《沉淀技术》PPT课件

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1、赵 世 光生 物 化 学 工 程 系 生 物 技 术 教 研 室现 代 生 化 分 离 技 术Separation Methods in Biochemistry Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 2第 三 章 沉 淀 技 术 第 三 章 沉 淀 技 术 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Depar

2、tment of Biochemical Engineering 3第 三 章 沉 淀 技 术 第 一 节 概 述 沉 淀 是 溶 液 中 的 溶 质 有 液 相 变 成 固 相 析 出 的 过 程 ， 表 示一 个 新 的 凝 结 相 的 形 成 过 程 ， 或 由 于 加 入 沉 淀 剂 使 某 些离 子 成 为 难 溶 化 合 物 而 沉 积 的 过 程 。 是 物 理 环 境 的 变 化 引 起 溶 质 的 溶 解 度 降 低 、 生 成 固 体 凝聚 物 的 现 象 。 沉 淀 VS结 晶 ， 本 质 上 同 一 种 过 程 。 同 类 分 子 或 离 子 以 有 规 则 排 列 形

3、 式 析 出 结 晶 ； 以 无 规 则 的 紊 乱 排 列 形 式 析 出 沉 淀 。 3.1.1 沉 淀 的 定 义 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 4第 三 章 沉 淀 技 术 3.1.2 沉 淀 的 类 型 ：1. 晶 形 沉 淀 ： 颗 粒 最 大 ， 其 直 径 大 约 在 0.11 m之 间。 在 沉 淀 内 部 ， 离 子 按 晶 体 结 构 有 规 则 地 进 行 排 列， 因 而 结 构

4、 紧 密 ， 整 个 沉 淀 所 占 的 体 积 较 小 ， 极 易沉 降 于 容 器 底 部 。2. 凝 乳 状 沉 淀 ： 颗 粒 大 小 介 于 上 述 二 者 之 间 ， 其 直 径大 约 为 0.021 m， 因 此 其 性 质 也 介 于 二 者 之 间 。3. 无 定 型 沉 淀 ： 颗 粒 最 小 ， 其 直 径 大 约 在 0.02 m以 下。 沉 淀 内 部 离 子 排 列 杂 乱 无 章 ， 并 且 包 含 有 大 量 水分 子 ， 因 而 结 构 疏 松 ， 体 积 庞 大 ， 难 以 沉 降 。 Anhui University of Technology and S

5、cience Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 5第 三 章 沉 淀 技 术 沉 淀 法 是 最 古 老 的 分 离 和 纯 化 生 物 物 质 的 方 法 ， 目 前 仍 广 泛 应 用在 工 业 上 和 实 验 室 中 。 由 于 其 浓 缩 作 用 常 大 于 纯 化 作 用 ， 因 而 沉 淀 法 通 常 作 为 初 步 分 离的 一 种 方 法 ， 用 于 从 去 除 了 菌 体 或 细 胞 碎 片 的 发 酵 液 中 沉 淀 出 生物 物 质 ， 然 后 再 利 用 色 层 分 离

6、 等 方 法 进 一 步 提 高 其 纯 度 。 沉 淀 法 由 于 成 本 低 、 收 率 高 、 浓 缩 倍 数 高 可 达 l0-50倍 和 操 作 简 单等 优 点 ， 是 下 游 加 工 过 程 中 应 用 广 泛 的 值 得 注 意 的 方 法 。 缺 点 ： 针 对 复 杂 体 系 而 言 ， 分 离 度 不 高 、 选 择 性 不 强3.1.3 沉 淀 技 术 的 应 用 特 点 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical E

7、ngineering 6第 三 章 沉 淀 技 术 第 二 节 沉 淀 方 法 的 分 类F盐 析F有 机 溶 剂 沉 淀F等 电 点 沉 淀F非 离 子 多 聚 物 沉 淀F聚 电 解 质 沉 淀 法F高 价 金 属 离 子 沉 淀 法F热 沉 淀 法 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 7第 三 章 沉 淀 技 术 F盐 析 法 蛋 白 质 在 水 溶 液 中 的 溶 解 度 受 盐 浓 度 影 响1、 基

