蛋白质的一级结构

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1、1. 蛋白质的一级结构（共价结构） 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。2. 蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）I是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构（I超二级结构I结构域1三级结构（球状结构）I四级结构（多亚基聚集体）3. 一级结构的要点4. 蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）测定多肽链的氨基酸组成。（4）断裂链内二硫键。（5）分析多肽链的N末端和C末端。（6）多肽链部分裂解成肽段。（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。（9）确定多肽链中二硫键的位置。5. 蛋白质

2、测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。6. 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法NCA法裂解A1A2A3A4B法裂解B1B2B3B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽 段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。7. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测 600-800bp8. 测序前的准备工作9. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）要求一条带DNScl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸10. 测定分

3、子量用于估算氨基酸残基n=mw110方法：凝胶过滤法、沉降系数法11. 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式： 非共价键结合8mol/L尿素，SDSSDS-PAGE测分子量二硫键结合过甲酸氧化：SS+HCOOOH SOH3B巯基乙醇还原：举例：血红蛋白（a B 2）（注意，人的血红蛋白a和B的N端相同。） 分子量： M拆亚基： M 、M两条带拆二硫键： M1 、M2两条带分子量关系： M = 2M + 2M12. 测定氨基酸组成 主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 Trp测定对二甲基氨基苯甲醛 590n

4、m。 Cys测定5、5/二硫代双（一2硝基苯甲酸）DTNB , 412nm13. 端基分析 N端分析取。DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯） 抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。 C端分析A. 肼解法H N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NH NH 100C 5T0h。.2 2 2-A-NHNH 、 B-NHNH 、 C-NHNH 、 D-COOH222氨基酸的酰肼，用苯甲醛

5、沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。B. 羧肽酶法（Pro不能测）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysN HN ValSerGlyC图P118羧肽酶法测C末端14. 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化15. 化学裂解法 溴化氰一MetX 产率85% 亚碘酰基苯甲酸一TrpX 产率70-100% NTCB （2-硝基-5-硫氰苯甲酸）一XCys 羟胺 NHOHAsnGly约150个氨基酸出现一次16. 酶法裂解胰蛋白酶（X 工 Pro）Arg X 胰凝乳蛋白酶Tyr一X（X 工 Pro）|TrpXIPheX胃蛋白酶Phe（Trp

6、、 Try、 Leu）Phe（Trp、 Try、 Leu）GluXArgProX Glu蛋白酶（V蛋白酶）8 Arg蛋白酶 Lys蛋白酶 Pro蛋白酶17. 肽段的分离纯化 电泳法SDS-PAGE根据分子量大小分离 离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）根据肽段的电荷特性分离 反相HPLC法根据肽段的极性分离 凝胶过滤18. 肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用DNSc l法 要求：SDS PAGE单带、HPLC单峰、N端单一。19. 肽段的序列测定及肽链的拼接20. Edman 法 一次水解一个N端a.a( 1 )耦联A-B-C-DHNB-C

7、-D2PITC + H NA-B-C-DpH89 , 40CPTC2 ( 2 )裂解PTCA-B-C-DTFA无水三氟乙酸ATgA +( 3 )转化ATZAk PTHA用GC或HPLC测定PTH-A PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）耦联：得PTC肽一次循环裂解：ATZ- a.a 转化：PTH-a.a120反应产率99循环次数（偶联、降98%60解两步）90%4021. DNS-Edman 法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。ABCDE肽22. 有色 Edman 法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。23. 用自动序

8、列分析仪测序仪器原理：Edman法，可测60肽。1967 液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。1971 固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的C端。1981 气相测序仪用 Polybrene 反应器。(聚阳离子)四级铵盐聚合物液相： 5nmol20-40 肽97%气相： 5pmol60 肽98%24.肽段拼接成肽链16肽，N端HC端SA法裂解：ONSPS EOVERLA HOWTB法裂解：SEOWTON VERLAPS HO重叠法确定序列： HOWTONSEOVER LAPS25. 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定26. 二硫键的确定(双向电泳法)碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解蛋白

9、质第一向电泳过甲酸氧化一SS生成-SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。27. 酰胺的确定Asp - Asn、Glu-Gln酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn举例： Leu-Glx-Pro-Val 肽在 pH=6.0 时，电荷量是 Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。28. 糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷-0-糖苷脂类： Ser、 Thr、 Cys磷酸： Ser、 Thr、 His经验性序列： Lys(Arg)

