《CR的原理与应用》PPT课件

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1、 Kary B. Mullis (1944 -)，在 Cetus公 司 工 作 期 间 ，发 明 了 PCR。 他 原 本 是要 合 成 DNA引 物 来 进 行测 序 工 作 ， 却 常 为 没 有足 够 多 的 模 板 DNA而 烦恼 。 1983年 春 夏 之 交 的一 个 晚 上 ， 他 开 车 去 乡下 别 墅 的 路 上 萌 发 了 用引 物 （ 而 不 是 一 个引 物 ） 去 扩 增 模 板 DNA 的 想 法 . Mullis开 车 的 时 候 , 瞬 间 感 觉 两 排 路 灯 就 是 DNA的 两 条 链 ， 自 己 的 车 和 对 面开 来 的 车 象 是 DNA聚 合

2、 酶 ， 面 对 面 地 合 成 着 DNA， 1983年 9月 中 旬 。 美 国 黄 石 国 家 公 园 Thermus aquaticus The Thermusaquaticus DNApolymeraseTaqNot permanentlydestroyed at 94COptimaltemperature is 72C Taq DNA聚 合 酶 (Thermus aquaticus， Cetus/Roche)Tth DNA聚 合 酶 (Thermus thermophilus， Toyobo)Pfu DNA聚 合 酶 （ Pyrococcus furiosus， Stratagen

3、e） Deep Vent DNA聚 合 酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚 合 酶 （ Thermus flavus， Promega)Tli DNA聚 合 酶 (Thermococcus litoralis， Promega) Vent DNA聚 合 酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚 合 酶 ( Pyrococcus woesei， Roche)Pfx DNA聚 合 酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)Dynazyme DNA聚 合 酶 （ Thermus brockianus， Finnazyme）FD DNA聚 合 酶 (

4、Thermus sterophilus？ ， 复 旦 大 学 ) Tma, Tne, KOD, 三 个 水 浴 锅 ， 用 手 移 动 （ Mullis等 人 当 时 用 的 ） 电 加 热 块 自 来 水 冷 却 （ PE， 1988） 电 加 热 块 内 置 循 环 液 冷 却 （ PE， 1989） 三 个 加 热 块 机 械 手 （ Stratagene， 1994） 半 导 体 制 冷 和 加 热 （ MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温 度 梯 度 , 荧 光 检 测 (如 Roche的 Lightcycler) 风 加 热 Lab-on-chip式 的 P

5、CR仪 (所 谓 的 芯 片 PCR) 1991年 出 现 三 个 水 浴 锅 +机 械 手 的 原 始 PCR仪 （ 华 美 ， 复 日 等 ） 现 在 以 半 导 体 （ Peltier板 ） 制 冷 式 为 主 （ 杭 州 博 日 ,上 海 天 呈 , 厦 门安 普 利 等 ） 1983年 春 ， Mullis发 展 出 PCR的 概 念 ； 1983年 9月 ， Mullis用 大 肠 杆 菌 DNA聚 合 酶 做 了 第 一 个 PCR实验 ， 只 用 一 个 循 环 ； 1983年 12月 ， 用 同 位 素 标 记 法 看 到 了 10个 循 环 后 的 49 bp长 度的 第

6、一 个 PCR片 断 ； 1985年 12月 20日 ， Mullis的 同 事 Saiki在 Science上 发 了 一 篇论 文 ， 方 法 中 用 了 PCR技 术 ， 导 致 Mullis的 文 章 到 处 被 拒 ； 1985年 10月 25日 申 请 了 PCR的 专 利 ， 1987年 7月 28日 批 准（ 专 利 号 4,683,202 ） ， 这 回 Mullis是 第 一 发 明 人 。 1986年 5月 ， Mullis在 冷 泉 港 实 验 室 做 专 题 报 告 ， 全 世 界 从 此 开始 学 习 PCR的 方 法 ； 1986年 6月 ， Cetus公 司 纯

