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1、菌种的保存：真空冷冻干燥法 1 准备安培管 用于真空冷冻菌种保藏的安 培管宜采用中性玻璃制造， 形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安培 管。大小要求外径67.5mm长105 mnr，球部直径911 mm壁厚0.6 1.2 mm,也可用没有球 部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡810h, 再经自来水冲洗多次， 用蒸馏水涮洗 2 3次，烘干；在每管内放入打 好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121C下高 压灭菌 20 分钟,备用。2 准备菌种 用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几 十 年，为了不出现差错，所用菌种纯度要高，而且菌龄要适宜。细菌 和酵母菌 的菌龄要求超过对数
2、生长期， 若用对数生长期的菌种进行保 藏，其存活 期反而降低。一般细菌的菌龄要求2448h;酵母菌为3d;形成抱子的微 生物则宜保藏孢子 ；放线菌和丝状真菌菌龄为 710d。3 保护剂的选择和准备 选取新鲜牛奶作为保护剂， 牛奶要先脱脂， 用离 心方法去除上层油脂，115 C下高压蒸汽灭菌25min,备用。4 菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期 为 好，抱子是新鲜的。每支长好的斜面加23ml保护剂，用接种环将菌苔 轻轻刮起 （注意勿刮起培养基 ） ,制成菌悬液。 如用液体培养的 菌 种,则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞, 收集的菌体用保 护剂悬 浮制成菌悬液。悬液
3、中菌数要求达到108101。个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。 分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底 部，每管分装量约 0.10.2毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻 。分装时应注意在无菌条件下操作。5 预冻 -80 C 冰箱预冻 1 2 小时。6 冷冻干燥 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内， 始冷冻干燥，时间一般为 8-20 小时。终止干燥时间应根据下列情况 判断：安甑管内冻干物呈酥块状或松散片状；真空度接近空载时的最高值； 选用 1-2 支对照管， 其水份与菌悬液同量， 视为干燥完 结。7 封口 抽真空干燥后，取出安培瓶，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形 五通管继续抽气，约10min即可达到267Pa (0.2mmHg。于真空 状态 下，以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。8保藏 安瓿管保藏在-20 C 冰箱里。9 活化 如果要从中取出菌种恢复培养，可先用 75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端，使管子破裂， 在安瓿管中加 入0.51ml 液体培养基，慢慢旋转安瓿管，使冻干菌种复水，然后 直接接种到琼脂斜面或涂布平板。
菌种的保存真空冷冻干燥法