8、 本 原 理 蛋 白 质 表 面 特 性蛋 白 质 溶 解 ： 相 似 者 相 溶亲 水 性 和 疏 水 性 ：有 利 因 素 ： 亲 水 性 ， 包 括 氢 键 、 极 性 基 团、 离 子 化 侧 链 、 亲 水 蛋 白 所 占 的 %等 。如 白 蛋 白不 利 因 素 ： 疏 水 性 ， 包 括 暴 露 的 疏 水 基 团、 疏 水 蛋 白 所 占 的 %等 。 如 纤 维 蛋 白 原 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical E

9、ngineering 8第 三 章 沉 淀 技 术 蛋 白 质 和 酶 均 易 溶 于 水 ， 因 为 该 分 子 的 COOH、 NH2和 OH都 是 亲 水 基 团 ， 这 些 基 团 与 极 性 水 分 子 相 互作 用 形 成 水 化 层 ， 包 围 于 蛋 白 质 分 子 周 围 形 成1nm100nm颗 粒 的 亲 水 胶 体 ， 削 弱 了 蛋 白 质 分 子 之 间 的作 用 力 ， 蛋 白 质 分 子 表 面 极 性 基 团 越 多 ， 水 化 层 越 厚 ，蛋 白 质 分 子 与 溶 剂 分 子 之 间 的 亲 和 力 越 大 ， 因 而 溶 解 度也 越 大 。 Anhu

10、i University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 9第 三 章 沉 淀 技 术 盐 溶原 理 ： 大 多 数 蛋 白 类 酶 都 溶 于 水 ， 而 且 在 低 浓 度 的 盐 存 在的 条 件 下 ， 酶 的 溶 解 度 随 盐 浓 度 的 升 高 而 增 加 ， 这 称 为 盐溶 现 象 。 蛋 白 质 分 子 吸 附 盐 类 离 子 后 ， 带 电 表 层 使 蛋 白 质分 子 彼 此 排 斥 （ 同 性 相 斥 ） ； 而

11、蛋 白 质 与 水 分 子 的 相 互 作用 却 加 强 ， 溶 解 性 增 大 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 10第 三 章 沉 淀 技 术 盐 析 （ 破 坏 水 化 膜 、 中 和 电 荷 ）1、 继 续 增 大 中 性 盐 离 子 强 度 时 大 量 的 盐 夺 取 了 自 由水 ， 将 其 转 变 为 盐 离 子 的 水 化 水 蛋 白 质 胶 体 外 层的 水 化 膜 因 盐 的 夺 取

12、而 遭 到 破 坏 蛋 白 质 胶 体 表 面的 疏 水 区 域 暴 露 出 来 ， 彼 此 相 互 聚 集 ， 沉 淀 ； Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 11第 三 章 沉 淀 技 术 2、 加 入 高 浓 度 中 性 盐 后 ， 盐 离 子 与 生 物 分 子 表 面 的 带 相反 电 荷 的 离 子 基 团 结 合 ， 中 和 了 生 物 分 子 表 面 的 电 荷， 降 低 了 生 物 分 子 与

13、 水 分 子 之 间 的 相 互 作 用 ， 此 时 生物 分 子 很 容 易 相 互 聚 集 ， 在 溶 液 中 的 溶 解 度 降 得 很 低， 从 而 形 成 沉 淀 从 溶 液 中 析 出 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 12第 三 章 沉 淀 技 术 小 结原 理 1.高 浓 度 盐 离 子 使 蛋 白 质 表 面 双 电 层 厚 度 降 低 ， 静 电 排 斥 作用 减 弱 .2.中 性 盐