7、 化 了 第 一 种 高 温 菌 DNA聚 合 酶 ， Taq DNA polymerase， 这 是 85年 春 天 Mullis建 议 做 的 ； 1988年 ， 第 一 台 PCR仪 问 世 ； 1991年 ， Hoffman LaRoche以 3亿 美 元 的 代 价 从 Cetus公 司 获得 全 权 开 发 权 。 Mullis的 上 司 有 句 “ 名 言 ” ， “ 我 们要 扩 增 这 么 多 DNA样 品 有 什 么 用 ” ； 到 了 1991， Cetus公 司 以 3亿 美 元 的转 让 费 将 PCR相 关 专 利 转 让 给 瑞 士Hoffman LaRoche公

8、 司 ， 并 在 此 后的 经 营 中 又 获 得 了 数 亿 美 元 的 分 红 ； Mullis于 1993年 获 得 诺 贝 尔 化 学 奖 ， T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green 过

9、 程（ 一 ） PCR的 基 本 原 理 （ 二 ） PCR的 种 类1.普 通 PCR 样 品 正 对 照 负 对 照 标 准 分 子 量 （ 二 ） PCR的 种 类2.RT-PCR： 反 转 录 PCR(reverse transcriptase-PCR)原 理 ： RNA的 反 转 录 （ RT） 和 cDNA的 聚 合 酶 链 式 扩 增 （ PCR） 相 结合 的 技 术 。 首 先 经 反 转 录 酶 的 作 用 从 RNA合 成 cDNA， 再 以 cDNA为模 板 ， 扩 增 合 成 目 的 片 段 。特 点 ： 作 为 模 板 的 RNA可 以 是 总 RNA、 mRNA或

10、 体 外 转 录 的 RNA产 物 。无 论 使 用 何 种 RNA， 关 键 是 确 保 RNA中 无 RNA酶 和 基 因 组 DNA的 污 染 。用 于 反 转 录 的 引 物 可 视 实 验 的 具 体 情 况 选 择 随 机 引 物 、 Oligo dT 及 基 因 特 异 性 引 物 (GSP)中 的 一 种 。 对 于 短 的 不 具 有 发 卡 结 构 的 真核 细 胞 mRNA， 三 种 都 可 。 应 用 ： RT-PCR技 术 灵 敏 而 且 用 途 广 泛 ， 分 析 基 因 的 转 录 水 平 ， 细 胞 中 RNA病 毒 的 含 量 ， 直 接 克 隆 特 定 基

11、因 的 cDNA序 列 。 两 步 法 RT-PCR示 意 图一 步 法 RT-PCR示 意 图 两 步 法 RT-PCR 一 步 法 RT-PCR起 始 第 一 链 cDNA合 成 使 用 ： 起 始 第 一 链 合 成 使 用Oligo(dT)， 随 机 六 聚 体 ， GSP引 物 GSP引 物优 点 优 点灵 活 方 便引 物 选 择 扩 增 酶 同 逆 转 录 酶 预 先 混 合扩 增 酶 的 选 择 转 管 步 骤 少 ， 减 少 污 染 可 能 性困 难 RT-PCR的 优 化 能 力 高 灵 敏 度适 用 于 在 单 个 样 品 中 检 测 几 个 mRNA 适 用 于 大 量

12、 样 品 分 析一 步 法 和 两 步 法 RT-PCR的 比 较 EcoRI 寡 聚 (dT)12-18随 机 6碱 基 引 物 R6寡 聚 (dT)12-18 随 机 6碱 基 引 物 R6mRNA (A)n(T)12-18(A)n(A)n(T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6第 二 链 合 成(A)n(T)12-18 (A)nR6 R6 R6 R6 R6 R6 (A)n(T)12-18 EcoRI加 上 EcoRI接 头 ， 磷 酸 化 ， cDNA分 级cDNA合 成 完 毕 ， 准 备 连 接第 一 链 合 成cDNA合 成 过 程 示 意 图 cDNA序 列 的 克

