微生物分类与鉴定

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1、第九章微生物的分类和鉴定 地 球 上 的 物 种 估 计 大 约 有 150万 ，其 中 微 生 物 超 过 10万 种 ， 而 且 其 数 目 还在 不 断 增 加 。 生 物 分 类 的 二 种 基 本 原 则 ：a） 根 据 表 型 (phenetic)特 征 的 相 似 程 度 分 群 归 类 ， 这 种 表 型 分 类 重 在 应 用 ， 不 涉 及 生 物 进 化 或 不 以 反 映 生 物 亲 缘 关 系 为 目 标 。b） 按 照 生 物 系 统 发 育 相 关 性 水 平 来 分 群 归 类 ， 其 目 标 是 探 寻 各 种 生 物 之 间 的 进 化 关 系 ， 建 立

2、反 映 生 物 系 统 发 育 的 分 类 系 统 。从 进 化 论 诞 生 以 来 ， 已 经 成 生 物 学 家 普 遍 接 受 的 分 类 原 则 生 物 系 统 学 (systematics) 章 节 内 容第 一 节 通 用 分 类 单 元系 统 分 类 单 元 、 种 的 概 念 、 学 名 、 亚 种第 二 节 微 生 物 在 生 物 界 的 地 位生 物 界 级 分 类 学 说 、 五 界 系 统 、 三 域 学 说 及 其 发 展 、 微 生 物 的 进 化第 三 节 各 大 类 微 生 物 的 分 类 系 统 纲 要原 核 微 生 物 分 类 系 统 纲 要 、 真 菌 的

3、 分 类 系 统 纲 要第 四 节 微 生 物 的 鉴 定经 典 分 类 鉴 定 方 法 、 现 代 分 类 鉴 定 方 法 。 第 一 节 通 用 分 类 单 元 分 类 是 认 识 客 观 事 物 的 一 种 基 本 方 法 。 我 们要 认 识 、 研 究 和 利 用 各 种 微 生 物 资 源 也 必 须 对 它们 进 行 分 类 。分 类 学 涉 及 三 个 相 互 依 存 又 有 区 别 的 组 成 部 分 ：鉴 定分 类 、 命 名 、 命 名 (nomenclature)：鉴 定 (identification或 determination)：分 类 (classificati

4、on)： 一 、 分 类 单 元 及 其 等 级界 （ K ingdom） (Regnum)门 （ Phylum） (Phylum)纲 （ Class） (Classis)目 （ Order） (Ordo)科 （ Family） (Familia)属 （ Genus） (Genus)种 （ Species） (Species) 根 据 Carl Woese的理 论 ， 现 在 还 在 界之 上 使 用 域 (domain) （ 把 全 部 生 物 先 分 为古 生 菌 域 、 细 菌 域 和真 核 生 物 域 ，域 下 面 再 分 界 。 ） 常 用 的 细 菌 分 类 学 术 语 ：1） 培

5、 养 物 (culture)：2） 菌 株 (strain)： 从 自 然 界 中 分 离 得 到 的 任 何 一 种 微 生 物 的 纯培 养 物 都 可 以 称 为 微 生 物 的 一 个 菌 株 ； 用 实 验 方 法 (如 通 过 诱 变 ) 所 获 得 的 某 一 菌 株 的 变 异 型 ， 也 可 以 称 为 一 个 新 的 菌 株 ， 以 便与 原 来 的 菌 株 相 区 别 。 Bacillus subtilis ASI.398Bacillus subtilis BF7658 生 产 蛋 白 酶生 产 淀 粉 酶 3） 型 (form或 type)： 常 指 亚 种 以 下 的

6、 细 分 。 当 同 种 或 同亚 种 不 同 菌 株 之 间 的 性 状 差 异 ， 不 足 以 分 为 新 的 亚 种 时 ， 可 以细 分 为 不 同 的 型 。4） 种 （ species） ： 微 生 物 的 种 ： 具 有 高 度 特 征 相 似 性 的 菌 株 群 ， 这 个 菌 株 群 与 其 他 类 群 的 菌 株 有 很 明 显 的 区 别 。菌 株 与 型 的 区 别 ：菌 株 之 间 不 存 在 鉴 别 性 特 征 的 差 异 ， 命 名 不 同 的 菌 株 无 需 分 类 学依 据 ，不 同 型 的 细 菌 之 间 存 在 鉴 别 性 特 征 的 差 异 ， 命 名