10、-Ser-Asn-Ser(PO)4Arg-Thr-Leu-Ser(PO )4Lys(Arg) - Ala-Ser&O)29. 蛋白质的一级结构与生物功能30. 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能 蛋白质一级结构举例：（1）牛胰岛素 Sanger 于 1953年首次完成测序工作。P128 图 3-38 分子量：5700 dalton51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，A 链内有一个二硫键 Cys 6Cys 11A.B 链间有二个二硫键A.Cys 7 B Cys 7A.Cys 20B Cys 19（2）核糖核酸酶（RNase）P128图 3-39分子量：12600a.a 残基124

11、个4 个链内二硫键。牛胰RNase变性一复性实验：P164图 3-69。（8M尿素+B硫基乙醇）变性、失活一透析，透析后构象恢复,活性恢复 95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。（3）人血红蛋白a和B链及肌红蛋白的一级结构P129 图 3-4031. 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动 物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。同源蛋白质的特点： 多肽链长度相同或相近 同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的,称不变 残基，不变残基高度保守，是必需的。

12、 除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残 基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源 关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。32. 细胞色素C存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。P130，图 3-41分子量：12500左右 氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。 60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。 亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。 亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩0人与猴1人与狗10人与酵母4

13、433. 胰岛素祥见 P175 胰岛素的结构与功能不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，AB 链上 6 个 Cys 不变（重要性），其余 18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对 稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近， 而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。34. 蛋白质一级结构的个体差异分子病分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导 致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。Linus Pauling 首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于

14、血红蛋白发生了遗传突变引起的， 成人的血红蛋白是由两条相同的a链和两条相同的卩链组成込卩2,镰刀形红细胞中，血红蛋白 卩链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此:当血红蛋白没有携带0?时就 由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用（血细胞 溶解）导致病血，棍棒形的血红蛋白对02的结合力比正常的低。以血红蛋白为例：a 2B 2寡聚蛋白2正常人血红蛋白，B .N.2Glu 6镰刀型贫血B .NVal 6生理条件下电荷：Va10Glu-疏水亲水人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Val分 子，就能发生镰刀状细胞贫

15、血病。352一级结构的部分切除与蛋白质的激活一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽 后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激 素前体等。362血液凝固的机理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶凝血酶原纤维蛋白原AJ 纤维蛋白B凝胶（1）、 凝血酶原P133 图 3-43 凝血酶原的结构糖蛋白，分子量66000, 582个a.a残基，单链。 在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的 Arg274Thr275 和 Arg323Ile324 断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。y A 链 49 a.aL B 链 2

16、59 a.a（2）、 纤维蛋白原P133 图 3-44 纤维蛋白原的结构a 2 2r2a肽：600个氨基酸，B肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸在凝血酶作用下，从二条a链和二条B链的N端各断裂一个特定的肽键-ArgGly-,释 放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨 基酸残基。P133 纤维肽A .B的结构A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。P134 上在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys 结合），生成交联的纤维蛋白。37. 胰岛素原的激活P134 图 3

17、-45胰岛素在胰岛的B细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原 在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运 至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除c肽，得到活性胰岛素。38. 多肽与蛋白质的人工合成在医药和研究方面意义重大1958年，北大生物系合成催产素8肽。 1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。1969 年，美国 Merrifield 用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶牛胰 RNase124aa）。P139 图 3-46 多肽的固相合成C端 N端。挂接f去保护f中和f缩合f去保护f中和f缩合 一39

18、. 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。40. 肽链的构象多肽链的共价主链上所有的a 碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多 肽主链能有无限多种构象。但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳 定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的 单键并不能自由旋转。41. 肽链的二面角P143 图 3-51、图 3-52多肽主链上只有a碳原子连接的两个键（Ca N和Ca -C）是单键，能自由旋转。环绕Ca N键旋转的角度为012环绕Ca C键旋转的角度称屮多肽链的所有可能构象都能用0和屮这两