13、隆 （ 二 ） PCR的 种 类2.Nested PCR： 巢 式 PCR原 理 ： 利 用 两 套 PCR引 物 （ 巢 式 引 物 ） 对 进 行 两 轮 PCR扩 增 反 应 。在 第 一 轮 扩 增 中 ， 外 引 物 用 以 产 生 扩 增 产 物 ， 此 产 物 在 内 引 物 的存 在 下 进 行 第 二 轮 扩 增 。优 点 ： 由 于 巢 式 PCR反 应 有 两 次 PCR扩 增 ， 从 而 降 低 了 扩 增 多 个 靶位 点 的 可 能 性 （ 因 为 与 两 套 引 物 都 互 补 的 引 物 很 少 ） 增 加 了 检 测的 敏 感 性 ； 两 对 PCR引 物 与

14、 检 测 模 板 的 配 对 ， 增 加 了 检 测 的 可 靠 性 ；增 加 有 限 量 靶 序 列 （ 如 稀 有 mRNA） 的 灵 敏 度 ， 并 且 提 高 了 困 难 PCR（ 如 5RACE） 的 特 异 性 。应 用 ： 一 般 应 用 于 动 物 方 面 。 如 ： 病 毒 ， 梅 毒 螺 旋 体 ， HIV， 肿 瘤 基 因 等 。 Nested PCR原 理 示 意 图 First PCRSecond PCR （ 二 ） PCR的 种 类3.Inverse PCR： 反 向 PCR原 理 ： 用 适 当 的 限 制 性 内 切 裂 解 含 核 心 区 的 DNA， 以 产

15、 生 适 合于 PCR扩 增 大 小 的 片 段 ， 然 后 片 段 的 末 端 再 连 接 形 成 环 状 分 子 。PCR的 引 物 同 源 于 环 上 核 心 区 的 末 端 序 列 ， 但 其 方 向 可 使 链 的延 长 经 过 环 上 的 未 知 区 而 不 是 分 开 引 物 的 核 心 区 。 这 种 反 向PCR方 法 可 用 于 扩 增 本 来 就 在 核 心 区 旁 边 的 序 列 ， 还 可 应 用 于制 备 未 知 序 列 探 针 或 测 定 边 侧 区 域 本 身 的 上 、 下 游 序 列 。 优 点 ： 可 使 已 知 序 列 的 核 心 区 边 侧 的 未 知

16、 DNA成 几 何 级 数 扩 增 。应 用 ： 一 般 应 用 于 未 知 序 列 的 扩 增 ， 有 时 也 用 于 定 点 突 变 。 Inverse PCR原 理 示 意 图 （ 二 ） PCR的 种 类4.PCR-RFLP: 多 聚 酶 链 反 应 (PCR)-限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (restriction fragment length Polymorphism， RFLP) 原 理 ： PCR产 物 限 制 性 内 切 酶 切 多 态 性 分 析 ， DNA发 生 重 排后 ， 酶 切 位 点 发 生 改 变 。 优 点 ： 具 有 分 辩 率 高 ， 无 需

17、标 记 ,重 复 性 好 ， 简 便 快 速 直 观 等 。主 要 用 于 核 酸 变 异 性 分 析 与 比 较 , 微 生 物 的 分 群 分 型 分 亚 型 ， 癌基 因 分 析 ， 遗 传 病 的 诊 断 等 。 局 限 ： 只 能 应 用 突 变 引 起 限 制 性 酶 切 位 点 改 变 的 情 况 下 ， 一 次只 能 完 成 一 个 特 定 位 点 突 变 筛 选 ， 检 测 效 率 低 。 PCR-RFLP原 理 示 意 图 5.PCR-SSCP： 聚 合 酶 链 反 应 一 单 链 构 象 多 态 性 (single strand conformation polymorp