7、或 鉴 定 不 同 的 型必 需 有 分 类 学 依 据 。 二 、 微 生 物 的 命 名双 名 法 ， 由 二 个 拉 丁 字 或 希 腊 字 或 拉 丁 化 了 的 其 它 文 字 组 成 ，一 般 用 斜 体 表 示属 名 在 前 ， 一 般 用 拉 丁 字 名 词 表 示 ， 字 首 字 母 大 写种 名 在 后 ， 常 用 拉 丁 文 形 容 词 表 示 ， 全 部 小 写若 所 分 离 的 菌 株 只 鉴 定 到 属 ， 而 未 鉴 定 到 种 ， 可 用 sp来 表 示 ，例 如 Bacillus sp 由 于 细 菌 分 类 单 元 的 划 分 缺 乏 一 个 易 于 操 作

8、 的 统 一 标 准 ，为 了 减 少 因 采 用 不 同 标 准 界 定 分 类 单 元 所 造 成 的 混 乱 ，细 菌 系 统 分 类 也 像 其 他 生 物 分 类 一 样 采 用 “ 模 式 概 念 ”种 和 亚 种 指 定 模 式 菌 株 （ type strain） ；亚 属 和 属 指 定 模 式 种 （ type species） ；属 以 上 至 目 级 分 类 单 元 指 定 模 式 属 （ type genus） ；模 式 菌 株 应 送 交 菌 种 保 藏 机 构 保 藏 ， 以 便 备 查 考 和 索 取 。 第 二 节 微 生 物 在 生 物 界 的 地 位一 、

9、 生 物 的 界 级 分 类 学 说两 界 系 统三 界 系 统四 界 系 统五 界 系 统六 界 系 统 利 用 16SrRNA建 立 分 子 进 化 树 的 美 国 科 学 家 Carl Woese 二 、 三 域 学 说 及 其 发 展 三 、 rRNA和 系 统 发 育 树1. rRNA的 顺 序 和 进 化培 养 微 生 物 提 取 并 纯 化 rRNArRNA序 列 测 定 分 析 比 较微 生 物 之 间 的 系 统 发 育 关 系 2. 特 征 序 列 或 序 列 印 记 （ signature sequence）通 过 对 r RNA全 序 列 资 料 的 分 析 比 较 （

10、 特 别 是采 用 计 算 机 ） 发 现 的 在 不 同 种 群 水 平 上 的 特异 特 征 性 寡 核 苷 酸 序 列 ， 或 在 某 些 特 定 的 序列 位 点 上 出 现 的 单 碱 基 印 记 。特 征 序 列 有 助 于 迅 速 确 定 某 种 微 生 物 的分 类 归 属 ， 或 建 立 新 的 分 类 单 位 。 3. 系 统 发 育 树 (phylogenetic tree) 通 过 比 较 生 物 大 分 子 序 列 差 异 的 数 值 构建 的 系 统 树 称 为 分 子 系 统 树 ， 其 特 点 是 用 一种 树 状 分 枝 的 图 型 来 概 括 各 种 (类

11、)生 物 之 间的 亲 缘 关 系 。 16 S r RNA系 统 发 育 树 1） 生 命 的 第 三 种 形 式 古 生 菌动 物 界 和 植 物 界 原 核 生 物 和 真 核 生 物 （ 20世 纪 60年 代 ）古 细 菌 (archaebacteria)真 细 菌 (Eubacteria)真 核 生 物 (Eukaryotes)（ 1977， Carl Woese）Bacteria(细 菌 )Archaea(古 生 菌 )Eukarya(真 核 生 物 )（ 1990， Carl Woese）原 核 生 物界 （ K ingdom）域 （ domain） 2） 建 立 16 S r

