《疫荧光技术》PPT课件

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1、 免 疫 荧 光 技 术 威 斯 腾 生 物 技 术 中 心 威斯腾生物成立12周年庆 主要内容技术原理1实验流程2注意事项3常见问题4 免疫荧光技术(immunofluorescence)技术原理将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。 根 据 实 验 方 法 分 类 ： 直 接 法 间 接 法 补 体 法 其 他 补体法：利用补体反应，通过形成 抗原-抗体-

2、补体复合物发射荧光。 其他免疫荧光技术： 时间分辨免疫荧光分析 荧光偏振免疫分析技术 时间分辨免疫荧光测定时 间 分 辨 荧 光 免 疫 测 定 （ TRFIA） 是 一 种 非 同 位 素 免 疫 分 析 技 术 ，它 用 镧 系 元 素 标 记 抗 原 或 抗 体 ， 根 据 镧 系 元 素 螯 合 物 的 发 光 特 点 ，用 时 间 分 辨 技 术 测 量 荧 光 ， 同 时 检 测 波 长 和 时 间 两 个 参 数 进 行 信 号分 辨 ， 可 有 效 地 排 除 非 特 异 荧 光 的 干 扰 ， 极 大 地 提 高 了 分 析 灵 敏 度 。 荧光偏振免疫分析技术荧 光 偏 振

3、 免 疫 分 析 法 (fluorescence polarization immunoassay， FPIA)是 一 种 定 量 免 疫 分 析 技 术 ， 其 基 本 原 理 是 荧 光 物 质 经 单 一 平 面 的 蓝 偏 振光 (485nm)照 射 后 ， 吸 收 光 能 跃 入 激 发 态 ， 随 后 回 复 至 基 态 ， 并 发 出 单 一平 面 的 偏 振 荧 光 (525nm)。偏 振 荧 光 的 强 弱 程 度 与 荧 光 分 子 的 大 小 呈 正 相 关 ， 与 其 受 激 发 时 转 动 的速 度 呈 反 相 关 。 FPIA最 适 宜 检 测 小 至 中 等 分

4、子 物 质 ， 常 用 于 药 物 、 激 素的 测 定 。 激 光 共 聚 焦 扫 描 显 微 镜（ Confocal laser scanning microscope， CLSM） 用 激 光 作 扫 描 光 源 ， 逐 点 、 逐 行 、 逐 面 快 速 扫 描 成 像 ， 扫 描 的 激 光 与 荧 光 收集 共 用 一 个 物 镜 ， 物 镜 的 焦 点 即 扫 描 激 光 的 聚 焦 点 ， 也 是 瞬 时 成 像 的 物 点 。 系 统经 一 次 调 焦 ， 扫 描 限 制 在 样 品 的 一 个 平 面 内 。 调 焦 深 度 不 一 样 时 ， 就 可 以 获 得 样品 不

5、 同 深 度 层 次 的 图 像 ， 这 些 图 像 信 息 都 储 于 计 算 机 内 ， 通 过 计 算 机 分 析 和 模 拟 ，就 能 显 示 细 胞 样 品 的 立 体 结 构 。激 光 共 聚 焦 扫 描 显 微 镜 既 可 以 用 于 观 察 细 胞 形 态 ， 也 可 以 用 于 细 胞 内 生 化 成 分 的定 量 分 析 、 光 密 度 统 计 以 及 细 胞 形 态 的 测 量 , 配 合 焦 点 稳 定 系 统 可 以 实 现 长 时 间 活 细 胞 动 态 观 察 。 荧 光 显 微 镜 的 不 足 之 处 ：1、 无 法 实 现 对 荧 光 、 透 射 光 的 同

6、时 采 集 ， 无 法 实 现 多 重 荧 光 的 同 时 采 集 和 共 定 位 。2、 荧 光 的 散 射 光 太 强 ， 造 成 实 际 分 辨 率 的 大 大 下 降 。3、 荧 光 漂 白 及 对 细 胞 组 织 的 照 射 损 伤 。4、 无 法 对 样 品 进 行 断 层 扫 描 ， 完 成 3D的 工 作 。5、 滤 镜 对 荧 光 信 号 衰 减 大 ， 灵 敏 度 和 荧 光 强 度 不 够 。6、 可 以 观 察 活 细 胞 和 组 织 ， 但 是 细 胞 或 组 织 内 机 构 高 度 重 叠 。7、 只 能 在 二 维 坏 境 下 观 察 。8、 样 品 不 能 太