18、hism)原 理 ： 是 将 经 扩 增 的 DNA片 段 经 过 变 性 处 理 ， 形 成 单 链 ， 由 于 序 列不 同 ， 单 链 构 象 就 有 差 异 ， 在 中 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 电 泳 的 迁 移 率不 同 ， 通 过 与 标 准 物 的 对 比 ， 即 可 检 测 出 有 无 变 异 。特 点 ： 刚 建 立 时 是 将 同 位 素 掺 入 PCR扩 增 的 产 物 中 ， 通 过 放 射 自 显影 显 示 结 果 。 后 用 银 染 取 代 同 位 素 显 示 DNA带 型 ， 大 大 降 低 了 成 本 ，具 有 经 济 、 快 速 、 灵 敏 等 特

19、 点 。 1993年 起 用 EB染 色 法 显 示 DNA带 型 。优 点 ： 检 测 基 因 变 异 ， 具 有 操 作 简 便 、 快 速 、 不 需 特 殊 设 备 ， 适 用于 大 样 本 筛 选 。 己 广 泛 应 用 于 检 测 各 种 病 原 体 基 因 的 点 突 变 及 缺 失突 变 ， 基 因 的 多 态 性 分 析 等 。（ 一 ） PCR的 种 类 PCR-SSCP示 意 图 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR)可 对 特 定 核 苷 酸 片 断 进 行 指 数 级 的 扩增 。 在 扩 增 反 应 结 束 之 后 ， 我 们 可 以 通 过 凝 胶 电 泳 的 方

20、 法 对 扩 增产 物 进 行 定 性 的 分 析 ， 也 可 以 通 过 放 射 性 核 素 掺 入 标 记 后 的 光 密度 扫 描 来 进 行 定 量 的 分 析 。 无 论 定 性 还 是 定 量 分 析 ， 分 析 的 都 是 PCR 终 产 物 。 但 是 在 许 多 情 况 下 ， 我 们 所 感 兴 趣 的 是 未 经 PCR 信号 放 大 之 前 的 起 始 模 板 量 。 例 如 我 们 想 知 道 某 一 转 基 因 动 植 物 转基 因 的 拷 贝 数 或 者 某 一 特 定 基 因 在 特 定 组 织 中 的 表 达 量 。 在 这 种需 求 下 荧 光 定 量 PC

21、R技 术 应 运 而 生 。 logDNA Cycles logDNA Cycles 实 时 定 量 PCR技 术 ， 是 指 在 PCR反 应 体 系 中 加 入 荧 光 基 团 ， 利用 荧 光 信 号 积 累 实 时 监 测 整 个PCR进 程 ， 使 每 一 个 循 环 变 得“ 可 见 ” ， 最 后 通 过 Ct值 和 标准 曲 线 对 样 品 中 的 DNA (or cDNA) 的 起 始 浓 度 进 行 定 量 的方 法 。 实 时 荧 光 定 量 PCR是 目 前 确 定 样品 中 DNA(或 cDNA) 拷 贝 数 最 敏感 、 最 准 确 的 方 法 。 Real Tim

22、e PCR and Conventional PCRVS 535 353 5 3 5 3 535 5Taq Taq5 3RepeatDenaturationPrimer AnnealingElongation 常 规 PCR ProcessIn theory, product accumulation is proportional to 2 n, where n is the number of amplification cycle repeats Reality vs. TheoryAmplification is exponential, but the exponential inc

23、rease is limited:n A linear increase follows exponentialn Eventually plateaus TheoreticalReal LifeLog Target DNA Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification. 普 通 PCR和荧光定量PCR的 区 别常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确），无法进行实时检测；荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进

24、程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法（准确定量） 。 适 用 定 性 分 析 ，不 适 合 定 量 分析 ；PCR 产 物 的 长度 从 100bp 数 kb 实 时 检 测 :每 个 循环 都 产 出 荧 光 信 号 绝 对 定 量 ， 灵 敏 度更 高 PCR产 物 的 长 度 一般 在 60-150 bps 荧 光 定 量 PCR的 原 理基 本 原 理 ： 扩 增 呈 指 数 增 长 ， 在 反 应 体 系 和 条 件 完 全 一 致 的 情 况下 ， 样 本 DNA含 量 与 扩 增 产 物 的 对 数 成

