甲基化特异性PCR原理及引物设计

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1、MSP 原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。引物设计原则标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)，除了标 准PCR的一些参数外，“MethPrimer应用3端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱 基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引 物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”，

2、所以“MethPrimer中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C区域作为 源序列，设计引物。对于BSP，引物设计的原则1：为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA, 引物不应含有CpG位点;引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。对于MSP需要设计2对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对 是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲 基化的DNA根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的 原则为了最大限度的区分甲基化与非甲基化

3、,引物的3端至少包含1个CpG位点,我们可 以自己设定CpG的“C”距3末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的 最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。 甲基化引物和非甲基化引物序列3端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同 的CpG位点退火,PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非 甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制，由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”，导致GC含量降低，从而引起Tm降低。2套引物应有相近的Tm 值

4、，“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5C,这种限制可使2个PCR反应在同一 PCR仪中进行。问题解决参考 引物设计步骤（以CLEC14A基因为例）:1. 找到目标基因的启动子区（promoter）序列首先打开 ensembl 页面：http:/www.ensembl.org/index.htmlHumsn X如图在搜索框第一个物种选择Human，基因填入要研究的基因名，点击GopOnly searching Human CLECUAq391 results match CLEC14A when restricted toDfHjfQMEGM - *CLEC14AGmnBE

5、H SGOHWOI7043 5 14.第 254103-3S256 369:-1Otype lectin domain conta ring 14A Soure:HGNC Symbol:Acc:HGNC: 19332C-r/PE LECTIN DOMAIN FAMILY 14, MEMBER A; GLECUA *616945 (MIM gene record;description: C-TYPE LECTIN DOMAIN FAMILY 14, MEMBER A;is an external referencematched LoGene zNSGUOOU0176435Vari a ntt

6、mbM PhD notypa 占 Location External Refs. Regulation * Orihologues - Cene tree搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation，点击它(这里面主要是基因调控区域的信息）打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter，长度在2000bp左右。-U ETErl5R000002TJ1i53Etie冷汙忖民透山日QW BuidgCTF Binding Site14 3T5B14Q1T502?QO132HShQife 田EtJSR0fl00a2741&9口cpjMaryCTCF Binding Srte14 3

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8、咖小吋劭忖14 3T502660-3TEQ351996dShow E)Buidg然后点击最右侧Show旁边的+，出现的就是启动子区的序列了H襄目AJ JIQZI： EGTJLGT DZTC I： CTEAACTOSTITT匚匚 CT.匚CTTH： EZCAEKT1： SZ3UUU.TJLM： I： DZ-ZM DJJbC ETC KCAZCTCQ24： C CJJ2阳関EVTW冋応陆GGdmn 琲皿工 6THKTfiTg?ii!i6HC&xcT：55i：jCi!iGMmwim!iAGAC!nm5aMFUiZcciGIiGACGl*3AKTi；GCCrD3IGGjrM&CK-：TIICTi：*G

9、AjGTTGCrrXAAjCTi；将序列信息复制，然后就可以进入下一步2. MSP 引物设计打开MSP在线引物设计工具页面：http:/www.urogene.org/methprimer/或者他们新开发的2.0 页面 http:/www.urogene.org/methprimer2/进入后我们选择第一个就好iMGlhPnnrer 创 I 凶占 you to design primers Br no si bisulilie cotfirsion based PCR primers and 1o predict CpG Islands on 削 input sequence It also

10、gllcyou to seardhfcr predesigned primers fcir him ami and eq 馬吕 genes. De*圏n priipt/s on your irnpuit stciMric*, Pasta an ORIGINAL Df4A 軸monc企 Input 抽QuerK dOGsrft HQbd wrtuaJ biulfito corwarsion (e g. convert C to T 卜 Try th 5 合amme 迪m前w* Sarc!h for prcd&5frgin-&d prirnrs for Human anrdl mous g盘n后占

11、：Type in the Do&: below gene symbol. AfSeq ID to seardhiffor pre- desgned pnmers for protein coding genes. incRNAs ard mlRNAs (e.g n ESRl JNM_OODO4 mir-l-1, FWNDA.).* CpG islland pTn; You can also use the prosjam to predict CpG islands in 3 sequence.GaZCGCCNOTGCOt&CCTiCGOHAmKTiimQCTiHimkSCAaKiHra： 戍

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13、cto：i谢 |?曲药10处TC陋TEMTCCAAAH瞻阴TAATT尉丁 TTA瞅寃尉心耳伽U弘帖JWMAAATG関GAG蔽卿航孔畑KC0CTT1：站AAAAAGAAA山保砂JickMSP priirnersI Pick Met?v ght MSP primniers.|击閃网痢曲藹皿越CTiZTGMTi播C70农妙琢:防曲：d E 園应祐T祐BE芮肪 ACTGWCJIAEMMCrTCTGMATftACnMKHWmC CTW 龙肪屮:KTAC 白茁 HACCTTOWMECWK：阳茁GOCC打 TUKdCGBKrX TCKTn；TTCCKKCKX；IGATKX；TGA；TTCZCOTAGrKMA

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15、Dlatdid fazelkdrXl 筑j(TIsdsnd EfdGG% pSTEITlQE価曲Ulshd 145626073550.00.0bland 251277212B35D.D0.0Island Jl创2儡g158050.D0.6新生成的页面中会有CpG岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。 将页面继续下拉即出现设计好的引物啦Primer Design Re&ultsPrirnprniirnpSeouence (S-Si”LenEndDeaen曰可Ie CoGH也 Setf旳航 Im GCS 沁恤Sctw-MF1GTTGTTGGGAGGGTfiAGC2Q414433N

16、D2420Q2M冏出sa.D7545MR123543521Nd29申：llaMe 34.69046FTaducI sizePair startPai旦ri Gag吕匚:cirn白nyCamo endImTm diirSccrm130J1454365001OT0572.4133PriEErryiEmSeouence (5础 jfLenEodDeaenEfmlmGs Setf mm M mnd Tn GCS 別訪ihtvUF1GTTGrTSQAAGAGGTAAEgTT23m已笑No242002D0BS.e 43.SB44 1IJR1CTT嚴 CAMGCWuWiCMAA23543521Mo2窘申：llae 215.1re43Fmi或irtPairendAGf Coed JinvCoro p-ndTmTm ditfSctb130J14543E5D020065.13.E13flUPr我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP需要两对引物，分别针对被甲基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，done.当然如果第一对引物不work，建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！