超临界流体萃取技术在中草药及天然产物提取中的应用

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1、超临界流体萃取技术在中草药及天然产物提取中的应用【摘要】 在过去的十几年，超临界流体萃取技术从天然产物和中草药中差不 多成功地萃取和分离了多种活性成分，本文要紧针对超临界流体萃取技术在实际 应用方面的几个问题进行综述，包括提携剂的选取、样品的制备、萃取温度和压 力的阻碍、萃取物的采集方法等几个方面。【关键词】 超临界流体萃取；中草药；天然产物；综述【Abstract】 In the past decade， supercritical fluid extraction(SFE) technology has been successfully applied to the extraction

2、 and separation of a variety of active compounds from herbs and natural plants. This paper reviewed a few aspects of SFE application in selection of modifiers ， sample preparation ， effects of pressure and temperature， collection methods.【Key words】 supercritical fluid extraction； herbal； natural pr

3、oduct；review中草药及天然产物中有效成分的提取， 直截了当关系到产品有效成分的含 量，阻碍其内在质量、临床疗效、经济效益及GMP的实施1。传统提取中草 药有效成分的方法有水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法、溶剂萃取法等，这些方法通常 是工艺复杂、耗时、产品纯度不高、对环境污染大，而且易残留有害物质。因此 科研工作者们一直在试图查找提取效率高、选择性好、污染小的方法，随着现代 科学技术的不断进展，涌现出了许多新的分离提取方法，加快了提取过程，提高 了提取效率。超临界流体萃取技术确实是其中之一，较传统提取方法而言，该方 法具有简便、快速、提取率高、无污染等特点。早在1879年，Hannay等2就发

4、觉超临界乙醇流体对无机盐固体具有显 著的溶解能力，但超临界流体萃取(supercritical gluid extraction， SFE)却是在近 30 年来才迅速进展起来的一种新型物质分离、精制技术3， 4。所谓超临界流 体(supercritical fluid， SCF)是指物质处于临界温度和临界压力时，成为单一 相态，即超临界流体，在超临界状态下，流体的性质介于气体和液体之间，既具 有与气体接近的粘度及高的扩散系数，又具有与液体相近的密度。在超临界点邻 近压力和温度的微小变化都能够引起流体密度专门大的变化，并相应地表现为溶 解度的变化， 因此能够利用温度和压力的变化来实现萃取和分离的

5、过程。超临 界流体萃取技术具有萃取速度快、提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低、 过程无有机溶剂残留等优点5。目前超临界流体研究范畴涉及食品、香料、医 药、化工、环保等领域614,并取得了一系列的研究进展。本文就超临界流 体萃取技术在中草药及天然产物中有效成分的分离提取中实际操作方面的几个 问题进行综述，包括样品的制备、提携剂的选择、萃取温度和压力的阻碍、萃取 产物的采集方法等。1 超临界流体萃取技术的要紧特点14241.1 超临界流体的特点 超临界流体既具有液体对溶质有比较大溶解度的 特点，又具有气体易于扩散和运动的特性，传质速率大大高于液相过程 （超临界 流体的扩散系数为10-4cm2/

6、s,液体的扩散系数为10-5 cm2/s）。也确实是说超 临界流体兼具气体和液体的性质，即具有较低的粘度和较高的扩散力。因此超临 界流体萃取率高,萃取速度快。1.2 萃取和分离合二为一 当饱含溶解物的超临界流体流经分离器时,由 于压力下降使得流体与萃取物迅速成为两相（气液分离）而赶忙分开,不存在物 料的相变过程,无需回收溶剂,操作方便；不仅萃取效率高,而且能耗较少,节 约成本。1.3 超临界流体萃取通常在较低温度下进行 能够有效地防止热敏性成分 的氧化和逸散,专门适合于那些对热敏锐性强、容易氧化分解成分的分离提取。1.4 超临界二氧化碳流体常态下是气体, 无毒 与萃取成分分离后, 完 全没有溶