7、厚 。 9、 放 大 倍 率 小 。 荧 光 常 见 基 础 术 语 ：荧 光 物 质 ： 某 些 物 质 在 特 定 波 长 范 围 内 的 光 线 照 射 下 ， 可 发 出 波 长 比 照 射 光 长 的 光 线 ，即 荧 光 。 受 激 发 后 能 产 生 荧 光 的 物 质 称 为 荧 光 物 质 或 荧 光 素 。激 发 光 ： 能 特 异 性 地 激 发 某 种 荧 光 素 的 一 定 波 长 范 围 内 的 光 线 称 为 该 荧 光 素 的 激 发 光 。荧 光 探 针 ： 能 产 生 荧 光 的 特 异 性 生 物 染 料 （ PI， DAPI） 、 标 有 荧 光 素 的

8、 特 异 性 蛋 白 结合 物 （ 荧 光 抗 体 ） 。 自 发 荧 光 ： 组 织 和 细 胞 中 某 些 成 分 受 激 发 时 可 发 出 荧 光 ， 即 自 发 荧 光 。漂 白 ： 荧 光 物 质 受 激 发 时 ， 其 发 射 荧 光 的 能 力 逐 渐 下 降 并 最 终 丧 失 ， 即 漂 白 现 象 。 多 激 光 器 系 统 （ 多 通 道 激 光 检 测 ） ：在 可 见 光 范 围 内 使 用多 谱 线 氩 离 子 激 光 器 ， 发 射 波 长 为 457nm、 488nm和 514nm的 蓝 绿 光 ，氦 氖 绿 HeNe（ G） 激 光 器 提 供 发 射 波

9、长 为 543nm的 绿 光 ，氦 氖 红 HeNe（ R） 激 光 器 发 射 波 长 为 633nm的 红 光 ， 新 的 405nm的 半 导 体 激 光 器 的 出 现 可 以 提 供 近 紫 外 谱 线 。 目 前 常 用 于 标 记 抗 体 的 荧 光 素 有 以 下 几 种 ：异 硫 氰 酸 荧 光(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯 品 为 黄 色 或 橙 黄 色 结 晶 粉 末 ， 易 溶 于 水 和酒 精 溶 剂 。 有 两 种 异 构 体 ， 其 中 异 构 体 型 在 效 率 、 稳 定 性 与 蛋 白 质 结 合 力 等 方

10、 面 都 更 优良 。 FITC分 子 量 为 389.4， 最 大 吸 收 光 波 长 为 490 495nm， 最 大 发 射 光 波 长 为 520 530nm，呈 现 明 亮 的 黄 绿 色 荧 光 。 FITC在 冷 暗 干 燥 处 可 保 存 多 年 ， 是 目 前 应 用 最 广 泛 的 荧 光 素 。 其主 要 优 点 是 人 眼 对 黄 绿 色 较 为 敏 感 ， 通 常 切 片 标 本 中 的 绿 色 荧 光 少 于 红 色 。四 乙 基 罗 丹 明(rhodamine, RB200) RB200为 橘 红 色 粉 末 ， 不 溶 于 水 ， 易 溶 于 酒 精 和 丙 酮

11、 ， 性 质 稳 定 ， 可长 期 保 存 。 最 大 吸 收 光 波 长 为 570nm， 最 大 发 射 光 波 长 为 595 600nm， 呈 现 橘 红 色 荧 光 。四 甲 基 异 硫 氰 酸 罗 丹 明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为 罗 丹 明 的 衍 生 物 ， 呈 紫 红 色 粉 末 ， 较 稳 定 。 最 大 吸 收 光 波 长 为 550nm， 最 大 发 射 光 波 长 为 620nm， 呈 现 橙 红 色 荧 光 ， 与FITC的 翠 绿 色 荧 光 对 比 鲜 明 ， 可 配 合 用 于 双 重

