Western(试剂配制和操作步骤)

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1、Western （试剂配制和操作步骤）试 剂 配 制 ： （ 一 ） 母 液 （ 二 ） 使 用 液 操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三） SDS PAGE 电泳（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影， 定影 （七）凝胶图象分析这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并 以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western 使 用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位 发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂 混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20x20c

2、m）,X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L TrisHClTris （MW121.14） 30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定 容至250ml，咼温灭菌后室温下保存。PH HCl7.4 约 17ml7.5 约 16m7.6 约 15ml8.0约 10ml10SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50C水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后, 仍可使用。10%过硫酸胺(AP)过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4C保存，保存时间为1周。15mol/L TrisHCI (

3、pH8.8)Tris (MW121.14)45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml，高温 灭菌后室温下保存。0.5mol/L TrisHCI (pH68)15.14gTris (MW121.14)超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml，高温 灭菌后室温下保存。20Tween20Tween2020ml蒸馏水至100ml混匀后4C保存。(二)使用液单去污剂裂解液(50mmol/L TrisHCI pH8.0, 150mmol/L NaCI, 1 %TritonX100, 100?g/ml PMSF)：1mol/L

4、 TrisHCI(pH8.0)2.5mlNaCl0.438gTritonX1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4C保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100?g/ml（0.87ml 裂解液加入 1.74mg/ml PMSF50“l ）。0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO41.44g（Na2HPO4 .H2O 1.56gNa2HPO4 .12H2O 3.58g）KH2PO40.2g蒸馏水至1000mlG250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250：100mg95乙醇：50ml磷酸：100ml蒸馏水至1000ml配制时，先

5、用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后， 用滤纸过滤，4C保存。0.15 mol/L NaClNaCl（MW58.44） 0.877g蒸馏水至 100 ml 高温灭菌后，室温保存100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，一20C保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/LNaCI进行100倍稀释成1mg/ml，20C保存。10分离胶和 5浓缩校10分离胶（两块胶， 10ml）5浓缩胶（两块胶， 5ml）10%AP （过硫酸胺）TEMED加 TEMED 后，立即混匀即可灌胶。还原型5XSDS上样缓冲液（0.25moI/L T

6、ris?HCI pH6.8, 0.5moI/L 二硫叔糖醇，10% SDS,0.5溴酚蓝， 50甘油）0.5 moI/L TrisHCl (pH6.8)2.5mI二硫叔糖醇（DTT,MW154.5)0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4C保存。电泳液缓冲液（25mmol/L Tris, 0.25mol/L 甘氨酸，0.1% SDS）Tris(MW121.14)3.03g甘氨酸（MW75.07）18.77gSDS1g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L 甘氨酸，0.

7、037% SDS，20%甲醇）半干转 1X 电转液：甘氨酸（MW75.07）2.9gTris(MW121.14)5.8gSDS0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次。湿转1X电转液：甘氨酸（MW75.07）11.25gTris(MW121.14)2.375g甲醇蒸馏水至蒸馏水至200ml1000ml溶解后4C保存，次溶液可重复使用35次。TBS缓冲液(lOOmmol/ L Tris?HCI pH7.5,150mmol/L NaCI)1 mol/ LTrisHCl (pH7.5) 10ml8.8gNaCl1OOOmlTBST缓冲液（含0.05%Tw

8、een20的TBS缓冲液 2OTween2O1.65mlTBS7OOml混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5gTBST1OOml溶解后4C保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性 使用。洗脱抗体缓冲液(100mmol/L 2-Mercaptoethanol, 2%SDS, 62.5m mol/L TrisHCI pH6.8)14.4 mol/L 2- Mercaptoethano 1(0-巯基乙醇)700 l (通风厨里加)SDS2g0.5mol/L TrisHCI(pH6.8)12.5ml超纯水至100ml配制时，

9、在通风厨内进行。4C保存。可重复使用1次。10X 丽春红染液 丽春红 S 2g 三氯乙酸30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释1 0倍显影液：H2O365mlA125mlB5.1mlC4.875ml4C保存。定影液H2O 363.5mlA 125mlB 11.5.ml4C保存。抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml化学发光试剂购自北京中山公司，为 Santa Cruz 产品，分 A 和 B 两种试剂。操作步骤蛋白样品制备SDS-PAGEjII转膜I封闭一抗二抗I洗膜I显色或化学发光显影（一）蛋白样品制备（1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行）收

10、集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min,裂解过程中 要经常弹一弹以使细胞充分裂解。在4C下12000rpm离心5min, 取上清分装于0.5ml离心管中并置于一20C保存。（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从一20 C取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、取适量的蛋白标准稀释至终浓度0.5 mg/ml ；按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（样品和标准品均设置复孔）3、按A:B=50:1配制适量的BCA工作液，混匀，室温24h内稳定。各孔加入200ulBCA工作液37 30min测定