7、剂的残留, 有效地解决了传统提取方法的溶剂残留问题。1.5 流体的溶解能力与其密度的大小相关 而温度、压力的微小变化都会 引起流体密度的大幅度变化, 并相应地表现为溶解度的变化。因此,能够利用 压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程。1.6 提取速度快、生产周期短 超临界二氧化碳提取（动态）循环一开始, 分离便开始进行。一样提取1 0min 便有成分分离析出, 24h 便可完全提取。同 时它无需浓缩等步骤,即便加入提携剂,也可通过分离功能除去。1.7 分离工艺流程简单 超临界萃取只由萃取器和分离器 2 部分组成，不 需要溶剂回收设备，操作方便，节约劳动力和大量有机溶剂，减小污染。而且操 作参数

8、容易操纵，因此，有效成分及产品质量稳固可控。1.8 超临界二氧化碳流体萃取能应用到不同类型的系统中33 如： 分 析型设备（萃取釜容积一样在500ml以下），中试设备（120L）,以及工业化 生产装置（萃取釜容积 50L 至数立方米）等。2 超临界二氧化碳流体萃取流体尽管超临界流体的溶剂效应普遍存在，但实际上需要考虑溶解度、选择性、 临界点数据以及化学反应的可能性等一系列因素，因而文献上常采纳的临界点流 体溶剂并不太多24，而以二氧化碳应用最广泛，因为二氧化碳超临界密度大， 溶解能力强，传质速率高；临界压力（7.39MPa）适中，临界温度31.06C,分 离过程可在接近室温条件下进行；廉价易得

9、，无毒，惰性以及极易从萃取产物中 分离出来等一系列优点，当前绝大部分超临界流体萃取都以二氧化碳为溶剂。由 于二氧化碳是一种非极性溶剂，因此二氧化碳流体最适合萃取亲脂性的化合物。关于极性化合物的萃取，通常选用极性较强的流体物质，如： CHClF2 （Freon-22）和NO2 2529。然而由于NO2流体容易产生爆炸，CHC1F2破坏 大气的臭氧层，极大地限制了两种流体的应用。水也可作为超临界流体材料(水的临界温度为374.2C,临界压力为22MPa) 3035,尽管它对极性化合物有较高的萃取率，然而由于需要较高的温度， 因此不适合萃取那些对热敏锐性强、容易分解的物质，而且在高温条件下水中的 氧

10、有腐蚀性，不仅使有机成分分解，而且可能破坏萃取罐。 因此超临界水流体 在实际应用中有专门大的局限性。本文要紧讨论超临界二氧化碳流体的应用，其他的超临界流体在那个地点不 做讨论。3 提携剂在超临界流体萃取过程中， 由于二氧化碳是非极性物质，比较适合于脂溶 性物质的萃取，但对极性较强的物质来说， 其溶解能力明显不足，现在， 为增 加二氧化碳流体的溶解性能，通常在其中加入少量极性溶剂，以增加其溶解能力， 这种溶剂称为提携剂(entrainer),也称夹带剂或修饰剂(cosolvent, modifier)。 提携剂通常是有机溶剂，它能够是某一种纯物质，也能够是两种或多种物质的混 合物。提携剂的加入能

11、够大大提高难溶化合物的溶解度，提高萃取效率，降低萃 取时刻，然而其作用机制至今仍不清晰，可能是由于提携剂与溶质分子之间的范 德华作用力，或与溶质之间形成氢键及其他各种化学作用力等阻碍了溶质在超临 界流体中的溶解度与选择性；另外，在溶剂的临界点邻近，溶质溶解度对温度、 压力的变化最为敏锐，加入提携剂后，混合溶剂的临界点相应改变，如能更接近 萃取温度，则可增加溶解度对温度、压力的敏锐程度3638。Hawthorne 等39使用超临界二氧化碳流体萃取薄荷和青兰中的精油时， 在 500g 的样品中只加入了 0.5ml 的 CH2Cl2 ，萃取时刻就由 90min 降低到 30min， 而萃取率与采纳水