25、正 比 。 由 于 反 应 体 系 中 的 荧光 染 料 或 荧 光 标 记 物 (荧 光 探 针 )与 扩 增 产 物 结 合 发 光 ， 其 荧 光 量 与 扩增 产 物 量 成 正 比 。 因 此 ， 通 过 荧 光 量 的 检 测 就 可 以 测 定 样 本 核 酸 量 。荧 光 化 合 物 分 为 两 类（ 1） 非 特 异 性 的 嵌 入 荧 光 染 料 ： 利 用 嵌 入 荧 光 染 料 检 测 ， 只 是 简 单地 反 映 PCR反 应 体 系 中 总 的 核 酸 量 ， 是 一 种 非 特 异 性 的 检 测 方 法 。（ 2） 特 异 性 荧 光 (引 物 )探 针 ： 增

26、 加 了 探 针 的 识 别 步 骤 ,特 异 性 、 专 一性 更 高 。 非 特 异 性 的 嵌 入 荧 光 染 料 （ Non-specific DNA binding dyes） SYBR Green I SYBR Gold Ethidium Bromide Cycle 1Cycle 3Cycle 2 Molecular Probe公 司的 一 个 专 利产 品 ，US Patent5,436,134 1993年 7月12日 申 请 简 便 可 以 使 用 已 有 的 引 物 普 遍 通 用 可 以 检 测 所 有 的 双 链 DNA， 包 括 引 物 二 聚 体 ； 需 要 化 大

27、力 气 优 化 反 应 条 件 ， 以 消 除 非 特 异 性扩 增 ； $1 / PCR 反 应 Extension5 353 5 3 53 Extension ContinuedApply ExcitationWavelength5 353 5 5Taq Taq 353 Taq Taq5 5Repeat DNA binding dyesBD BD BD BDBD BD BD BDBD BDl l ll l 特 异 性 的 荧 光 探 针 特 异 性 的 荧 光 探 针 是 把 荧 光 化 合 物 标 记 到 特 异 性 的 寡核 苷 酸 上 形 成 荧 光 标 记 的 DNA探 针 。 通

28、 过 探 针 与 PCR产物 特 异 性 的 结 合 ,在 PCR过 程 中 可 对 产 物 实 现 均 相 、 实时 、 定 量 检 测 ,也 适 用 于 多 通 道 检 测 。 TaqMan探 针 ABI 公 司 首 先 推 出 (PRISM 7000系 列 ) US Patent 5,723,591, 1995年 11月 申 请 。 实 时 检 测 : 每 个 循 环 都 会 产 生 与 PCR产物 成 正 比 的 荧 光 物 质 TaqMan探 针 是 一 段 5端 标 记 报 告 荧 光 基 团 (R),3端 标 记 淬 灭 荧 光 基 团(Q)的 寡 核 苷 酸 ,其 序 列 与

29、模 板 DNA中 的 一 段 完 全 互 补 。 当 探 针 单 独 存 在 时 ,由 于 荧 光 共 振 能 量 转 移 的 发 生 ,R的 荧 光 受 到 Q的 猝灭 。 在 PCR过 程 中 ,由 于 TaqDNA酶 的 5-3外 切 酶 活 性 的 作 用 ,使 探 针的 5端 的 R被 切 断 ,加 大 了 与 Q的 距 离 而 使 荧 光 恢 复 。 一 分 子 的 产 物 生 成 就 伴 随 着 一 分 子 的 荧 光 信 号 的 产 生 。 随 着 扩 增 循 环数 的 增 加 ,释 放 出 来 的 荧 光 基 团 不 断 积 累 。 因 此 ,Taqman探 针 检 测 的是