12、 RNA系 统 发 育 树 的 意 义a） 使 生 物 进 化 的 研 究 范 围 真 正 覆 盖 所 有 生 物 类 群 ；传 统 生 物 进 化 研 究 主 要 基 于 复 杂 的 形 态 学 和 化 石 记 载 ， 因 此 多 限于 研 究 后 生 生 物 ， 而 后 者 仅 占 整 个 生 物 进 化 历 程 的 1/5 b） 提 出 了 一 种 全 新 的 正 确 衡 量 生 物 间 系 统 发 育 关 系 的 方 法 ；c） 对 探 索 生 命 起 源 及 原 始 生 命 的 发 育 进 程 提 供 了 线 索 和 理 论 依 据 ； d） 突 破 了 细 菌 分 类 仅 靠 形

13、态 学 和 生 理 生 化 特 性 的 限 制 ， 建 立 了 全 新 的 分 类 理 论 ； e） 为 微 生 物 生 物 多 样 性 和 微 生 物 生 态 学 研 究 建 立 了 全 新 的 研 究 理 论 和 研 究 方 法 ， 特 别 是 不 经 培 养 直 接 对 生 态 环 境 中 的 微 生 物 进 行 研 究 。 不 可 培 养 微 生 物 （ uncultured microorganisms） 从 环 境 中 直 接 分 离 并 克 隆 rRNA并 分 析 其 序 列和 在 分 子 进 化 树 上 的 位 置 等 方 法 而 发 现 的 的 目 前 尚不 能 在 人 工

14、条 件 下 获 得 培 养 的 微 生 物 。不 可 培 养 的 微 生 物 与 生 物 多 样 性 3） 三 （ 界 )域 生 物 的 主 要 特 征三 界 理 论 虽 然 是 根 据 16SrRNA序 列 的 比较 提 出 的 ， 但 其 他 特 征 的 比 较 研 究 结 果也 在 一 定 程 度 上 支 持 了 三 界 生 物 的 划 分 。 随 着 越 来 越 多 的 微 生 物 的 全 基 因 组 序 列 的 测 定 ，人 们 发 现 生 物 在 进 化 中 存 在 着 非 常 广 泛 的 水 平 基 因转 移 现 象 ， 很 多 科 学 家 都 认 为 不 能 仅 靠 对 16S

15、rRNA的 序 列 比 较 来 确 定 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 ， 还 必 须 借助 各 种 信 息 对 这 个 进 化 树 进 行 改 进 。Carl Woose的 rRNA进 化 树 完 美 无 缺 ？ 一 项 新 的 研 究 指 出 ， 在 我 们 体 内 的 每 个 细 胞 中 有 40 个 左 右 的 细 菌 基 因 ， 这 个 由 细 菌 到 人 类 寄 主 的所 谓 的 “ 横 向 转 移 (lateral transfer)”给 进 化 生 物 学带 来 了 极 大 的 问 题 。 2001年 5月 18日 美 国 科 学 周 刊 292卷 第 5520期人 类 基

16、 因 组 中 的 细 菌 基 因 ？ 第 三 节 各 大 类 微 生 物 的 分 类 系 统 纲 要二 、 真 菌 （ 菌 物 ） 分 类 系 统 简 介一 、 原 核 微 生 物 分 类 系 统 一 、 原 核 微 生 物 分 类 系 统（ 一 ） 伯 杰 氏 鉴 定 细 菌 学 手 册 (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology)美 国 宾 夕 法 尼 亚 大 学 的 细 菌 学 教 授 伯 杰 (D.Bergey)(1860-1937)伯 杰 氏 手 册 : 是 目 前 进 行 细 菌 分 类 、 鉴 定 的 最 重 要 参 考 书 ，其

17、特 点 是 描 述 非 常 详 细 ， 包 括 对 细 菌 各 个 属 种 的 特 征 及 进 行鉴 定 所 需 做 的 实 验 的 具 体 方 法 。 1923年 以 来 已 出 至 第 九 版 (1994)；第 九 版 伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 设 立 35个 群 ， 将 古 细 菌 部改 编 为 5个 群 ， 全 书 描 写 了 约 500个 属 。划 分 为 四 大 类 ： 第 一 类 具 细 胞 壁 的 革 兰 氏 阴 性 真 细 菌 第 二 类 具 细 胞 壁 的 革 兰 氏 阳 性 真 细 菌 第 三 类 无 细 胞 壁 的 真 细 菌 第 四 类 古 细 菌 伯 杰