12、 标 记 或 对 比 染 色 。 因 其 荧 光 淬 灭 慢 ， 也 可 用于 单 独 标 记 染 色 。 酶 作 用 后 产 生 荧 光 的 物 质某 些 化 合 物 本 身 无 荧 光 效 应 ， 一 旦 经 酶 作 用 便 形 成 具 有 强 荧 光 的 物 质 。 例 如 ， 4-甲 基 伞 酮- -D半 乳 糖 苷 受 -半 乳 糖 苷 酶 的 作 用 分 解 成 4-甲 基 伞 酮 ， 后 者 可 发 出 荧 光 ， 激 发 光 波 长为 360nm， 发 射 光 波 长 为 450nm。 其 他 如 碱 性 磷 酸 酶 的 底 物 4-甲 基 伞 酮 磷 酸 盐 和 辣 根 过

13、氧 化物 酶 的 底 物 对 羟 基 苯 乙 酸 等 。镧 系镧 系 螯 合 物 某 些 3价 稀 土 镧 系 元 素 如 铕 （ Eu3） 、 铽 （ Tb3） 、 铈 （ Ce3） 等 的 螯 合 物 经 激 发后 也 可 发 射 特 征 性 的 荧 光 ， 其 中 以 Eu3 应 用 最 广 。 Eu3螯 合 物 的 激 发 光 波 长 范 围 宽 ， 发 射光 波 长 范 围 窄 ， 荧 光 衰 变 时 间 长 ， 最 适 合 用 于 分 辨 荧 光 免 疫 测 定 。藻 红 蛋 白 （ P-phycoerythrin， PE）PE是 在 红 藻 中 所 发 现 的 一 种 可 进 行

14、 光 合 作 用 的 自 然 荧 光 色 素 ， 分 子 量 为 240kD的 蛋 白 ， 最大 吸 收 峰 为 564 nm， 当 使 用 488 nm激 光 激 发 时 其 发 射 荧 光 峰 值 约 为 576 nm， 对 于 单 激 光 器 的 流 式 细 胞 仪 来 说 ， 推 荐 使 用 585 21nm的 带 通 滤 光 片 ， 双 激 光 器 的 流 式 细 胞 仪 推 荐 使 用575 13nm的 带 通 滤 光 片 。 FL2探 测 器 检 测 PE。 多 甲 藻 叶 绿 素 蛋 白 （ PerCP）PerCP是 在 甲 藻 和 薄 甲 藻 的 光 学 合 成 器 中 发

15、现 的 ， 是 一 种 蛋 白 复 合 物 ， 分 子 量 约为 35kD， 最 大 激 发 波 长 的 峰 值 在 490nm附 近 ， 当 被 488nm氩 离 子 激 光 激 发 后 ， 发射 光 的 峰 值 约 为 677nm。 FL3探 测 器 检 测 PerCP。碘 化 丙 啶 （ propidium iodide， PI）可 选 择 性 地 嵌 入 核 酸 （ DNA、 RNA） 的 双 螺 旋 碱 基 对 中 。 在 对 DNA染 色 时 ， 需 用RNase对 细 胞 进 行 处 理 ， 以 排 除 RNA对 DNA荧 光 定 量 精 度 的 影 响 。 在 488nm波 长

16、 激发 下 ， PI的 发 射 光 谱 为 610-620nm。 FL2探 测 器 检 测 PI。 细 胞 爬 片 免 疫 荧 光 实 验 流 程1. 细 胞 爬 片 的 制 作 ； 2. 固 定 （ 4%的 多 聚 甲 醛 ） ； 3. 细 胞 膜 通 透 （ 0.5%Triton X-100， 20min） ；4. 封 闭 （ 6%山 羊 血 清 ， 30min） ； 5. 一 抗 孵 育 （ 一 抗 浓 度 ， 湿 盒 ， 4 过 夜 ， PBS漂 洗 ） ； 6. 二 抗 孵 育 （ 二 抗 种 属 ， 湿 盒 ， 室 温 1h， 避 光 ， PBS漂 洗 ） ；7. 复 染 核 （

