11DNA重组技术基本工具

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1、专题专题1 基因工程基因工程1-1 DNA1-1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1基因工程的概念基因工程的概念基因工程基因工程：指按照人们的愿望指按照人们的愿望,进行严格的设进行严格的设计并通过计并通过体外体外DNA重组重组和和转基因转基因等技术，赋予等技术，赋予生物以新的遗传特性生物以新的遗传特性,创造创造出更出更符合人们需要符合人们需要的的新的新的生物类型生物类型和和生物产品生物产品。由于基因工程是在。由于基因工程是在DNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，因此又叫上进行设计和施工的，因此又叫作作DNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。2基因工程的别名基因工程的

2、别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程原理原理目的目的基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平定向改造生物的遗传性状定向改造生物的遗传性状剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基因工程的概念理解基因工程的概念理解3问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抗虫棉。想一想：需要做哪些关键工作？需要做哪些关键

3、工作？普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉4基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花(无抗虫特性)棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因)与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNADNADNA拼接，导入拼接，导入拼接，导入拼接，导入棉花植株棉花植株(有抗虫特性)表达表达表达表达5基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运

4、载体DNA“DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞6解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体71-1 DNA1-1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀”限制酶限制酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 8识别双链识别双链识别双链识别双链D

5、NA DNA DNA DNA 分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物分离纯化出来主要从原核生物分离纯化出来主要从原核生物分离纯化出来主要从原核生物分离纯化出来40004000种。种。1、来源：、来源：2、种类：、种类：3、作用：、作用：5、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形

6、成两种末端形成两种末端一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端平末端平末端4 4、切割方式：、切割方式：错位切和平切错位切和平切9ATGCATGC限制酶切割磷酸二酯键限制酶切割磷酸二酯键10 1 1、大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)EcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开形成之间切开形成黏性黏性末端。末端。2 2、SmaSma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，序列，并在并在C C和和G G之间切割形成之间切割形成平平末端末端 。常见的两种限制酶12Sma平末端平末端平末端平末端

7、平末端平末端平末端平末端13EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端14什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切中心轴线两侧切开时开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。15什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处切中心轴线处切开时开时，切开的，切开的DNADNA两条单链的切口，是平两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫整的，这样的切口叫平末端平末端。

8、16寻根问底寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限限制酶制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原限制酶在原核生物中主要起到切割外源核生物中主要起到切割外源

9、DNADNA、使之失效使之失效，从而达到从而达到保护自身保护自身的目的。的目的。17为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其酶的细胞，其DNADNA分子中分子中或者或者不具备不具备这种这种限制酶的限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者或者通过甲基化通过甲基化酶酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被切被切断，并且可以防止外

10、源断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。寻根问底寻根问底181 1、要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口、要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。2 2、如果把两种来源不同的、如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切用同一种限制酶来切割，会怎样呢？割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。3 3、是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真、是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就

11、真的合成重组的的合成重组的DNADNA分子了分子了?实际还不够实际还不够,还需要还需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。思考与探究思考与探究19ATGCATGC连接酶连接连接酶连接磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用过程：连接酶的作用过程：二、分子缝合针二、分子缝合针DNA连接酶连接酶20作用部位：作用部位：是磷酸二酯键是磷酸二酯键是磷酸二酯键是磷酸二酯键（扶手）（扶手）不是氢键不是氢键不是氢键不是氢键（梯子）（梯子）DNA连接酶连接酶将两条将两条DNA链连接起来的酶。链连接起来的酶。21类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接

12、酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别连接酶种类：连接酶种类：22两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙

13、缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，单链缺口，但不能连接单链但不能连接单链DNADNA！23DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用24A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用25DNA连接酶连接酶

14、DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将单个核苷酸只能将单个核苷酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形成磷酸片段上，形成磷酸二酯键二酯键在两个在两个DNADNA片片段之间形成磷段之间形成磷酸二酯键酸二酯键261 1、外源基因、外源基因(如抗虫基因如抗虫基因)怎样

15、才能导入受体细胞怎样才能导入受体细胞(如如 棉花细胞棉花细胞)？“分子运输车分子运输车”载体。载体。2 2、载体的作用有哪些？、载体的作用有哪些？作用一：作用一：作为运载工具，将外源基因作为运载工具，将外源基因(抗虫基因抗虫基因)转移到转移到受体细胞受体细胞(棉花细胞棉花细胞)中去。中去。作用二：作用二：利用载体在受体细胞利用载体在受体细胞(棉花细胞棉花细胞)内，对外源基内，对外源基因因(抗虫基因抗虫基因)进行大量复制。进行大量复制。（随载体的复制而复制）三、基因进入受体细胞的载体27“分子运输车分子运输车”载体载体常用的载体主要有两类：常用的载体主要有两类：1 1）细菌细胞质的质粒）细菌细胞

16、质的质粒 2 2）噬菌体或某些动植物病毒）噬菌体或某些动植物病毒原理：病毒，细菌等的侵染性。原理：病毒，细菌等的侵染性。28认识常用的载体认识常用的载体质粒 质粒主要存在于细菌和酵母菌体内。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNADNADNADNA分子。29质粒的特点：质粒的特点：1、细菌染色体外双链环状、细菌染色体外双链环状DNA分子分子2、能自我复制并在受体细胞中、能自我复制并在受体细胞中稳定存在稳定存在3、有一个或多个限制酶切点、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标记基因、有特殊的遗传标记基因30议一议议一议2 2、能否用、能否用、能否用

17、、能否用SARSSARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？3 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？4 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？5 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制

18、，将怎样？将怎样？将怎样？将怎样？1 1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链双链双链双链DNADNADNADNA不能不能不能不能不能进行不能进行不能进行不能进行DNADNADNADNA的重组的重组的重组的重组载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失311 1）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。2 2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基

19、）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。因连接。3 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。）具有某些标记基因，便于进行筛选。4 4）必需是安全的，不会对受体细胞有害。）必需是安全的，不会对受体细胞有害。5 5）大小应适合，便于提取和操作）大小应适合，便于提取和操作 作为运载体的必要条件注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的32小结：基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNADNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工具工具具备的具备的条件条件结构简单结构简单,大小适中大小适中能在宿主细胞中自能在宿主细胞中自我复制并稳定存在我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具一个多个限制酶切位点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒33