 病 毒 载 体 构 建 时 一 般 都 把 细 菌 质粒 复 制 起 始 序 列 放 置 其 中 。 使 载 体 及 其 携 带 的 外 来序 列 能 方

52、 便 地 在 细 菌 中 繁 殖 和 克 隆 ， 然 后 再 引 入 真核 细 胞 。 目 前 病 毒 载 体 常 用 者 有 改 造 来 自 猴 肾 病 毒SV40（ Simian Virus 40） 、 逆 转 录 病 毒 和 昆 虫 杆 状 病毒 等 ， 使 用 这 些 病 毒 载 体 的 目 的 多 为 将 目 的 基 因 或序 列 放 入 动 物 细 胞 中 表 达 或 试 验 其 功 能 、 或 作 基 因治 疗 等 。 113 猴 病 毒 40（ SV40） 的 基 因 组 常 用 来 作 为 克 隆 载 体 ，把 外 源 DNA转 入 哺 乳 类 细 胞 。 猴 病 毒 40是

53、 球 形 动 物 病毒 ， 直 径 40nm， 呈 20面 体 ， 有 一 个 共 价 闭 环 的 双 链DNA基 因 组 ， 全 长 5244bp。 它 在 猴 肾 中 增 殖 。 被SV40感 染 的 细 胞 都 会 出 现 SV40的 T抗 原 。 早 已 证 明 完整 的 小 鼠 染 色 体 珠 蛋 白 基 因 （ 包 括 所 有 的 间 插 顺 序和 两 侧 顺 序 ） 整 合 在 SV40中 后 ， 在 被 感 染 的 猴 肾 细 胞中 都 能 正 确 地 转 录 和 翻 译 。 表 明 猴 肾 细 胞 的 拼 接 系 统能 有 效 地 处 理 小 鼠 珠 蛋 白 的 初 级 转

54、录 本 。 114 SV40作 为 克 隆 载 体 有 其 局 限 性 ： SV40基 因 组 的 晚 期 功 能 区 的 裂 解 性 ， 不 利 于 外源 DNA的 重 组 和 表 达 ； 早 期 功 能 区 与 病 毒 的 致 癌 性 有 关 ， 使 用 时 有 顾虑 ； 重 组 DNA片 段 的 大 小 受 体 限 制 。 115 逆 转 录 病 毒 是 RNA病 毒 ， 它 有 三 个 基 因 ： gag-编 码病 毒 的 核 心 蛋 白 ； pol-编 码 逆 转 录 酶 ； env-编 码 病 毒的 被 膜 糖 蛋 白 。 有 的 逆 转 录 病 毒 还 带 有 癌 基 因（ vo

55、nc） ， 即 有 的 逆 转 录 病 毒 有 致 癌 作 用 。 近 年 来 ，已 设 计 构 建 成 一 些 缺 陷 型 病 毒 （ defective virus） 使逆 转 录 病 毒 成 为 有 用 的 基 因 载 体 ， 成 功 地 把 抗 药 性基 因 转 入 了 人 体 造 血 前 体 细 胞 ， 并 在 细 胞 中 表 达 。 116 Hock等 选 用 了 缺 失 编 码 病 毒 外 壳 蛋 白 基 因 的 逆 转 录 病 毒 ， 因此 不 能 合 成 自 身 的 外 壳 ， 但 它 有 识 别 外 壳 蛋 白 进 行 包 装 的 信 号（ 一 段 尚 未 鉴 定 的 DN

56、A顺 序 ） 。 用 这 种 缺 陷 的 逆 转 录 病 毒 去 感染 某 种 细 胞 株 ， 这 种 细 胞 株 包 含 有 辅 助 病 毒 （ helper virus） 。辅 助 病 毒 能 合 成 蛋 白 外 壳 ， 但 缺 失 了 识 别 蛋 白 外 壳 进 行 包 装 的信 号 ， 因 此 它 不 能 包 装 成 病 毒 颗 粒 。 当 用 逆 转 录 病 毒 感 染 细 胞株 后 ， 逆 转 录 病 毒 的 RNA进 入 辅 助 病 毒 的 外 壳 蛋 白 ， 成 为 病 毒颗 粒 。 这 时 把 受 感 染 的 细 胞 同 骨 髓 细 胞 一 起 培 养 ， 包 装 在 辅 助病 毒 外 壳 蛋 白 中 的 逆 转 录 病 毒 RNA， 进 入 骨 髓 细 胞 ， 病 毒 DNA插 入 宿 主 细 胞 基 因 组 ， 基 因 的 活 性 得 到 表 达 。 这 时 ， 由 于 骨 髓细 胞 里 面 没 有 辅 助 病 毒 ， 所 以 整 合 进 宿 主 基 因 组 的 逆 转 录 病 毒 ，不 再 有 外 壳 蛋 白 可 供 包 装 ， 因 此 也 就 无 法 增 殖 ， 而 只 能 被 “ 陷 ”在 宿 主 基 因 组 中 ， 通 过 细 胞 分 裂 而 传 给 下 一 代 子 细 胞 。