精氨酸激酶的提取与纯化

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1、精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（AK）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录1弓I言11.1精氨酸激酶（AK） 11.2 亲和层析法 21.3 电泳法 21.4 本实验主要工作 32.1 实验用品32.1.1 实验材料 32.1.1 实验试剂 32.1.2 仪器设备 42.2 方法52.2.1 活化菌种 52.2.2 扩大培养 52.2.3 IPTG 诱导 AK 基因的表达52.2.4 蛋白质提取 52.2.5 蛋白质的检测 62.2.6 His-tag Ni 亲和层析法纯化融合蛋白6

2、3 结果与分析 73.1 蛋白质层析图谱73.2 AK 诱导表达电泳图84 总结 9参考文献 10致谢 10精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学 1005班 湖北 黄石 435002）摘要：精氨酸激酶（ATP： N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细 胞代谢的磷酸激酶。本实验采取含有包含 AK 基因的重组质粒的表达菌体 E. coli Rosetta ， 在含有50卩g/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。当菌体浓度A600达到0.6-0.8时，加入 异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷（IPTG），使培养基中的IPTG

3、终浓度为0.2 mM，诱导培养3小时 后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最 后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。关键词：精氨酸激酶 分离与纯化1引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种， 主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶 1。它的作用是催 化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子 磷酸精氨酸3，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。 AK 在体内催化反应方程式如下：Mg2+ +

4、 ADP + Arginine phosphate V 二匚 Mg2+ + ATP + ArginineAK 广泛颁布在许多无脊椎动物体内，目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动 物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到 AK。虽然 AK 在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的 AK 在 结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类： 1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子

5、量为40KD。2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。3.环节 动物 Sabellapavonina 中的 AK 具有四个亚基，分子量为 150-160KD。1.2 亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体(ligand)之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与 另一个分子或原子结合(一般是非共价结合)的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层 析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一 种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地 与基质结合，而其它没有

6、结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后 可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高 1000 至 10000 倍。His-tag 所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与 Ni 离子结合，而 Ni 离子与融合蛋白的 6Xhis 之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白 区分开来。加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回 收靶蛋白。1.3 电泳法电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加 到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白

7、质的目 的，这样的电泳称之凝胶电泳(gel electrophoresis)。凝胶可以是淀粉凝胶(starch gel)、 琼脂糖凝胶(agarose gel)和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白 质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。聚丙烯酰胺凝胶电泳(英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， 简称SDS-PAGE)，其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具 有分子

8、筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原 剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。1.4 本实验主要工作1.4.1 从大肠杆菌 Rosseta 中得到精氨酸激酶的粗提液1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过 Ni

9、亲和层析进行进一步纯化1.4.3对所得结果通过SDS-PAGE进行检测2 材料与方法2.1 实验用品2.1.1 材料含有重组有AK基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta2.1.2 试剂LB液体培养基(100 mL)：蛋白胨1g,酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g50 mg/mL 卡那霉素( kanamycin)IPTGBinding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加口He 1 调PH至8.0 咪唑(10 mM、250 mM)12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水1.6030 %丙烯酰胺2.001.5 M Tris (PH 8.8)1

10、.3010 % SDS0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶 （2 mL）成分体积（ mL）水1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8)0.2510 % SDS0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED0.002样品缓冲液考马斯亮蓝 R-2502.1.3仪器设备 YC-1 型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）； CXG-1 型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司） TGL-16LA 高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）； GL-2M 型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）； 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科

11、学仪器公司）超纯水机AYJ1-0501-U （颐洋企业发展有限公司） SDS-PAGE 电泳仪电子天平 TE412-L, TE2101-L, CP64 （德国 Satorins 公司） BS-1E振荡培养箱（江苏省金坛市亿通电子仪器厂） SW-CJ-1FD 单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 3FG-01B 电热恒温鼓风干燥箱漩涡混合器XH-C （江苏省金坛市医疗仪器厂）高压灭菌锅YXQ-LS-50S （上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、 枪头 、接种环 、酒精棉球 、离心管、恒温水浴锅等。2.2 方法2.2.1 活化菌种取工程菌种50 pL装有6 mL的LB液体培养基的试管（

12、含有6 pL卡那青霉素，其工 作浓度为50 pg/mL）中。于37C摇床振荡培养8-12小时。2.2.2 扩大培养将试管中活化的6 mL菌液接种到300 mL LB培养基，同时加入300 pL卡那青霉素（终 浓度50 pg/mL）培养基于37C恒温培养箱中培养2-3小时。2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用 OD 值表征菌体密度）加入 IPTG 诱导表达发现，当 OD=0.6-0.8时，加IPTG 150 pL至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。2.2.4 蛋白质提取1 ）将上述各管于 4C， 5000 r/m 离心 10 min；(2) 弃上清，加入蒸纟

13、留水使沉淀物质重悬，再于4C, 6000 r/m离心10 min；(3) 弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 mL裂解液使其重悬；(4) 在冰上进行10 min,超声3 s，间隔为2 s的超声波破壁，反复破壁直到沉淀变得澄 清为止；(5) 于4C, 12000 r/m,离心15 min,取上清，得到AK的粗提液；2.2.5 蛋白质的检测SDS-PAGE电泳检验：1) 安装双垂直板电泳槽；2) 配12%的分离胶5 mL,浓缩胶3 mL；3) 制样：取样品10 pL加样品缓冲液以40 pL混合，100C加热5 min , 15000Xg, 4C 离心 1 min；4) 上样：用微量注射器加样