14、 比 蛋 白 质 具 更 强 的 亲 水 性 ， 因 此 将 与 蛋 白 质 争 夺 水分 子 . Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 13第 三 章 沉 淀 技 术 2、 盐 析 公 式 及 讨 论 l蛋 白 质 溶 解 度 与 溶 液 中 离 子 强 度 关 系 ：llgS =-ksI lS， 蛋 白 质 溶 解 度 （ g/L）lI- 0.5MK2SO4的 离 子 强 度 I (0.5 2 12+0.5

15、22)/2=1.5。- 1MNaCl的 离 子 强 度 (1 12+1 12)/2=1 l为 常 数 ， I=0时 的 lgSlks为 盐 析 常 数 ， 与 盐 性 质 （ 离 子 价 数 、 离 子 半 径 等 ） 、 蛋白 结 构 有 关 ， ks越 大 ， 盐 析 效 果 越 好 （ S越 小 ， 越 易 沉 淀） 221 iiZcI Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 14第 三 章 沉 淀 技 术

16、l 讨 论1、 KsI项Ks与 溶 液 的 pH、 温 度 无 关 ， 仅 取 决 于 蛋 白 质 的 性 质 和盐 的 种 类 。 盐 浓 度 离 子 强 度 I S 析 出。 lgS =-ksI Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 15第 三 章 沉 淀 技 术 2、 值 的 特 性 及 对 盐 析 的 影 响 表 示 不 外 加 盐 时 的 理 想 溶 解 度 S， 受 到 温 度 、 pH的 影响 ；p

17、H的 影 响 ： 在 pI时 最 小 （ 调 节 pH可 以 导 致 蛋 白 质 净电 荷 数 变 化 ）温 度 的 影 响 ： 高 离 子 强 度 溶 液 中 ， 温 度 升 高 一 般 使 下 降 （ 温 度 升 高 利 于 盐 的 溶 解 ， 夺 取 更 多 的 水 分 子 ， 使蛋 白 质 溶 解 性 更 差 ） lgS =-ksI Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 16第 三 章 沉 淀 技 术 3

18、、 分 段 盐 析1.ks分 段 盐 析 ： 固 定 蛋 白 质 的 pH 、 T（ ） ,变 动 离 子 强 度I达 到 沉 淀 的 目 的 。2. 分 段 盐 析 ： 在 一 定 的 离 子 强 度 下 （ I ） ， 改 变 溶 液 的pH、 T ， 达 到 沉 淀 的 目 。 Ks盐 析 法 由 于 蛋 白 质 对 离 子 强 度 的 变 化 非 常 敏 感 ， 易 产 生共 沉 淀 现 象 ， 因 此 常 用 于 提 取 液 的 前 处 理 （ 蛋 白 质 粗 品 的分 级 沉 淀 ） 。 盐 析 法 由 于 溶 质 溶 解 度 变 化 缓 慢 ， 且 变 化 幅 度 小 ， 因 此

19、分 辨 率 更 高 ， 常 用 于 初 步 的 纯 化 。lgS =-ksI Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 17第 三 章 沉 淀 技 术 3、 盐 析 操 作 要 点 3.1 无 机 盐 的 挑 选 原 则 高 溶 解 度 ， 能 配 置 高 离 子 强 度 的 盐 溶 液 ； 溶 解 度 受 温 度 的 影 响 小 ； 盐 溶 液 的 密 度 不 高 ， 便 于 蛋 白 质 沉 淀 和 离 心 分 离

20、 ； 不 易 引 起 蛋 白 质 的 变 性 ； 价 格 低 廉 ； Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 18第 三 章 沉 淀 技 术 通 常 采 用 中 性 盐 ， 最 常 用 （ NH4） 2SO4，优 点 ：1、 溶 解 度 大 ： 尤 其 是 在 低 温 时 仍 有 相 当 高 的 溶 解 度 ，这 是 其 他 盐 类 所 不 具 备 的 。由 于 酶 和 各 种 蛋 白 质 通 常 是 在 低 温