17、DAPI， 避 光 ， 5min， PBS漂 洗 ） ；8. 封 片 （ 荧 光 淬 灭 剂 的 封 片 液 ） ；9. 荧 光 显 微 镜 下 观 察 采 集 图 像 。 1. 细 胞 的 固 定【 固 定 的 定 义 】将 新 鲜 的 活 体 组 织 或 细 胞 ， 立 即 加 入 固 定 液 中 ， 以 此 使 细 胞 保 持 原 有 形 态 、 结 构 的 一 种 方 法 。【 固 定 的 意 义 】1、 组 织 和 细 胞 的 蛋 白 质 凝 固 ， 终 止 内 源 性 或 外 源 性 酶 反 应 ， 原 位 保 存 抗 原 ， 避 免 抗 原 失 活或 弥 散 。2、 停 止 细

18、胞 中 的 生 化 反 应 ， 固 定 其 中 的 各 种 生 化 物 质 状 态 ， 防 止 细 胞 死 亡 后 出 现 自 溶 分 解 。3、 使 细 胞 中 蛋 白 质 、 脂 肪 、 糖 、 酶 等 成 分 转 变 为 不 溶 性 物 质 ， 以 保 持 生 前 形 态 。 4、 固 定 细 胞 形 态 ， 防 止 其 变 形 或 破 裂 。5、 使 组 织 内 各 种 物 质 产 生 不 同 的 折 光 率 ， 便 于 观 察 和 鉴 定 。6、 使 不 同 组 织 成 分 对 染 料 有 不 同 的 亲 和 力 ， 便 于 染 色 。 免 疫 荧 光 实 验 流 程 中 一 些 注

19、 意 事 项 【 固 定 液 的 选 择 】 2、 冰 冻 切 片 制 备 ：建 议 用 新 鲜 组 织 ， 否 则 组 织 细 胞 内 部 结 构 破 坏 ， 易 使 抗 原 弥 散 。选 用 干 净 锋 利 的 刀 片 、 组 织 一 定 要 冷 冻 适 度 等 ， 防 止 裂 片 和 脱 片 严 重 。 3、 血 清 封 闭 ：为 防 止 内 源 性 非 特 异 性 蛋 白 抗 原 的 结 合 ， 需 要 在 一 抗 孵 育 前 先 用 血 清 （ 与 二 抗 来 源 一 致 ）封 闭 ， 减 弱 背 景 着 色 。封 闭 是 血 清 与 非 特 异 性 位 点 结 合 ， 以 消 除

20、非 特 异 性 染 色 ， 提 高 目 的 蛋 白 的 准 确 性 和 降 低背 景 。 血 清 封 闭 的 时 间 是 可 以 调 整 的 ， 一 般 30min。 4、 一 抗 孵 育 条 件 ：在 免 疫 荧 光 实 验 中 最 重 要 ， 包 括 孵 育 时 间 和 抗 体 浓 度 ；一 抗 孵 育 温 度 有 几 种 ： 4度 、 室 温 、 37度 ， 其 中 4度 效 果 最 佳 ；孵 育 时 间 ： 这 与 温 度 、 抗 体 浓 度 有 关 ， 一 般 37度 1-2h， 而 4度 过 夜 和 从 冰 箱 拿 出 后 37度 复 温 45min； 具 体 条 件 还 要 摸

21、索 。 6、 复 染 ：目 的 是 形 成 细 胞 轮 廓 ， 从 而 更 好 地 对 目 标 蛋 白 进 行 定 位 ；一 般 常 用 DAPI复 染 。 7、 封 片 ：为 了 长 期 保 存 ， 我 们 一 般 用 缓 冲 甘 油 等 封 片 ， 此 外 还 有 专 门 的 抗 荧 光 萃 灭 封 片 液 ；避 免 产 生 气 泡 。 5、 二 抗 孵 育 条 件 ：二 抗 一 般 室 温 或 37度 30min-1h， 具 体 时 间 需 要 摸 索 ；而 浓 度 一 般 有 工 作 液 ， 若 是 浓 缩 液 还 要 摸 索 浓 度 ；切 记 要 避 光 反 应 ；但 在 免 疫 荧