18、氏 细 菌 鉴 定 手 册 （ 二 ） 伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)第 一 版 1984年 问 世 ， 至 1989年 出 齐 ， 共 4卷 。第 二 版 由 George Garrity主 编 分 为 5卷 ， 将 从 2000年 起陆 续 出 版 。 这 一 版 纳 入 了 研 究 核 糖 体 RNA测 序 所 产 生的 许 发 育 )分 类 系 统 。 伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册 第 二 版 分 古 细 菌 和 真 细 菌 2个 界 ， 下 设 18门 、27纲 、 73目 、 1

19、86科 ， 包 括 870余 属 和4900多 个 种 。 界 ： 古 细 菌 (Archaeota) 部 1： 热 变 形 菌 、 硫 化 叶 菌 、 嗜 压 菌 (Thermoprotei、Sulfolobi、 Barophiles， 21属 36种 ) 部 2： 产 甲 烷 菌 (Methanogens， 21属 97种 ) 部 3： 盐 杆 菌 (Halobacteria， 14属 50种 ) 部 4： 热 原 体 (Thermoplasma， 2属 4种 ) 部 5： 热 球 菌 (Thermococci， 5属 19种 ) 界：真细菌(Bacteria)部 6： 产 液 菌 (Aq

20、uifex)和 相 关 细 菌 (3属 5种 )部 7： 栖 热 袍 菌 (Thermotoga)和 Geotogas， 9属 22种 )部 8： 异 常 球 菌 (Deinococci， 1属 8种 ) 部 9： 栖 热 菌 和 归 属 不 明 的 属 (Thermi， 10属 21种 ) 部 10： 产 菌 黄 (Chrysiongenes,1属 2种 ) 部 11： 绿 屈 挠 菌 和 滑 柱 菌 (Chloroflexi和Herpetosiphons， 5属 11种 ) 界：真细菌(Bacteria)部12：热微菌(Thermomicrobia,1属2种) 部13：蓝细菌(Cyanob

21、acteria，69属73种) 部14：绿菌(Chlorobia，6属17种) 部15：-变形细菌(-Proteobacteria，117属392种) 部16：-变形细菌(-Proteobacteria，53属204种) 界：真细菌(Bacteria)部 17： -变 形 细 菌 ( -Proteobacteria， 150属 854种 ) 部 18： -变 形 细 菌 ( -Proteobacteria， 39属 128种 )部 19： -变 形 细 菌 ( -Proteobacteria， 6属 56种 ) 部 20： 梭 菌 (Clostridia)和 相 关 细 菌 (73属 403种

22、 ) 部 21： 柔 膜 菌 (Mollicutes， 10属 191种 ) 部 22： 芽 胞 杆 菌 和 乳 杆 菌 (Bacilli和 Lactobacilli， 55属 535种 ) 界：真细菌(Bacteria)部 23： 放 线 细 菌 (Actinobacteria， 117属 ， 1371种 ) 部 24： 浮 霉 状 菌 和 衣 原 体 (Planctomycetes和Chlamydia， 5属 14种 ) 部 26： 丝 状 杆 菌 (Fibrobacters， 3属 5种 ) 部 27： 拟 杆 菌 (Bacteroides， 20属 130种 ) 界：真细菌(Bacte

23、ria)部 28： 黄 杆 菌 (Flavobacteria， 15属 72种 )部 29： 鞘 氨 醇 杆 菌 (Sphingobacteria， 22属 76训 )部 30： 梭 形 菌 (Fusoforms， 6属 29种 ) 部 31： 疣 微 菌 和 相 关 细 菌 (Verrucomicrobium，2属 5种 ) 二 真 菌 （ 菌 物 ） 分 类 系 统 简 介Ainsworth et al(1973) V.Arx (1981) 真 菌 字 典 （ 1983）K endrick (1992) 真 菌 字 典 （ 1995）Alexopoulos&Mins(1996) 黏 菌 门