12、蒸气蒸馏法提取4h的结果一致；Lin等40萃取黄芩根中 极性比较大的黄酮类化合物时，加入浓度为 70%的乙醇后，提取率比常规方法提 高了 12.6% ；姜继祖等41采纳超临界二氧化碳流体萃取光菇子中秋水仙碱 时，加入浓度为 76的乙醇做提携剂，结果萃取率提高了 1.25 倍。据文献报道，在天然植物的提取中，至少使用过 17种提携剂42，有水、 乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中， 乙醇是最常用的一种，尽管乙醇的极 性不如甲醇，然而由于乙醇无毒且易与二氧化碳混合，因此在天然植物的超临界 二氧化碳流体萃取中，广泛采纳乙醇做提携剂4351。水也能够做提携剂， Ling 52和Saldana等53在研

13、究中发觉，样品中含有约10%的湿度时， 能够大大提高萃取率； Miyachi 等54用水做提携剂，成功地萃取了木酚素和 黄酮类化合物。实验还发觉， 水和甲醇及水和乙醇的混合溶液做提携剂时， 比 单纯用甲醇和乙醇的成效好，可能是由于水能增加提携剂的极性，更有利于极性 化合物的提取， Lin 等40在提取黄芩根中的黄酮时发觉， 使用 70%的甲醇 作提携剂时， 其萃取率比纯甲醇作提携剂高 1 倍；笔者 55采纳超临界二氧 化碳流体萃取朝鲜淫羊藿中的总黄酮时，也发觉用 70的乙醇做提携剂时其萃 取成效比用纯乙醇高； Anu 56和 Janicot 等 57在超临界二氧化碳流体萃 取的研究中也证实了这

14、一点。此外，在超临界流体萃取过程中，还能够依照需要采纳不同的提携剂进行分 步萃取，能够得到不同的产物， Palma 等58用超临界流体萃取葡萄籽中的酚 类化合物时就采取 2 步萃取，第一采纳纯二氧化碳作为超临界流体进行萃取时， 要紧得到脂肪酸、脂肪族醛类和甾酮类化合物，然后再采纳甲醇做提携剂进行萃 取，要紧得到表儿茶酸和五倍子酸；Sargenti等59用超临界二氧化碳流体萃 取柠檬草时，采纳3 步萃取，分别加入正己烷、丙酮、甲醇做提携剂，得到不同 的产物。总之，采纳何种提携剂要紧取决于样品及产物的性质，并通过初步试验 确定最佳提携剂60， 61。尽管加入提携剂能够在一定程度上提高萃取率，然而同

15、时也萃取出了更多的 杂质，使选择性降低62， 63。此外， 假如提携剂的浓度不合适，反而会降低 萃取率， Sanagi 等 64 采纳超临界二氧化碳流体萃取可可豆中吡嗪，实验结 果说明， 当采纳 2%甲醇和 5%二氯甲烷做提携剂时，萃取率升高，而采纳 5% 甲醇和 2%二氯甲烷做提携剂时，萃取率反而下降。事实上，并不是所有的超临 界二氧化碳流体萃取 过程都需要提携剂， Ashraf-Khorassani 等 65从醉椒根 中萃取了7 种内酯，用纯二氧化碳流体时萃取率差不多上都超过 90%，加入乙醇 做提携剂萃取率没有显著提高。据报道甚至三萜类化合物在比较温顺的超临界二 氧化碳流体萃取条件下，当

16、无提携剂存在时，也能获得比较中意的萃取率66。提携剂的加入方式通常有 3 种54， 60， 64， 67：(1)是萃取前将提携剂直 截了当注入到样品基质中，这种方法是最简单、最经济的方法，但重现性差，是 目前最简单的近似评判不同提携剂的方法； (2)是将提携剂与液体二氧化碳在钢 瓶中预混； (3)是用另一泵注入提携剂，该方法准确度高、重现性好。4 样品的制备样品颗粒的大小及湿度情形是阻碍超临界萃取过程的重要因素。假如样品颗粒大，流体渗透速度慢，则萃取时刻将延长。Reverchon等67 在罗勒叶的超临界二氧化碳流体萃取中发觉，研磨成粉的样品（其粒度在 0.17mm 左右），2h就可萃取完全，而