21、下 稳 定 ， 因 而 盐 析 操作 也 要 求 在 低 温 下 （ 0 4 ） 进 行 。 硫 铵 在 0 时 的 溶解 度 70.6g/100mL ， Na2SO4 -4.9, NaH2PO4 -1.6 3.2 盐 的 选 择 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 19第 三 章 沉 淀 技 术 2、 不 易 引 起 变 性 ， 有 稳 定 酶 与 蛋 白 质 结 构 的 作 用 。 有的 酶 或 蛋 白 质

22、 用 2 3mol/L浓 度 的 （ NH4） 2SO4保 存 可达 数 年 之 久 。3、 次 常 用 Na2SO4。 缺 点 ： 在 30 以 下 溶 解 度 较 低 ， 主要 用 于 热 稳 定 蛋 白 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 20第 三 章 沉 淀 技 术 3.3 盐 析 的 操 作 与 应 用3.3.1 盐 析 的 操 作 方 法 盐 的 处 理 硫 酸 铵 使 用 时 要 求 纯 度

23、 较 高 ， 生 产 时 为降 低 成 本 ， 一 般 选 用 化 学 纯 的 硫 酸 铵 ， 在使 用 前 应 进 行 预 处 理 ， 可 通 过 化 学 法 将 重金 属 除 去 （ 如 通 入 H2S后 过 滤 ） ， 再 将 硫酸 铵 重 结 晶 备 用 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 21第 三 章 沉 淀 技 术 加 盐 的 方 法1. 固 体 硫 酸 铵 加 入 法 （ 需 要 量 大 时

24、 ） 。 将其 研 成 细 粉 ， 在 搅 拌 下 缓 慢 均 匀 少 量 多 次地 加 入 ， 接 近 计 划 饱 和 度 时 ， 加 盐 的 速 度更 要 慢 一 些 ， 尽 量 避 免 局 部 硫 酸 铵 浓 度 过大 而 造 成 不 应 有 的 蛋 白 质 沉 淀 。2. 加 入 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 法 （ 需 要 量 小 时 ） 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 22第 三 章 沉 淀

25、技 术 3.3.2 盐 析 的 影 响 因 素蛋 白 质 的 种 类 蛋 白 质 的 种 类 不 同 ， Ks值 会 有 所 不 同 ； 分 子 量 越 大 ， 沉 淀 所 需 盐 的 量 越 少 ； 蛋 白 质 分 子 不 对 称 性 越 大 ， 越 容 易 沉 淀 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 23第 三 章 沉 淀 技 术 不 同 浓 度 的 蛋 白 质 溶 液 产 生 沉 淀 所 要 求 的

26、临 界 盐 浓 度不 同 。高 浓 度 的 蛋 白 质 用 稍 低 的 硫 酸 铵 饱 和 度 沉 淀 ， 若 蛋 白 质 浓 度过 高 ， 易 产 生 各 种 蛋 白 质 的 共 沉 淀 作 用 。低 浓 度 的 蛋 白 质 ， 共 沉 淀 作 用 小 ， 但 回 收 率 降 低 。 较 适 中 的蛋 白 质 浓 度 是 2.5 3.0 ， 相 当 于 25 mg/mL 30mg/mL。 蛋 白 质 的 浓 度 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Bioc

27、hemical Engineering 24第 三 章 沉 淀 技 术 pH值 对 盐 析 的 影 响在 等 电 点 处 溶 解 度 小 ， pH值 常 选 在 该 蛋 白 质的 等 电 点 附 近 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 25第 三 章 沉 淀 技 术 温 度 的 影 响 对 于 蛋 白 质 、 酶 和 多 肽 等 生 物 大 分 子 ， 在 高 离 子 强度 溶 液 中 ， 温 度 升 高

28、， 它 们 的 溶 解 度 反 而 减 小 。 在 低 离 子 强 度 溶 液 或 纯 水 中 蛋 白 质 的 溶 解 度 大 多 数还 是 随 浓 度 升 高 而 增 加 的 。 一 般 情 况 下 ， 可 在 室 温 下 进 行 。 但 对 于 某 些 对 温 度敏 感 的 酶 ， 要 求 在 0 4 下 操 作 ， 以 避 免 活 力 丧失 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 26第 三 章 沉 淀