19、个构象角来描述，称二面角。当0的旋转键Ca -Ni两侧的Ni-Ci和Ca -C2呈顺式时，规定0 =。当屮的旋转键Ca -C两侧的Ca -N和C?-%呈顺式时，规定屮=0。从Ca向N1看，顺时针旋转Ca -N1键形成的 0角为正值，反之为负值。从Ca向C；看，顺时针旋转Ca - C2键形成的屮角为正值，反之为负值。42. 多肽链折叠的空间限制0和屮同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0 原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。因此二面角（0、屮）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原 子间的接近有无阻碍。Ca 上的 R 基的大小与带电性影响

20、0 和 屮P144表3T2蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些 成对二面角（0、屮）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以 0 为横坐标，以 屮 为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。P145拉氏构象图（Gly除外）实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象 都是允许的，且构象稳定。虚线封闭区域 是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学 允许，但构象不够稳定。虚线外区域 是不允许区，该区域内任何二

21、面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原 子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。Gly的、屮角允许范围很大。总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的 7.7%，最大允许区占全平面 20.3。43. 二级结构的基本类型驱使蛋白质折叠的主要动力：(1) 暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。(2) 要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状 态。44. a螺旋(3) 、a螺旋及其特征在a螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈 之间形成链内氢键，构成

22、螺旋的每个Ca都取相同的二面角、屮。典型的a螺旋有如下特征： 二面角：0 = -57 ,屮二-48，是一种右手螺旋回忆P143图3-52 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm 每个残基绕轴旋转100，沿轴上升 0.15nm 氨基酸残基侧链向外 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。 肽键上N-H氢与它后面(N端)第四个残基上的C=0氧间形成氢键。图这种典型的a螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭 的环包括 13 个原子。2.2 螺旋(n=1)73o 螺旋(n=2, 0 = -49 ,屮=26)613螺旋（n=3）4.3 螺旋（

23、n=4）16封闭环原子数 3n+4（n=1、 2、 ）2.233.64.37101316n=1n=2n=3n=4a -螺旋n -螺旋(4) 、R侧链对a螺旋的影响R侧链的大小和带电性决定了能否形成a 螺旋以及形成的a 螺旋的稳定性。 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基，(如Lys，或Asp，或Glu)，则由 于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的A 螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。 而当这些残基分散存在时，不影响A 螺旋稳定。 Gly的0角和屮角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成A 螺旋所需的二 面角的机率很小，不易形成a 螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成a 螺旋。

24、R基大(如Ile)不易形成a 螺旋 Pro、脯氨酸中止a 螺旋。 R基较小，且不带电荷的氨基酸利于a 螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶 液中自发卷曲成a 螺旋。(5) 、pH对a螺旋的影响多聚L-Glu和多聚L-LysP149 图 3-57(6) 、右手a -螺旋与左手a -螺旋图 P148右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的a 螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手a 螺旋, 由 Asp-Asn-Gly-Gly (226-229)组成(Q +64、屮 +42)。( 7)、a -螺旋结构的旋光性由于a -螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：(1) a碳原子的

25、 不对称性，(2) 构象本身的不对称性。天然a 螺旋能引起偏振光右旋，利用a 螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中a 螺旋的相对含量，也可用于研究影响a 螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。a -螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于 所有氨基酸比旋的加和。( 8)、a -螺旋(包括其它二级结构)形成中的协同性一旦形成一圈a -螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。45. B -折叠P149 图 358P150 图 359两条或多条几乎完全伸展的多肽链(或同一肽链的不同肽段)侧向聚集在一起，相邻肽 链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构

26、象就是B -折叠片。B -折叠中所有的肽 链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链 R 基交替地分布在片层平面的两侧。平行式：所有参与B -折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同平行式：Q =T19屮=+113反平行式：Q =-139屮=+135从能量上看，反平B -折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH-O几乎在一条直线上，此 时氢键最强。在纤维状蛋白质中B -折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式 都存在。在纤维状蛋白质的B -折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，B - 折叠既可在不同肽链

27、间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。46. B -转角（B -turn）B -转角也称 B -回折（reverse turn）、p -弯曲（B -bend）、发夹结构（hair-pin structure）p -转角是球状蛋白质分子中出现的 180回折，有人称之为发夹结构，由第一个 a.a 残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。目前发现的P转角多数在球状蛋白质分子表面，P转角在球状蛋白质中含量十分丰富， 占全部残基的 1/4。p 转角的特征： 由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。 主链骨架以 180返回折叠。 第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键 C a与