17、样品颗粒为0.55mm时，萃取5h仍旧得不到中意的 萃取率。因此颗粒小的样品能加快萃取速度，提高萃取率68，但假如颗粒过 细则阻碍流体的正常流速，现在，可通过在样品中填充玻璃珠、沙子等解决这一 问题6971,其作用是这些沙粒能够防止样品被挤压成结实的、不能渗透的 硬塞，从而保持流体在样品中的正常渗透69， 70。此外，在超临界二氧化碳 流体萃取槽入口的末端安装一个金属过滤器，也有助于保持流体稳固的流速，幸 免形成流体沟70。在中草药及天然产物的超临界萃取过程中，当萃取产物挥发性专门强或专门 不稳固时，萃取时需要新奇的样品，现在， 样品的湿度比较大，在萃取过程中 水分容易形成冰堵塞限流器。Leh

18、otay 72报道，当大约0.3%的水溶解在超 临界二氧化碳流体中，萃取率可明显提高，而过量的水留在萃取缸中，会使一些 易溶于水的物质进入水相，使萃取率降低。除去水的最简单有效的方法是加入无 水Na2SO4，因为无水Na2SO4既能使流体和样品有效的接触提高萃取率，又能 吸取一定的水分，保留有效的湿度73。Polesello 22和Lang等74还发 觉，在样品中加入硅胶也能够专门好地除去水分。Miller等72用硅藻土与含 水样品混合制成颗粒，也能有效的吸取水分。适当加热限流器，也是有效地解决 堵塞的方法39， 48。此外，加入提携剂也是一个简单而有效地解决堵塞的方 法75, Weather

19、s等75在用超临界二氧化碳流体萃取湿红辣椒中的B-胡萝卜素时，加入的 2， 2-二甲氧基丙烷，不然而提携剂，又起到了干燥剂的作用。Heaton 等76用超临界二氧化碳流体萃取紫杉中的紫杉烷类成分时，发觉当 提携剂甲醇的浓度超过 5%时，限流器就不容易被石蜡等物质堵塞。超临界二氧化碳流体萃取经常选用干燥的样品，样品的干燥过程阻碍萃取的 产率和质量。依照文献报道，要紧有如下几种干燥方式45, 46, 60, 70, 77 80：冷冻干燥、烘箱干燥、真空旋转蒸发干燥、自然干燥等。可依照样品及萃 取产物的性质选择合适的干燥方法。5 压力与温度在超临界二氧化碳流体萃取中的作用在超临界萃取过程中,压力和温

20、度是两个最重要的物理参数,因为流体密度 是压力和温度的函数,而流体密度决定物质的溶解度,进而阻碍超临界二氧化碳 流体萃取的萃取率4781。同时还应该着重指出的是,物质在超临界流体中 的溶解度由两个因素决定,即物质的挥发性（是温度的函数）和流体的溶剂化效 应（是流体密度的函数）47。在超临界区域,流体密度能够在专门宽的范畴内 变化,即压力或温度的微小变化,均能够大幅度改变流体密度。温度一定时,萃取压力越高,流体的密度越大,对溶质的溶解力越强, 然 而过高的萃取压力会受到设备的限制。极性官能团（如羟基官能团）的数量阻碍 溶质的溶解度,需要较高的萃取压力。 Stahl 等82的实验结果说明, 在压力

21、 低于300bar时，能够选择性地萃取含有3个羟基的类固醇，但对含有4个羟基 的类固醇，或含有 3 个羟基1 个羧基的类固醇及含有1 个酚羟基和2 个其他羟基 的类固醇却无法萃取出来。Weathers等76在萃取辣椒粉中的B -胡萝卜素时 观看到，当压力从338bar降到250bar时，相应的流体密度降低，萃取率急剧下 降。采纳超临界萃取五味子中的木酚素时， Choi 等83发觉，假如萃取时刻 足够长（30min/100mg样品），温度（4080C ）和压力（135340bar）对木酚素 的萃取率没有明显的阻碍，然而假如萃取6min,则增大压力能显著提高萃取率。为了在超临界二氧化碳流体萃取过程