29、技 术 无 机 盐 种 类 阴 离 子 盐 析 作 用 顺 序柠 檬 酸 盐 PO43 SO42 CH3COOCl NO3 SCN阳 离 子 盐 析 作 用 顺 序 （ 一 价 ） NH4+K+Na (NH4)2SO4 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 27第 三 章 沉 淀 技 术 3.3.3 沉 淀 的 再 溶 解1 2倍 沉 淀 体 积 的 下 一 步 所 用 缓 冲 液 溶 解不 溶 时 可 能 是

30、变 性 蛋 白 质 或 杂 质 ， 离 心 除 去 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 28第 三 章 沉 淀 技 术 3.3.4 脱 盐 透 析超 滤凝 胶 过 滤 层 析 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 29第 三

31、章 沉 淀 技 术 F有 机 溶 剂 沉 淀 法定 义 向 水 溶 液 中 加 入 一 定 量 亲 水 性 的 有 机 溶 剂 ， 降 低 溶 质 的 溶解 度 ， 使 其 沉 淀 析 出 的 分 离 纯 化 方 法 ， 称 为 有 机 溶 剂 沉 淀 法 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 30第 三 章 沉 淀 技 术 （ 1） 静 电 作 用 ： 降 低 水 溶 液 的 介 电 常 数 ， 向 溶 液

32、 中加 入 有 机 溶 剂 能 降 低 溶 液 的 介 电 常 数 ， 减 小 溶 剂 的 极性 ， 从 而 削 弱 了 溶 剂 分 子 与 蛋 白 质 分 子 间 的 相 互 作 用力 ， 带 电 的 蛋 白 质 溶 质 分 子 之 间 库 仑 引 力 增 强 ， 使 其相 互 吸 引 而 聚 集 ， 导 致 蛋 白 质 溶 解 度 降 低 而 沉 淀 。1、 原 理 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 31

33、第 三 章 沉 淀 技 术 （ 2） 脱 水 作 用由 于 使 用 的 有 机 溶 剂 与 水 互 溶 ， 它 们 在 溶 解 于 水 的 同时 从 蛋 白 质 分 子 周 围 的 水 化 层 中 夺 走 了 水 分 子 ， 破 坏了 蛋 白 质 分 子 的 水 膜 ， 因 而 发 生 沉 淀 作 用 。 较 静 电 作用 占 更 主 要 的 地 位 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 32第 三 章 沉

34、淀 技 术 2、 影 响 有 机 溶 剂 沉 析 的 因 素（ 一 ） 温 度多 数 生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 、 酶 和 核 酸 在 有 机 溶 剂 中对 温 度 特 别 敏 感 ， 温 度 稍 高 就 会 引 起 变 性 ， 且 有 机溶 剂 与 水 混 合 时 产 生 放 热 反 应 ， 因 此 必 须 预 冷 ， 操作 要 在 冰 盐 浴 中 进 行 ， 加 入 有 机 溶 剂 时 必 须 缓 慢 且不 断 搅 拌 以 免 局 部 过 浓 。 一 般 规 律 是 温 度 越 低 ， 得到 的 蛋 白 质 活 性 越 高 。 Anhui University of Techno

35、logy and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 33第 三 章 沉 淀 技 术 （ 二 ） 样 品 浓 度 样 品 较 稀 时 ， 将 增 加 有 机 溶 剂 投 入 量 和 损 耗 ；样 品 太 浓 会 增 加 共 沉 作 用 。一 般 认 为 蛋 白 质 的 初 浓 度 以 0.5 2%（ 5 20mg/mL）为 好 ， 多 糖 则 以 1 2 起 始 较 合 适 。 Anhui University of Technology and Science Teaching