22、 光 中 我 们 一 般 先 把 二 抗 浓 度 和 孵 育 时 间 先 定 下 ， 然 后 去 摸 索 一 抗 浓 度 和孵 育 时 间 ；最 后 ， 荧 光 素 标 记 的 二 抗 随 着 保 存 时 间 的 延 长 ， 可 能 后 有 大 量 的 游 离 荧 光 素 残 留 ，需 要 注 意 配 制 时 小 包 装 和 并 进 行 适 当 的 离 心 。 8、 切 片 清 洗 ：为 了 防 止 一 抗 、 二 抗 等 试 剂 残 留 而 引 起 非 特 异 性 染 色 ， 所 以 适 当 地 加 强 清 洗 （ 延 长 时 间和 增 多 次 数 ） 尤 为 重 要 ， 一 般 在 一 抗

23、 的 清 洗 是 5min*3次 ；注 意 （ 1） 单 独 冲 洗 ， 防 止 交 叉 反 应 造 成 污 染 。 （ 2） 温 柔 冲 洗 ， 防 止 切 片 的 脱 落 ； （ 3） 冲 洗 的 时 间 要 足 够 ， 才 能 彻 底 洗 去 结 合 的 物 质 。 （ 4） PBS的 PH和 离 子 强 度 的 使 用 和 要 求 ， 建 议 PH在 7.4-7.6浓 度 是 0.01M。 （ 中 性 及 弱 硷 性 条 件 （ PH7-8） 有 利 于 免 疫 复 合 物 的 形 成 ， 而 酸 性 条 件 则 有 利 于 分 解 ； 低 离 子 强 度 有 利 于 免 疫 复 合

24、物 的 形 成 ， 而 高 离 子 强 度 则 有 利 于 分 解 ） 9、 拍 照 ：封 好 片 和 用 指 甲 油 封 固 ， 保 持 避 光 和 湿 度 ；正 确 使 用 荧 光 显 微 镜 ， 防 止 紫 外 线 对 眼 睛 的 损 害 ；检 查 时 间 每 次 以 12h为 宜 ， 超 过 90min， 超 高 压 汞 灯 发 光 强 度 逐 渐 下 降 ， 荧 光 减 弱 ；激 发 光 长 时 间 的 照 射 ， 会 发 生 荧 光 的 衰 减 和 淬 灭 现 象 ； 所 以 最 多 不 得 超 过 23h；荧 光 显 微 镜 光 源 寿 命 有 限 ， 标 本 应 集 中 检 查

25、 ， 以 节 省 时 间 ， 保 护 光 源 。 后 欲 再 启 用时 ， 须 待 灯 光 充 分 冷 却 后 才 能 点 燃 ， 一 天 中 应 避 免 数 次 点 燃 光 源 ， 关 闭 汞 灯 至 少 在开 启 15-30分 钟 后 ；时 效 性 ： 标 本 染 色 后 立 即 观 察 ， 因 时 间 久 了 荧 光 会 逐 渐 减 弱 。 若 将 标 本 放 在 聚 乙 烯 塑 料 袋 中 4 保 存 ， 可 延 缓 荧 光 减 弱 时 间 ， 防 止 封 裱 剂 蒸 发 ；使 用 的 玻 片 等 载 体 ， 都 必 须 厚 度 均 匀 ， 无 明 显 的 自 发 荧 光 ， 如 果

26、使 用 油 镜 ， 还 必 须保 证 镜 油 为 无 荧 光 镜 油 ；电 源 最 好 装 稳 压 器 ， 否 则 电 压 不 稳 不 仅 会 降 低 汞 灯 的 寿 命 ， 也 会 影 响 镜 检 的 效 果 。 免疫荧光技术常见问题1、 石 蜡 切 片 和 冰 冻 切 片 的 比 较 ？ （ 1） 要 求 做 冰 冻 切 片 的 不 一 定 能 做 石 蜡 切 片 ， 因 为 作 石 蜡 切 片 时 要 高 温 烤 片 ， 可 能会 破 坏 组 织 的 抗 原 性 ， 如 果 组 织 的 抗 原 性 较 稳 定 ， 则 可 作 石 蜡 切 片 ； 但 是 要 求 做 石 蜡切 片 的 ，