28、C a之间距离小于0.7nm14 多数由亲水氨基酸残基组成。47. 无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。 球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。a -螺旋，p -转角，p -折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的（p、屮二面角可存 在于所有允许区域内。48. 超二级结构由若干个相邻的二级结构单元（a -螺旋、p -折叠、p -转角及无规卷曲）组合在一起, 彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。49. a a结构（复绕a -螺旋）由两股或三股右手a -螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。p153 图 3-61 A存在于a -角蛋白，肌球蛋白

29、，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。50. B xB结构两段平行式的B -链（或单股的B -折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二 级结构。 B cBx 为无规卷曲p153 图 3-61 B B a BX为a -螺旋，最常见的是B a B a B，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢 酶，乳酸脱氢酶中。p153 图 3-61 C51. B 曲折（B -meander）由三条（以上）相邻的反平行式的B -折叠链通过紧凑的B -转角连接而形成的超二级结 构。P153 图 3-61 D52. 回形拓扑结构（希腊钥匙）P153 图 3-61 E53. B -折叠桶由多条B -折叠股构成的B -折叠

30、层，卷成一个筒状结构，筒上B折叠可以是平行的或反 平行的，一般由5-15条B -折叠股组成。超氧化物歧化酶的B -折叠筒由8条B -折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。54. a -螺旋-B转角-a -螺旋两个a -螺旋通过一个B转角连接在一起。入噬菌体的入阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为 重要的地位。55. 纤维状蛋白质纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果 整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大 于 10，轴比小于 10是的球状蛋白质。广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动

31、物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和 保护作用。56. 角蛋白源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为a -角蛋白和B角蛋白。（9）、 a -角蛋白P155 图 3-63，P156 图 3-64主要由a -螺旋结构组成，三股右手a -螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2” 的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微结构稳定性由二硫键保证，a -角蛋白在湿热条件下可伸展转变成B -构象，烫发的化学 机理 Cys 含量较高。？ a-角蛋白6-Keratin）中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一 个II型多肽链形成一个卷曲螺

32、旋二聚体（Coiled coil dimmer）。一对卷曲螺旋反平行式地 形成左手超螺旋结构称原纤维（Protofilament, 4股右手a-螺旋），原纤维的亚基间以氢键 和二硫键相连。 4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将 纤维（fiber ）含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？（io）、B -角蛋白P157 图 3-65含大量的Gly、Ala、Ser，以B -折叠结构为主。丝心蛋白取片层结构，即反平行式B -折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要 以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。57. 胶原蛋白58. 弹性蛋白59.

33、 肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白6o.球状蛋白质的高级结构与功能前面讲了蛋白质结构的两个较低级的组织水平：一级结构和二级结构（包括超二级结 构），本节讲述蛋白质（主要是球蛋白）的高级结构：结构域、三级结构、四级结构，及其 与生物功能。6i.蛋白质的一级结构决定高级结构蛋白质功能的复杂性和多样性是建立在结构多样性的基础上。多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当 的顺序时，能自发形成a -螺旋和B -折叠，并处于稳定状态。而多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、 Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。同源

34、蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我 装配”。P164图3-69 RNase的变性与复性示意图62. 球状蛋白质的结构域、三级结构与功能63. 结构域结构域（domain），又称motif （模块）在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近 似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔 合。对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，就是说这些蛋 白质是单结构域的。结构域一般有1 0 0 2 0 0氨基酸残基，结构域之间常常

35、有一段柔性的肽段相连，形 成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。每个结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。 例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+吉合结构域，一个是起催化作用的结 构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结构域间的裂缝，常是活性部位，也是反应物的出入口。一般情况下，酶的活性部位位 于两个结构域的裂缝中。EF 手：钙结合蛋白中，含有 Helix-Loop-Lelix 结构锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，图 5.1964. 三级结构：三级结构：

36、整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的 特定的整个空间结构。或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。65. 三级结构有以下特点： 许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得 极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。 大的球形蛋白（200aa以上），常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体， 典型情况下常常含有特定的功能（如结合离子和小分子）66. 维持三级结构的作用力：P164 图 3-70（1）氢键大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键