14、 15-20 pL ；5) 电泳：在浓缩胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继 续电泳直到染料到达底部；6) 固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；7) 脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。2.2.6 His-tag Ni 亲和层析法纯化融合蛋白Ni 柱预处理：(1) 用2 M盐酸弧10 mL与树脂打散混合洗涤，静置10 min；(2) 用蒸纟留水洗 10 min； Stripping Buffer 洗 20 min；(3) 用蒸纟留水洗10 min；用0.3 M NaOH洗20 min；(4) 用 Bindin

15、g Buffer 洗 20 min；蒸纟留水洗 10 min；(5) 用 1.5 M NaCl 洗 20 min；用 Binding Buffer 洗 20 min；蒸纟留水洗 10 min;Ni柱再生：一50 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗(7)6 倍柱床体积 Binding Buffer (pH=8.0)平衡注：流速控制在 2-3 mL/min。平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。上样：插A280滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系 统，保存文档并按开始采集。将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min洗脱：上样完后，用B

16、inding Buffer(PH=8.0)淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同 梯度的咪唑(40 mM、80 mM、250 mM )洗脱，在280 nm处进行连续紫外检测，根据微 电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳 检测纯化程度。3 结果与分析3.1 蛋白质层析图谱层析谱图jftgRdldi 13/C&/13 13:11 务氛时间=U3/M719 SQ1L0| - -| - 厂=、一- p-T-T: *!-1f80-O-70-图1 AK经Ni柱纯化的层析图谱由谱图可知：在上样前是用 Binding Buffer 平衡，由于电脑故障极限数据与穿流前半

17、部 分的数据丢失，但不影响穿流液的收集和后面梯度洗脱液的收集。给定的层析图谱中 00:00 00:07 内曲线峰急剧回落，说明此时穿流液中有数种杂蛋白自然流出；峰回落并基本持平 后，分别用 40 mM、80 mM、250 mM 咪唑洗脱，分别出现了洗脱峰值，说明均有蛋白被 洗脱下来，峰面积大小反映了相同体积洗脱收集液中蛋白含量高低。猜想在 00:29 以后继 续用 500 mM 咪唑洗脱还会出现峰。3.2 AK 诱导表达电泳图M. marker1. 250mM 咪唑 2. 80mM 咪唑 3. 40mM 咪唑 4. 穿流由图可知：(1) 第4 道是穿流液，即蛋白上样后的流出来液体，其理论上应该

18、全部都是杂蛋白，但 从实际结果上来看，出现了少量目标蛋白带，同时也有许多杂带，说明目标蛋白大部分结 合到了 Ni 柱上，穿流液中有很多杂蛋白；(2) 第3道是40 mM咪唑洗脱液，目标蛋白带最强，说明大量AK被洗脱下来；(3) 第2道是80 mM咪唑洗脱液，目标蛋白带较强，说明较大量AK被洗脱下来；(4) 第1道是250 mM咪唑洗脱液，其目的是洗去挂在柱子上的所有蛋白质，从SDS-PAGE 上可以看到，目标蛋白带很弱，说明仍有很少的AK被洗脱下来。(5) 目标蛋白的相对分子质量大约在42KD左右，目标条带有叠影现象，表明目标蛋白在提取分离过程中被氧化了。提醒以后的实验中要加抗氧化剂，如 PM

19、SF。4 总结我们以通过IPTG诱导精氨酸激酶基因在E.col菌株中表达，通过His-tag Ni亲和层析 法技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶，为精氨酸激酶结构与功能的研究提供基础。 诱导条件，层析系统的选择对以后的研究有着重要借鉴意义。在本实验中，我了解了目标蛋白质的分离纯化程序主要包括：材料的选择、组织匀浆 和破碎细胞获取粗提取液；蛋白质初步提纯；选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至 完全纯化；目标蛋白的鉴定,SDS-PAGE检测。同时我通过了本实验掌握了从菌体中粗提目标蛋白质技术，蛋白质Ni离子亲和层析技 术，蛋白质的SDS-PAGE电泳分离技术等。在本实验中，我加深了对蛋白纯化

20、方法与技术的认识，并进一步夯实了理论基础和培 养了实验动手能力，更为重要的是通过本实验，我学会了科学的实验思维方法和良好的实 验习惯，纠正了以前在实验过程中所犯过的错误，这为我进一步从事学习深造，进行科学 研究给予了莫大的信心。参考文献1 潘继承 精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究 博士学位论文 北京：清华大学F2004(4):1-22 陆健 等 蛋白质纯化技术及应用 化学工业出版社 第一版 2005 ：22-24.3 汪家政，范明 .蛋白质技术手册.科学出版社.2005：771104 鲍时翔 姚汝华 蛋白质分离纯化与层析技术进展 华南理工大学学报(自然科学版) 1996.12:99-1025

21、 芳秋 赵权 武建国 单祥年 重组人亲环素 A 的表达，纯化及活性测定 微生物学报38(3)，1998：193-1966金哲洙 蔡英姬 抗真菌蛋白质的分离纯化 中国生物制品学杂志 2000.1:30-32致谢本次的综合实验是在导师汪劲松教授的指导下完成的。汪老师在我们进行实验的过程 中一直在关注着我们的实验最新动向，给与我们悉心的指导，这为我们实验的最终完成给 予了莫大的帮助。在此，谨向汪老师表示我深深的敬意和衷心的感谢！吴元耀师兄和实验室的其他学长学姐在本此实验的进行过程中为我们提供了很多宝贵 的指导性意见。在此，向你们表示诚挚的谢意！实验过程中小组成员的团结合作和细致分工也为我们实验的成功进行奠定了良好的基 础！我也向我们有缘能相聚本实验室，共同进行本实验，对小组成员为实验的最后成功所 做的努力表示感谢！