24、 ： 黏 菌 纲 根 肿 菌 纲真 菌 门 ：鞭 毛 菌 亚 门 ： 壶 菌 纲 丝 壶 菌 纲 卵 菌 纲接 合 菌 亚 门 ： 接 合 菌 纲 毛 菌 纲子 囊 菌 亚 门 ： 半 子 囊 菌 纲 不 整 囊 菌 纲 核 菌 纲 盘 菌 纲 腔 菌 纲 虫 囊 菌 纲担 子 菌 亚 门 ： 冬 孢 菌 纲 层 菌 纲 腹 菌 纲半 知 菌 亚 门 ： 芽 孢 纲 丝 孢 纲 腔 孢 纲 真 菌 界（ 1995） 第 四 节 微 生 物 分 类 鉴 定 的 方 法生 物 分 类 的 传 统 指 标分 子 生 物 学 指 标 微 型 、 简 便 、 快 速 或 自 动 化 鉴 定 技 术细 菌

25、 的 数 值 分 类 形 态 学 特 征生 理 学 特 征生 态 学 特 征 从 不 同 层 次 ， 用 不 同 学 科 的 技 术 方 法 来 研 究 和 比 较不 同 微 生 物 的 细 胞 、 细 胞 组 分 或 代 谢 产 物 ， 从 中 发 现 的反 映 微 生 物 类 群 特 征 的 资 料 。生 物 分 类 的 传 统 指 标 一 、 形 态 学 特 征培 养 特 征 、 运 动 性 、特 殊 的 细 胞 结 构 、细 胞 形 态 及 其 染 色 特 性 、 等 等微 生 物 分 类 和 鉴 定 的 重 要 依 据 之 一 ：a） 易 于 观 察 和 比 较 ， 尤 其 是 真

26、核 微 生 物 和 具 有 特 殊 形 态 结 构 的 细 菌 ；b） 许 多 形 态 学 特 征 依 赖 于 多 基 因 的 表 达 ， 具 有 相 对 的 稳 定 性 ； 二 、 生 理 生 化 特 征 与 微 生 物 的 酶 和 调 节 蛋 白 质 的 本 质 和 活 性 直 接 相 关 ；代 谢 产 物 等营 养 类 型 ； 与 氧 的 关 系 ； 对 温 度 的 适 应 性 ；对 pH的 适 应 性 ；对 渗 透 压 的 适 应 性 ；酶 及 蛋 白 质 都 是 基 因 产 物 ；对 微 生 物 生 理 生 化 特 征 的 比 较 也 是 对 微 生 物 基 因 组 的 间 接 比

27、较 ；测 定 生 理 生 化 特 征 比 直 接 分 析 基 因 组 要 容 易 得 多 ； 1、 API 细 菌 数 值 鉴 定 系 统2、 Enterotube 系 统3、 Biolog 全 自 动 或 手 动 细 菌 鉴 定 系 统 微 型 、 简 便 、 快 速 或 自 动 化 鉴 定 技 术 1、 API 细 菌 数 值 鉴 定 系 统 菌 种基 本 培 养 基（ 液 体 ） 菌 悬 液检 测 、 编 码 、 查 表 、 鉴 定 适 用 于 API鉴 定 细 菌 有 700多 种Analytica Products INC的 简 称 。法 国 生 物 - 梅 里 埃 公 司 生 产

28、的细 菌 数 值 分 类 分 析 鉴 定 系 统 。约 有 1 000 种 生 化 反 应 ,可 鉴 定的 细 菌 大 于 550 种 。 目 前 中 国各 级 疾 病 预 防 控 制 机 构 在 细 菌学 检 验 中 比 较 多 地 应 用 了 此 项技 术 2、 Enterotube 系 统 不 同 培 养 基 分 装 不 同 小 槽 中 ， 同步 接 种 ， 培 养 后 检 测 、 查 表 、 鉴 定 。 3、 Biolog全 自 动 或 手 动 细 菌 鉴 定 系 统 在 96孔 的 细 菌 培 养 板 上 检 测 微 生 物 对不 同 发 酵 性 碳 源 利 用 情 况 进 行 的