37、（如a -螺 旋、B -折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。（2）范德华力（分子间及基团间作用力）包括三种弱的作用力：定向效应 极性基团间诱导效应 极性与非极性基团间分散效应 非极性基团间（3）疏水相互作用蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它在维持蛋白质的三级结 构方面占有突出的地位。（4）离子键（盐键）是正电贺和负电荷之间的一种静电作用。生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Lys、Arg、His离解成正离子。多数情况下, 这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相 反电荷的测链在分子的疏水内部

38、形成盐键。（5）共价健，主要的是二硫键， 在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结 构形成后，二硫键可稳定此构象。主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。 6、静电相互作用 最强的静电作用就是带相反电何的离子基因间的静电作用，又称盐桥。盐桥和较弱的静 电相互作用（离子-偶级、偶级-偶级、范德华力）也是维持亚基间以及蛋白质与配体间的作用 力。球状蛋白蛋在行使功能时，通常与小的配体或大分子（如核酸，其它蛋白质）精密结合。 球状蛋白的表面通常有一个凹穴其结构与配体互补，当配体结合上去后，引起球状蛋白的构 象变化，触发后续反应。67

39、. 肌红蛋白的三级结构与功能：68. 肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，由一条多肽链和一个血红素辅基组成，分子 量16.7Kd，含153个氨基酸。P172图376图5.27肌红蛋白的02结合部位多肽主链由8段直的a -螺旋组成，最长的a -螺旋有23个氨基酸残基，最短的a -螺旋 有7个氨基酸残基。分子中几乎80%的氨基酸残基处在a -螺旋区内。连接两个相邻a -螺旋 的是 松散肽段，由18个氨基酸组成。8段螺旋分别命名为A、B、CH。相邻的非螺旋区肽段为NA、AB、BCGH、HC。4个Pro残基各自处在一个拐弯处，Ser、Thr、Asn、Ile也处在拐弯处。肌红蛋白多

40、肽链绕曲成球状分子，球体内充满非极性氨基酸残基：Val、Leu、Met、Phe 等，亲水的基团几乎全部分布在球状分子的外表面。整个分子单结构域。辅基：血红素（铁卟啉），扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。P173卟啉环中心的Fe2+有六个配位键，其中4个与平面卟啉分子的N结合，另外两个与卟啉 平面垂直，1个与93位His（F8）的咪唑N结合，另一个处于开放状态，可结合02。蛋白质为血红素提供一个疏水环境，避免Fe2+被氧化而失去氧合能力。CO与血红素结合能力比02的大200倍，CO中毒原理69. 肌红蛋白的氧合曲线肌红蛋白：Mb氧合肌红蛋白：MbO。2解离平衡常数：”Mb o丄K =2 M

41、bO 2 氧浓度与氧分压成正比“Mb POK =2- MbO MbO MbO + Mb 2PO2 K + PO22给定氧压下肌红蛋白氧饱和度Y（4）式代入（3）式，K= (1-Y) PO.2Y以肌红蛋白的氧饱和度Y和氧分压PO2作图。P174 图 3-77 氧合曲线当Y=1时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白被氧饱和K=0Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K，解离常数K称为P50，即肌红蛋白一半被饱 和时的氧压。70. Hill曲线和Hill系数YPOLog Y = Log PO Log K2 21-Y K1-YP174 图 3-78Hill 曲线71. 蛋白质四级结构与功

42、能 形成四级结构的亚基间必需构象互补和电荷（或极性）互补。72. 蛋白质的四级结构 具有三级结构的亚单位，通过离子键、范德华力、氢键等聚集而成的特定构象寡聚蛋白由几条肽链组成。每一条肽键称为一个亚基（或单体）。亚基间的互补界面的 是疏水性的。 有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分 称为原体。如血红蛋白a 2B 2就是由两个原体a B组成。维持四级结构的作用有：氢键、疏水作用、静电作用、共价健共价键也维持四级结构：免疫球蛋白的二硫键；弹性蛋白中的锁链素（由4个Lys 侧链形成的交联体desmosine）；Lysinonorleucine赖氨硫正亮氨酸），见