22、中得到较好的选择性，流体密度是至关 重要的参数。Gawdzik等84在实验中发觉，在60C最佳温度条件下，流体 密度操纵在 0.3g/ml 时，萃取物几乎差不多上所需要的化合物。萃取挥发性化合 物时假如压力过大，流体密度超过 0.80g/ml 容易导致甘油三酸酯萃取出来，不但 阻碍萃取物的纯度，而且容易造成限流器堵塞 71， 85。 Chouchi 等86在 对橙皮进行超临界二氧化碳流体萃取时，确定了最佳实验条件为40C、77bar （二 氧化碳流体密度为0.25g/ml）,同时在实验中发觉高流体密度会降低萃取的选择 性。超临界二氧化碳流体萃取迷迭香、罗勒属及牛至属叶中的精油，最佳萃取条 件是

23、温度为4050C，压力为8010Obar 67。通过操纵压力，即改变流体密度，能够分馏得到不同的产物。Ibanez等77 用两步超临界二氧化碳流体萃取法，从迷迭香叶中分别得到精油和抗氧化成分， 完成第一步的萃取条件是40C、100bar，第二步萃取是在60C、400bar的条件 下进行的。采纳不同流体密度还能够进一步分离萃取物，提高选择性， Marongiu 等80用超临界二氧化碳流体萃取几种植物叶中的精油，在压力90bar、温度 -5C时，第一在第一个分离器沉淀出一些石蜡；然后操纵压力为1520bar，温 度为1521C,在第二分离罐得到挥发油部分。Reverchon等67也采纳这种 方法将

24、萃取物中的石蜡与精油分开。假如被萃取物不是易挥发性物质,在超临界二氧化碳流体萃取过程中则需要 较高的流体密度。 Chun 等 47用超临界二氧化碳流体萃取紫杉树针时,在 300 atm、40C才能得到需要的产物，而在100atm、40C，即较低的流体密度条件 下,萃取物只有石蜡。用超临界二氧化碳流体萃取文朵灵生物碱,在最高的流体 密度时，得到了最高的提取率。 Marleny 等51用超临界二氧化碳流体萃取提 取二甲麦角新碱时，当温度保持70C不变，压力由lOObar增加到400bar时，萃 取率提高了85倍，假如在较低的温度和压力下，要想得到相同的萃取率，则需 要消耗大量的时刻和二氧化碳。此外

25、， 在进行秋水仙碱等生物碱萃取时，用 3% 甲醇做提携剂，当二氧化碳流体密度由0.8g/ml增加到0.9g/ml (247bar)，各种生 物碱萃取率增加23倍，而压力不变，温度由35C升到40C，各种生物碱的总 提取率变化专门小 87。温度对超临界流体溶解能力的阻碍比较复杂，压力一定时，随着温度的升高， 一方面二氧化碳流体密度降低，导致二氧化碳流体的溶剂化效应下降，使物质在 其中的溶解度下降；另一方面物质的蒸气压增大，使物质在二氧化碳流体中的溶 解度增大。当前者占主导地位时，溶解度呈下降趋势，后者占要紧地位，溶解度 呈上升趋势。 Lin 等58采纳超临界二氧化碳流体萃取黄芩根中的黄酮类化合

26、物，加入70%的甲醇做提携剂，当压力恒定时，温度由40C升高到50C，提取 率增加10%左右，温度由50C连续升高到60C，萃取率反而略微有些下降。 Ashraf-Khorassani 等88和陈钧等44在实验中也发觉了类似的规律。 Chiu 等50萃取银杏树中的黄酮类化合物时，发觉在一定的压力下（ 31.2MPa）， 随着温度的升高，萃取率呈下降趋势。总之，随着压力的增加二氧化碳流体密度将增大，因而有增加溶解能力的效 应，专门在临界点邻近，压力对密度的阻碍专门明显；与压力相比，温度对二氧 化碳流体中溶质溶解度的阻碍要复杂得多。应当指出，阻碍超临界二氧化碳流体 溶解能力最要紧的因素是溶质的性质