29、分 类 鉴 定 。自 动 化 、 快 速 可 鉴 定 细 菌 有 1140多 种 、 酵 母 菌 267种 、 目前 已 经 可 用 于 丝 状 真 菌 。每 个 孔 中 含 有不 同 的 底 物 菌 悬 液 或无 菌 水 分 子 生 物 学 指 标 DNA碱 基 因 组 成 是 各 种 生 物 一 个 稳 定 的 特征 ， 即 使 个 别 基 因 突 变 ， 碱 基 组 成 也 不 会 发 生明 显 变 化 。 1. DNA的 碱 基 组 成 (G+Cmol%) 分 类 学 上 ， 用 G+C占 全 部 碱 基 的 克 分子 百 分 数 (G+Cmol%)来 表 示 各 类 生 物 的DNA

30、碱 基 因 组 成 特 征 。 每 个 生 物 种 都 有 特 定 的 GC%范 围 ， 因此 可 以 作 为 分 类 鉴 定 的 指 标 。 细 菌 的 GC%范 围 为 25-75%， 变 化 范 围 最 大 ， 因 此 更 适合 于 细 菌 的 分 类 鉴 定 。 GC%测 定 主 要 用 于 对 表 型 特 征 难 区 分 的 细 菌 作 出 鉴 定 ， 并 可 检 验 表 型 特 征 分 类 的 合 理 性 ， 从 分 子 水 平 上 判 断 物 种 的 亲 缘 关 系 。G+C含 量 的 比 较 主 要 用 于 分 类 鉴 定 中 的 否 定但 具 有 相 似 G+C含 量 的 生

31、 物 并 不 一 定 表 明 它 们之 间 具 有 近 的 亲 缘 关 系 。 同 一 个 种 内 的 不 同 菌 株 G+C含 量 差 别 应 在 4 5%以 下 ； 同 属 不 同 种 的 差 别 应 低 于 10 15%； G+C含 量 已 经 作 为 建 立 新 的 微 生 物 分 类 单 元 的 一项 基 本 特 征 ， 它 对 于 种 、 属 甚 至 科 的 分 类 鉴 定 有 重 要意 义 。 若 二 个 在 形 态 及 生 理 生 化 特 性 方 面 及 其 相 似 的菌 株 ， 如 果 其 G+C含 量 的 差 别 大 于 5%， 则 肯 定 不 是同 一 个 种 ， 大 于

32、 15%则 肯 定 不 是 同 一 个 属 。 2. 核 酸 的 分 子 杂 交 不 同 生 物 DNA碱 基 排 列 顺 序 的 异 同 直 接 反 映 生 物之 间 亲 缘 关 系 的 远 近 ， 碱 基 排 列 顺 序 差 异 越 小 ， 它 们之 间 的 亲 缘 关 系 就 越 近 ， 反 之 亦 然 。t 直 接 分 析 比 较 DNA的 碱 基 排 列 顺 序-由 于 技 术 上 的 困 难 目 前 尚 难 以 普 遍 地 进 行 ；t 核 酸 分 子 杂 交 (hybridization)间 接 比 较 不 同 微 生 物 DNA碱 基 排 列 顺 序 的 相 似 性 1） DN

33、A-DNA杂 交 ；（ 亲 缘 关 系 相 对 近 的 微 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 比 较 ）2） DNA-rRNA杂 交 ；（ 亲 缘 关 系 相 对 远 的 微 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 比 较 ）3） 核 酸 探 针 ；（ 利 用 特 异 性 的 探 针 ， 用 于 细 菌 等 的 快 速 鉴 定 ） 4） 电 子 杂 交 随 着 微 生 物 基 因 信 息 ， 特 别 是 全 基 因 组完 全 测 序 的 不 断 增 加 ， 我 们 可 以 通 过 各 种 计算 机 软 件 对 不 同 物 种 的 遗 传 信 息 进 行 直 接 比较 ， 从 而 分 析 不 同 微 生 物 间 的 亲 缘 关 系 。 3、 其 它 血 清 学 试 验噬 菌 体 分 型生 态 特 性氨 基 酸 顺 序蛋 白 质 分 析细 胞 壁 等 细 胞 成 分 通 过 原 核 生 物 的 转 化 、 转 导 、 接 合 来 判 断 原核 生 物 的 亲 缘 关 系 等 等 。