43、于弹性蛋白和 胶原蛋白。球状蛋白聚集成四级结构具有下列优势 结构更复杂，以便行使更复杂的功能。 通过协同作用，实现对酶活性的调节。 把中间代谢途径中各种酶分子聚体在一起，提高催化效率。 形成一定的几何形状，细菌鞭毛。 适当降低溶液渗透压。73. 寡聚蛋白与别构效应别构蛋白：多是寡聚蛋白，每个亚基除了有活性部位（结合抵牾）外，还有别构部位（结 合调节物），有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之 间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位 的影响。同位效应（同种效应）：别构

44、蛋白与一种配基的的结合对于和后续同种配基结合能力的 影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应，也可能 指别构部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的 一种修饰异位效应（异种效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。 协同效应：一种配基的结合促进后续配基的结合， S 型结合曲线。 负协同效应：一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。 负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。74. 血红蛋白的结构与功能75. 血红蛋白的结构：成人：HbAHbA2胎儿 HbF早期胚胎

45、：a ： 141a.a，a B 98%22a 62%22a y22a 22B、Y、6 : 146a.aa、B间大量的盐键，2.3二磷酸甘油酸。血红蛋白分子接近于球体， 4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红 素辅基。血红蛋白的a、B链的三级结构与肌红蛋白的很相似，但这三种多肽链的氨基酸顺序有 较大不同，141个氨基酸残基中有20多个相同，似乎不同的a.a顺序也能形成非常相似的高级结构。P129图3-40血红蛋白a、B链的氨基酸序列 P181图3-86 p亚基的三级结构76. 血红蛋白的氧合曲线(与肌红蛋白比较)血红蛋白由4个亚基组成，每个亚基都与肌红蛋白类似，含有一个血红素，都能

46、结合一分子。2，四个亚基之间具有协同效应，第一个配基的结合能提高其它亚基对。2的亲和力。 因此，它的氧合曲线是S型曲线P185 图 393、 393协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气，。PO n2血红蛋白 P =26 torr, n=2.8， Y= K+ PO n502肺泡氧压：Po? =100 torr肌肉毛细血管：Po? =20 torr在肺泡中： Y=0.97在毛细血管中 Y=0.25释放氧Y=0.970.25=0.72若无协同效应，血红蛋白的氧合曲线与肌红蛋白的相同，当卩。2从10020 torr时, Y 不足 0.1。77. 波耳效应及其生理意义血红蛋白上有

47、CO和DPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO o波耳效应：增加CO的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血 红蛋白对。2的亲和力，促进。2的释放，反之，高浓度的02也能促使血红蛋白释放H+和CO oP187 图3-95 pH对血红蛋白氧合的影响78. DPG 的别构效应血红蛋白是一个别构蛋白，DPG是它的效应物。DPG (二磷酸甘油酸)通过与它的两个 P亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。P189图3-96 DPG对血红蛋白氧合曲线的影响无 DPG 时， P =1 torr， DPG=4.5mM 时， P =26 torr5050DP

48、G进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，Po2超过100torr,因此，即使没有DPG， 血红蛋白也能被饱和，在组织中，P 低, DPG能降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的O2卸氧量。(1) 高山适应和肺气肿的生理补偿变化；DPG升高。(2) 血库储血时加入肌苷可防止DPG的降解。协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率79. 免疫球蛋白的结构与功能免疫球蛋白是糖蛋白，它是脊椎动物体内合成的抗体。80. 抗原与抗体抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的 物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。

49、 免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。 抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这 种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。抗原决定簇的作用： 被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。 与相应抗体的Fab结合。抗体是在对抗原刺激的免疫应答中， B 淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原 特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。抗体具有两个特点： 高度特异性 多样性 几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。81. 抗原抗体反应抗体是 2 价的，抗原是多价的。

50、抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。 抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗体复合物，不可溶。 抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。图抗原抗体反应的条件： 抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。 二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键 等）82. 免疫球蛋白的一级结构P193 图 3-9983. 蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定84. 蛋白质的酸碱性质 蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。P197 表 3-16天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基

51、因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。85. 等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO2+）4等电点：P198 表 3-17 3-18 蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质 子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。86. 蛋白质的电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGESDS-PAGE （荷质比相同，分子量不同）87. 离子交换层析分离蛋白质 与氨基酸分离原理相似88. 蛋白质的大小与形状测分子量的方法