30、 积 累 荧 光 。 Cleavage-based assay:TaqManTM5 533 d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers 5 353 5 35 3 5 353 5353 Add Master Mix and SampleDenaturation 5 353 5 35 3 5353 Annealing Reaction TubeTaq l5 3R QProbe 5 3R Q 5 35353 RQ Extension Step5 3 1. Strand DisplacementTaq3Q R 5 5 33Q TaqR 5 2. Cleavag

31、e3. PolymerizationComplete5 3QTaq R3 5 4. Detection 5 33 QTaq R 5l RCleavage-based assay:TaqManTM Cycle 一 般 而 言 ， 荧 光 扩 增 曲 线 扩 增 曲 线 可 以 分 成 三 个 阶 段 ： 荧 光 背 景 信 号 阶 段 , 荧 光 信 号指 数 扩 增 阶 段 和 平 台 期 。 在 荧 光 背 景 信 号 阶 段 ， 扩 增 的 荧 光 信 号 被 荧 光 背 景 信 号 所 掩 盖 ，我 们 无 法 判 断 产 物 量 的 变 化 。 而 在 平 台 期 ， 扩 增 产 物

32、已 不 再 呈 指 数 级 的 增 加 。 PCR 的 终产 物 量 与 起 始 模 板 量 之 间 没 有 线 性 关 系 ， 所 以 根 据 最 终 的 PCR 产 物 量 不 能 计 算 出 起 始 DNA 拷 贝 数 。 只 有 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 ， PCR 产 物 量 的 对 数 值 与 起 始 模 板 量 之 间 存在 线 性 关 系 ， 我 们 可 以 选 择 在 这 个 阶 段 进 行 定 量 分 析 。 为 了 定 量 和 比 较 的 方 便 ， 在 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 引 入 了 两 个 非 常 重 要 的 概 念 ：荧 光

33、 阈 值 和 CT 值 。 荧 光 阈 值 是 在 荧 光 扩 增 曲 线 上 人 为 设 定 的 一 个 值 ， 它 可 以 设 定 在 荧 光信 号 指 数 扩 增 阶 段 任 意 位 置 上 ， 但 一 般 我 们 将 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3-15 个 循 环 的 荧 光信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 。 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 被称 为 C T 值 。 Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory PCR扩 增 过 程 中 ，扩

34、增 产 物 荧 光 信 号 超过 基 线 值 （ 进 入 指 数增 长 期 ） 时 的 循 环 数 。 principle of quantitative real-time PCR use when rather than how much fluorescent signal PCR cycles Low (high copy no.) High CT(low copy no.)real-time PCR amplification plots (7 x 10-fold dilns. + NTC) End point(not quantitative)threshold ofdetecti

35、onCT Correlates strongly with the starting copy number Is linear with the log of starting copy number 10ng 0.001ngTitrate a template; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值 与 模 板 起 始 浓 度 的 关 系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达 杂 合 子野 生 性 纯 合 子 突 变 纯 合 子 不 能 在

36、 同 一 管 中 进 行 多 片 断 扩 增 不 同 的 基 因 必 须 在 不 同 的 试 管 中 管 之 间 的 精 确 度 跟 多 荧 光 系 统 同 等 的 精 确 和 可 靠 灵 敏 度 高 ， 定 量 方 便 费 用 高 1996 1997 1998 1999 2000 基 因 、 DNA片 段 的 克 隆 人 工 基 因 构 建 DNA序 列 测 定 基 因 定 点 突 变 基 因 型 （ 突 变 ） 检 测 ， SNP分 析 ， 遗 传 背 景 分 析 生 物 物 种 鉴 定 ， 系 统 进 化 研 究 基 因 表 达 量 研 究 （ real-time PCR） / 基 因 表 达 谱 研 究 （ DNA chip, SAGE） 疾 病 基 因 检 测 / 遗 传 病 的 产 前 诊 断 致 病 病 原 体 的 检 测 肿 瘤 治 疗 中 癌 基 因 的 检 测 DNA指 纹 、 个 体 识 别 、 亲 子 关 系 鉴 别 、法 医 物 证