27、，这一因素决定该物质能否应用于超临界流 体萃取。6 萃取物的采集方法在超临界流体萃取中，样品的萃取过程完成后，产物的采集十分重要，假如 收集方法不当，会导致被分析物丢失，阻碍萃取率89，90。在天然产物的超 临界萃取过程中，常用的采集方法有：溶剂采集法、固相采集法和在线采集法。溶剂采集法确实是在采集的容器中装有液体溶剂，在溶剂中收集产物，这是 最常用也是最简便的方法，产物通过限流器出口流入到装有少量有机溶剂的容器 中，常用的有机溶剂有甲醇46，40，60，79、丙酮91、乙酸乙酯73， 92、 正己烷-甲醇63、二氯甲烷39, 71等等。Sanagi等64发觉，采集挥 发性化合物时，在冷却条件

28、下，采纳不同的有机溶剂，萃取率不同，如-8C时， 用二氯甲烷和丙酮做采集溶剂所得萃取率比甲醇和正己烷高。 Smith 等101 认为，用甲醇-冰（-15C ）和丙酮-冰（-60C ）做冷阱采集挥发性化合物均不如 液氮（-170C ）成效好。关于非挥发性萃取物的采集，在室温顺低温条件下，都 能得到比较中意的产率45， 71。应该注意的是，有机溶剂的浓度也可能阻碍 采集成效，相同体积的溶剂在相对窄口瓶中比宽口瓶中采集结果更好64。 固相采集法确实是萃取物采集到填充柱中，填充柱中装有吸附材料如：十八烷 基硅石（ODS）或惰性材料（如：不锈钢珠），固相采集也是一种比较常用的方 法，采集完成后，用适合的

29、溶剂将产物从固相中洗脱下来9396, 87。在 15C时，用ODS阱采集蛇麻草中的精油和苦味素，用乙腈洗脱保留的化合物 30。ODS固体阱在低温也能有效的吸附挥发性物质，通过升温至45C用有 机溶剂洗脱这些化合物30。固相采集能够依照萃取物的性质选择适合的吸附 阱及洗脱剂，并能够进一步提高选择性。例如：采纳硅胶柱收集极性化合物，选 用了合适的溶剂洗脱，就能得到中意的萃取率94， 96。然而固相采集法也有 它的局限性，假如选择了不适合的提携剂，可能导致萃取产物的丢失，因为提携 剂通过吸附阱可能将产物洗掉，这种情形就应该选用溶剂法收集或用空瓶收集。 此外，固相采集完成后，洗脱剂的选择专门重要，不适

30、合的洗脱剂会阻碍萃取结 果 28 。在线采集法，即采集装置与其他分析方法的在线联用。采集装置与气相色谱 相连，也确实是超临界二氧化碳流体萃取-气相色谱联用技术是最成功的一种模 式，是分析挥发性化合物的一个有用的方法。Smith等96发觉，低温（-10C） 采集对保留挥发性成分是必需的，即在低温条件下富集挥发性化合物，然后高温 下使其蒸发。除了超临界二氧化碳流体萃取气相色谱联用技术外，其他的在线耦合方法 也有报道47， 97，如：超临界二氧化碳流体萃取-液相色谱联用、超临界二氧 化碳流体萃取-红外联用、超临界二氧化碳流体萃取-质谱联用等。Ramsey等98 采纳超临界二氧化碳流体萃取-液相色谱-质谱联用，成功地分析了痕量的成分。 和前2 种方法相比联用技术有较高的灵敏度、较小的标准偏差、节约时刻，而且 对分析挥发性化合物专门有效，然而也存在许多不足之处，如对样品进样量的限 制，色谱系统易被污染等等99。7 结论本文从超临界流体的选择、提携剂的选取、样品的制备、萃取温度和压力的 阻碍、萃取物的采集等在超临界二氧化碳流体萃取实际操作中涉及到的几个方面 进行了综述。随着中药现代化进程的加快，超临界流体萃取技术以其快速、提取 率高、对环境污染小等特点，将在天然植物的提取中得到更加广泛的应用。