52、：化学组成法凝胶过滤法SDS-PAGE 法89. 胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在l-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出 来，大分子蛋白质仍留在袋中。蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越 多，溶解度越大。90. 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉 淀。 两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，

53、便从溶液中析出沉淀。91. 沉淀蛋白质的方法 盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(NH) SO、Na SO、Nacl，使蛋白质4 2 4 2 4 脱去水化层而聚集沉淀。 有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数 重金属盐沉淀pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子(Hg2+. Pb2+. Cu2+等)结成不溶 性沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 加热变性沉淀。往往是不可逆的。92. 蛋白质的变性变性作用：理、化因

54、素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其 它理化常数改变。(1) 变性的因素：强酸和强碱；有机溶剂，破坏疏水作用；去污剂、去污剂都是两亲分子，破 坏疏水作用；还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；盐浓度、盐析、盐溶；重金属离 子, Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。温度；机械力：如搅拌和研磨中的气泡。(2) 变性的实质：次级键(有时包括二硫键)被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。( 3)蛋白质变性后，往往出现下列现象： 结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。 硫水侧链基团外露。 理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。 生理化学性质改变。分子结

55、构伸展松散，易被蛋白酶水解。实际应用：A. 消毒灭菌： 75%乙醇，紫外线，高温。B. 制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。( 4)变性机理 热变性(往往是不可逆的)多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。 酸碱变性：破坏了盐链。 有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。(5)可逆变性与不可逆变性有人认为：二级、三级或四级结构遭受被破坏即为变性，三级(或四级)结构被破坏时 引起可逆变性，而二级及三级(或四级)结构一并遭破坏时引起不可逆变性。93. 分离纯化蛋白质的主要方法实质：蛋白与非蛋白分开，蛋白质之间分开原理：1. 溶解度差异PEG 沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法2. 热稳定性差异

56、热处理沉淀法铜锌SOD (65C、15分钟、稳定)3. 电荷性质差异 离子交换层析法 电泳法4. 分子大小和形状差异 凝胶过滤、超滤法 透析法、离心法5. 亲和力的差异亲和层析法 某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、 调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。分离原理：P224 图 3-124蛋白质毒素一些致病生物产生的毒素中有很多是蛋白质。毒性机理有：破坏细胞膜；干扰细 胞内机能；抑制神经细胞突触的功能。直接作用于细胞膜的毒素称溶细胞毒素，可以由细菌、真菌、植物、鱼、蛇等产生。链 球菌属(Str ep

57、 to ccus)Pyogene产生的链球菌溶血素(包括0.5等)，能使精细胞产生孔洞， Na+等离子外渗，细胞死亡。链球菌溶血素O是产生风湿热的原因之一(rheiematie fever)。 此外，一些有毒的酶点，如蛇的磷酯酶在A2也能破坏细胞膜。破坏细胞内机能的毒素也很多，如白候杆菌(Corynebac teriadiph theriae)产生的白候 毒素(diph theria toxin)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae )产生的霍乱毒素(cholera toxin)。 它们均由A、B两个亚基组成，B亚基与靶细胞结合，A亚基致毒。白候毒素分子一旦进入靶 细胞，AB亚在就分开，

58、A亚基是一种酶能阻止蛋白质的合成，寄主的心、肾和神经组织都会 被破坏。霍乱毒素的B亚基由5个相同亚基组成，B亚基与肠细胞膜结合，A亚基就被送入这些 细胞中，A亚基激活一种酶使cAMP大量产生，cAMP打开细胞膜的CL通道，由于CL-外泄引 起渗适压的改变，水分也大量丧失，结果导致腹泻(diarrhoea)，不加治疗的话，严重的脱 水可使病人48小时内死亡。神经突触连接两个神经元或一个神经元与一个肌肉细胞。一种毒蜕的产生的毒素-La trot oxin(125KD)是一条多肽链，能剌激神经递质乙酰胆碱(ace tylcholine, ACH)的广 谱性释放酶。肉毒杆菌(Los trldium bot ulinum)产生的肉毒杆菌毒素(bo tulinum toxin)能 抑制Ach释放酶肉毒中毒(botulism)为是由于受了被污染的罐袋食物引起的。