27、可 作 冰 冻 切 片 。 （ 2） 冰 冻 切 片 的 优 点 是 能 够 较 好 的 保 存 组 织 的 抗 原 免 疫 活 性 ， 做 免 疫 荧 光 时 不 需 抗原 修 复 这 一 步 。 缺 点 是 细 胞 内 易 形 成 冰 晶 而 破 坏 细 胞 结 构 ， 可 能 会 使 抗 原 弥 散 ； 切 片厚 度 较 石 蜡 的 厚 ， 做 的 片 子 没 石 蜡 的 漂 亮 。 当 你 买 一 抗 时 ， 目 录 上 都 写 着 做 什 么 样 的切 片 ， 如 果 它 写 着 只 能 做 冰 冻 ， 就 不 能 做 石 蜡 ， 如 写 着 两 者 都 可 ， 那 就 都 能 做

28、。 （ 3） 石 蜡 切 片 的 优 点 可 以 保 持 组 织 细 胞 的 形 态 结 构 ， 且 容 易 存 放 在 室 温 ， 而 冰 冻 切片 比 较 麻 烦 ， 一 定 要 存 在 -80度 的 低 温 冰 箱 中 。 由 于 石 蜡 切 片 可 以 切 到 4微 米 左 右 ， 抗 体 容 易 渗 透 到 组 织 中 去 ， 而 且 得 到 的 颜 色 /形 态 都 较 冰 冻 切 片 好 。 2、 一 抗 的 选 择 要 点 和 技 巧 是 什 么 ？ （ 1） 单 克 隆 和 多 克 隆 抗 体 的 选 择 。 由 一 种 克 隆 产 生 的 特 异 性 抗 体 叫 做 单 克

29、 隆 抗 体 。 单 克 隆抗体 能 目 标 明 确 地 与 单 一 的 特 异 抗 原 决 定 簇 结 合 ， 就 像 导 弹 精 确 地 命 中 目 标 一 样 。 另 一 方 面 ，即 使 是 同 一 个 抗 原 决 定 簇 ， 在 机 体 内 也 可 以 由 好 几 种 克 隆 来 产 生 抗 体 ， 形 成 好 几 种 单 克 隆 抗体 混 杂 物 ， 称 为 多 克 隆 抗 体 。 在 抗 原 抗 体 反 应 中 ， 一 般 单 克 隆 抗 体 特 异 性 强 ， 但 亲 和 力 相 对小 ， 检 测 抗 原 灵 敏 度 相 对 就 低 ； 而 多 克 隆 抗 体 特 异 性 稍

30、弱 ， 但 抗 体 的 亲 和 力 强 ， 灵 敏 度 高 ，但 易 出 现 非 特 异 性 染 色 （ 可 以 通 过 封 闭 等 避 免 ） 。 （ 2） 应 用 范 围 的 选 择 。 有 的 一 抗 只 能 用 于 Western blotting， 或 免 疫 组 化 、 免 疫 荧 光 、 免疫沉 淀 等 ； 甚 至 表 明 石 蜡 切 片 或 冰 冻 切 片 。 （ 3） 种 属 反 应 性 的 选 择 （ species reactivity） 。 这 一 点 很 重 要 ， 表 明 这 种 抗 体 可 能存在 种 属 差 异 ， 且 这 种 抗 体 适 合 检 测 哪 种 种

31、 属 动 物 体 内 的 抗 原 。 （ 4） 种 属 来 源 ， 一 般 兔 来 源 的 多 是 多 克 隆 ； 而 小 鼠 来 源 的 多 是 单 克 隆 ， 但 也 有 另 外 。 根据 此 来 源 来 选 择 相 应 的 二 抗 。 （ 5） 生 产 厂 家 的 选 择 。 如 santa Cruz公 司 抗 体 一 般 1ml， 价 格 2100元 左 右 ； 而 chemicon公 司 一 抗 一 般 100ul， 价 格 2800元 左 右 。 这 两 个 厂 家 的 同 一 种 抗 体 它 的 实 际 效 价 稳 定 是 不同 的 ， 我 一 般 用 后 者 抗 体 做 免 疫