11、A562，求平均值，绘制标准曲线。编号123456780.5mg/ml BSA(ul)01248121620PBS(ul)2019181612840得到标准BSA 浓度(ugul)00.0250.050.10.20.30.40.5( 三 ) SDS PAGE 电 泳电泳时间一般为23h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳至 溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-40kD配制10%的过硫酸铵配制12%分离胶（5ml）待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停

12、止灌胶，加入蒸馏水 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 插上梳子，聚合20分钟 注意：灌胶过程中避免产生气泡四）转膜-阴极白色夹板（正极o.4阳极d膜旌纸飙垫片300mA 1h.o半干式转膜5SmA/ffi 1h-,o,膜（左上角标记训T黑色夹板（负极醍胶（MarkertA）转膜详细操作过程：（1）转一张膜需准备6张7.08.0cm的滤纸和1张7.38.6cm的 PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜 PVDF膜则在MOH中浸泡10min以上后转入TBS液中平衡。将 滤纸浸入TBS液中润湿。（2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、

13、一 支玻棒、 滤纸和浸过 的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻 棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不 能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫 子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边 上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时 一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓 缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。轻轻划开分离胶与玻板左右 两边的接触面，不然取胶时容易弄破。小心剥下分离胶盖于滤纸上， 用手调整使其与滤纸对齐，

14、轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要 盖满整个胶并除气泡（膜盖下后不可再移动）。在膜上盖 3 张滤纸并 除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作 在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触， 接触后会发生短路。注意膜在正极+ 侧，分离胶在负极-侧。标记正反 面。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面 对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。湿转一 般用400mA转移1:30 h,根据分子量大小调整。转移方法的选择：半干转用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法；

15、适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子 大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h湿转将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法；适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h（五）免疫反应（1）封闭：转完后将膜用去离子水或TBST从下向上浸湿后吸干，将膜在含 5%脱脂奶粉的 TBST（10mM Tris-HCI, pH7.5,150mM NaCI,0.05%Tween-20）的平皿中，室温下封闭1h。（2）一抗孵育：将一抗用一抗稀释液或TBST稀释至适当浓度（在15ml离心 管中）；

16、撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸 湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出 膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜 四角以赶出残留气泡；室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱 色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。（本实验 室用封膜机将膜蛋白密封）（3）二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后， 用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一 次，10min，进行化学发光反应。（六）化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在EP管中等体积混合；1 min后，将此混

17、合 液充分涂抹在膜蛋白面上；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽 残液，包好，放入X-光片夹中。（2）在暗室中，将1x显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下 取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）； 打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关 上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般 为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光 完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待 出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min （20 25C，温度过低时（低于16C ）需适当延长显影时间；显

18、影结束 后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min,以胶 片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不 要划伤胶片，否则会对结果产生影响。（七）凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和 净光密度值。Hr二I匕曰高冃景A信号弱或者无信号非特异性条带A信号下降太快高背景原因解决办法11 r1r1蛋白浓度过高降底抗体落度膜的污染使甲干净谡子；戴手套操作#换一张新膜用足餾的液 悴，膜始终保持湿润孵育时便用脱色摇床；輕免膜 重蓋 互相磴盖；小心操作勿毁损膜漂洗不完全増加漂洗时间和缓冲液体

19、积封囲菠不适合比较尝试不同封囲液1封囲不完全延长封囲时间（可茁C过夜）抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度f曝光时间过长缩愆曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液S加加加加加8川彩彩彩彩彩彩彩彩彩彩彩彩彩彩広信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量蛋白质在储存过程中降解重新制备样品转膜不完全转膜后确定转膜效率、保证胶与膜 充分结合、保证电极正确装配、控制转 膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及 时间。膜的错误选择选择合适膜的孔径：22kD 蛋白选用0.45卩m孔径22kD 蛋白选用0.22卩m孔径抗原被封闭优化封闭液、缩短封闭时间、减小液遮蔽封闭液中蛋白浓度。抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（

20、避免反复冻融）。曝光时间过短延长曝光时间底物延长底物孵育时间原因解决办法底物太灵敏选择合适的底物交叉反应选择单克隆抗体抗原浓度太高降低抗原浓度抗体浓度太高降低抗体浓度曝光时间太长减少曝光时间非特异性条带其他现象原因解决办法荧光萃灭快二抗浓度太高膜干燥降低二抗浓度保证膜的湿润度条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡转膜时赶尽气泡条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物反影（白色条带、黑色背景）HRP浓度过高降低二抗浓度散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀Western荧光检测取决二抗原含量转膜效率-抗融感度二抗敏感度底物敏感度显塞、定寰效率推荐对照设置内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH阳性对照检测一抗是否正常阴性对照检测一抗特异性空白对照 不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应F全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家全球抗体搜索引擎 () 成为继基因数据 库、蛋白数据库之后出现的网上公共数据资源库新成员。这项计划通 过建立多达 40 多万种的精准抗体，整合了全球 80 多家研究机构和抗 体供应商的抗体数据，涵盖200多物种，包括Abcom、AssaybioTech、 Abnova 等一线知名品牌