32、 组 化 效 果 较 好 ， 而 前 者 做 Western blotting效 果 还 可 以 。 3、 在 什 么 情 况 下 使 用 Triton-X100 （ 1） Triton X-100化 学 名 称 为 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 醚 ， 是 一 种 去 污 剂 。 在 免 疫 组 织化 学 （ 10um厚 切 片 ） 和 免 疫 细 胞 化 学 中 一 般 用 Triton X-100 作 为 细 胞 通 透 剂 ，在 膜 上 打 孔 。 （ 2） 其 作 用 原 理 ： Triton X-100 可 以 溶 解 细 胞 膜 、 细 胞 核 膜 、 细 胞 器 膜 上 的

33、脂质 而 使 抗 体 及 大 分 子 结 构 的 物 质 进 入 胞 浆 和 胞 核 内 ， 故 在 细 胞 免 疫 组 化 时 尤 为 推荐 使 用 ， 这 样 抗 体 就 能 顺 利 进 入 胞 内 与 相 应 抗 原 结 合 。 （ 3） Triton X-100既 是 一 种 表 面 活 性 剂 ， 也 有 抗 氧 化 作 用 。 4、 封 闭 血 清 的 选 择 原 则 是 什 么 ？ （ 1） 膜 上 或 切 片 上 有 剩 余 的 位 点 可 以 非 特 异 性 吸 附 抗 体 ， 造 成 后 续 结 果 的 假阳 性 ！ （ 2） 封 闭 血 清 一 般 是 和 二 抗 同 一

34、 来 源 的 ， 血 清 中 动 物 自 身 的 抗 体 ， 预 先 能 和组 织 中 有 交 叉 反 应 的 位 点 发 生 结 合 ， 否 则 在 后 面 的 步 骤 中 如 果 和 二 抗 发 生 结合 ， 会 造 成 背 景 。 （ 3） 也 可 以 用 小 牛 血 清 、 BSA、 羊 血 清 等 ， 但 不 能 与 一 抗 来 源 一 致 。 5、 抗 体 孵 育 条 件 的 比 较 ？ （ 1） 一 抗 孵 育 温 度 有 几 种 ： 4度 、 室 温 、 37度 ， 其 中 4度 效 果 最 佳 ； 孵 育 时 间 ： 这 与 温度 、 抗 体 浓 度 有 关 ， 一 般 37

35、度 1-2h， 而 4度 过 夜 和 从 冰 箱 拿 出 后 37度 复 温 45min。 （ 2） 二 抗 一 般 室 温 或 37度 30min-1h， 具 体 时 间 需 要 摸 索 。 6、 一 抗 4度 孵 育 后 为 什 么 要 进 行 37度 复 温 ？ （ 1） 一 方 面 ， 防 止 切 片 从 4度 直 接 放 入 PBS易 脱 片 ； （ 2） 另 一 方 面 ， 使 抗 原 抗 体 结 合 更 稳 定 。 一 般 不 需 要 ， 但 对 表 达 较 弱 的 抗 原 可 能 有 ，4度 和 37度 时 分 子 运 动 方 式 不 同 ， 前 者 分 子 碰 撞 机 率 和

36、 运 动 速 度 小 于 后 者 ， 后 者 结 合 更 快 ， 但 敏 感 性 也 提 高 了 并 易 造 成 非 特 异 染 色 。 7、 如 何 最 大 限 度 地 降 低 组 织 非 特 异 性 染 色 ？ （ 1） 缩 短 一 抗 /二 抗 孵 育 时 间 、 稀 释 抗 体 来 控 制 。 这 是 最 重 要 的 一 条 。 （ 2） 一 抗 用 多 克 隆 抗 体 易 出 现 非 特 异 性 着 色 ， 建 议 试 用 单 克 隆 抗 体 看 看 。 （ 3） 非 特 异 性 组 分 与 抗 体 结 合 ， 这 需 要 通 过 延 长 二 抗 来 源 的 动 物 免 疫 血 清

37、封 闭 时间 和 适 当 增 加 浓 度 来 加 强 封 闭 效 果 ； （ 4） 适 当 增 加 PBS冲 洗 次 数 和 浸 洗 时 间 ， 在 一 抗 、 二 抗 孵 育 之 后 的 浸 洗 尤 为 重 要 ； （ 5） 防 止 标 本 染 色 过 程 中 出 现 干 片 ， 这 容 易 增 强 非 特 异 性 着 色 。 8、 背 景 染 色 较 深 的 原 因 有 哪 些 ？ （ 1） 抗 体 浓 度 过 高 ： 一 抗 浓 度 过 高 是 常 见 的 原 因 之 一 。 解 决 办 法 是 ， 每 次 使 用 新 抗 体前 应 当 对 其 工 作 浓 度 进 行 测 试 ， 使 每

38、 一 抗 体 个 体 化 ， 找 到 适 合 自 己 实 验 室 的 理 想 工 作浓度 ， 既 使 是 即 用 型 的 抗 体 也 应 如 此 ， 不 能 只 简 单 的 按 说 明 书 进 行 染 色 。 （ 2） 抗 体 孵 育 时 间 过 长 或 温 度 较 高 ： 解 决 办 法 是 ， 严 格 执 行 操 作 规 程 ， 最 好 随 身 佩 带报 时 表 或 报 时 钟 ， 及 时 提 醒 ， 避 免 因 遗 忘 而 造 成 时 间 延 长 。 要 根 据 染 色 结 果 进 行 调 整 。 （ 3） 组 织 变 干 ： 修 复 液 溢 出 后 未 及 时 补 充 液 体 、 染

39、色 切 片 太 多 、 动 作 太 慢 、 忘 记 滴 液 、滴 液 流 失 等 都 是 造 成 组 织 变 干 的 原 因 。 解 决 的 办 法 是 操 作 要 认 真 仔 细 ， 采 用 DAKO笔 或PAP Pen在 组 织 周 围 画 圈 ， 可 以 有 效 的 避 免 液 体 流 失 ， 也 能 提 高 操 作 速 度 。 （ 4） 切 片 在 缓 冲 液 或 修 复 液 中 浸 泡 时 间 太 长 （ 大 于 24小 时 ） ： 原 因 尚 不 清 楚 ， 但 现 象存 在 。 如 果 放 在 室 温 ， 特 别 是 炎 热 的 夏 天 ， 会 出 现 背 景 着 色 ， 因 此

40、 ， 不 可 存 放 时 间 太长 。 （ 5） 一 抗 变 质 、 质 量 差 的 多 克 隆 抗 体 ： 注 意 抗 体 的 有 效 期 ， 过 期 的 抗 体 要 么 不 显 色 要么 背 景 着 色 。 用 新 买 的 抗 体 时 最 好 设 立 阳 性 对 照 和 用 使 用 过 的 抗 体 作 比 较 。 9、 做 间 接 法 免 疫 荧 光 染 色 ， 如 何 设 置 对 照 ？ 最 好 是 同 一 视 野 在 未 用 荧 光 激 发 下 进 行 对 照 ， 看 是 否 非 特 异 性 染 色 。 （ 1） 空 白 对 照 ： 如 果 你 做 的 是 石 蜡 切 片 免 疫 荧 光 ， 这 个 对 照 必 须 有 ， 目 的是 看 自 发 荧 光 ， 脱 蜡 后 直 接 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 。 （ 2） 阴 性 对 照 ： 标 本 直 接 滴 加 二 抗 ， 呈 阴 性 反 应 。 （ 3） 抗 原 对 照 ： 标 本 加 同 种 动 物 的 未 免 疫 血 清 ， 以 PBS冲 洗 后 ， 在 加 抗 免 疫 球 蛋 白 荧 光 抗 体 。 因 未 免 疫 动 物 的 血 清 中 无 特 异 性 抗 体 ， 应 呈 阴 性 反 应 。 10、 免 疫 荧 光 双 染 抗 体 的 选 择 注 意 哪 些 ？ THANK YOU ！