36、 and Research Section Department of Biochemical Engineering 34第 三 章 沉 淀 技 术 （ 三 ） pH值 选 择 在 样 品 稳 定 的 pH值 范 围 内 ， 通 常 是 选 在 等电 点 附 近 ， 从 而 提 高 此 沉 淀 法 的 分 辨 能 力 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 35第 三 章 沉 淀 技 术 （ 四 ） 离 子

37、强 度 少 量 的 中 性 盐 对 蛋 白 质 变 性 有 良 好 的 保 护 作 用， 但 盐 浓 度 过 高 会 增 加 蛋 白 质 在 水 中 的 溶 解 度 ，降 低 了 沉 淀 效 果 ， 通 常 是 在 低 浓 度 缓 冲 液 中 沉 淀蛋 白 质 。盐 浓 度 太 大 或 太 小 都 有 不 利 影 响 ， 通 常 盐 浓 度以 不 超 过 5%为 宜 ， 使 用 乙 醇 的 量 也 以 不 超 过 原 蛋白 质 水 溶 液 的 2倍 体 积 为 宜 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Researc

38、h Section Department of Biochemical Engineering 36第 三 章 沉 淀 技 术 3、 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 应 用（ 一 ） 有 机 溶 剂 沉 析 的 特 点优 点 ： 分 辨 能 力 比 盐 析 高 ,即 一 种 生 物 分 子 或 其他 溶 质 只 在 一 个 比 较 窄 的 有 机 溶 剂 浓 度 范 围 内沉 析 ； 沉 析 不 用 脱 盐 ， 过 滤 比 较 容 易 。缺 点 ： 是 某 些 具 有 生 物 活 性 的 大 分 子 容 易 引 起变 性 失 活 ， 操 作 需 在 低 温 下 进 行 。 Anhui Univ

39、ersity of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 37第 三 章 沉 淀 技 术 （ 二 ） 应 用 有 机 溶 剂 沉 析 技 术 经 常 用 于 蛋 白 质 、 酶 ， 多 糖 和核 酸 等 生 物 大 分 子 的 沉 析 分 离 。 使 用 时 先 要 选 择合 适 的 有 机 剂 ， 然 后 注 意 调 控 样 品 的 浓 度 、 温 度 、pH和 离 子 强 度 ， 使 之 达 到 最 佳 的 分 离 效 果 。 沉 析 所 得 的

40、固 体 样 品 ， 如 果 不 是 立 即 溶 解 进 行 下一 步 的 分 离 ， 则 应 尽 可 能 抽 干 沉 析 物 ， 减 少 其 中有 机 溶 剂 的 含 量 ， 如 若 必 要 可 以 装 透 析 袋 透 析 脱除 有 机 溶 剂 ， 以 免 影 响 样 品 的 生 物 活 性 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 38第 三 章 沉 淀 技 术 实 例 Anhui University of Te

41、chnology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 39第 三 章 沉 淀 技 术 F等 电 点 沉 淀 法 1、 原 理调 节 两 性 生 化 物 质 溶 液 的 pH值 ， 以 达 到 某 一 生 化物 质 的 等 电 点 ， 使 其 从 溶 液 中 沉 淀 析 出 而 实 现 分 离的 技 术 称 为 等 电 点 沉 析 技 术 。等 电 点 (pI)是 两 性 物 质 在 其 质 点 的 净 电 荷 为 零 时介 质 的 pH值 ,溶 质 净 电 荷 为 零 ，

42、 分 子 间 排 斥 电 位 降低 ， 吸 引 力 增 大 ， 能 相 互 聚 集 起 来 ， 沉 淀 析 出 ， 此时 溶 质 的 溶 解 度 最 低 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 40第 三 章 沉 淀 技 术 特 点 等 电 点 沉 淀 法 操 作 十 分 简 单 ， 试 剂 消 耗 少 ， 给体 系 引 入 的 外 来 物 也 少 ， 是 一 种 有 效 的 蛋 白 质 初 级分 离 方 法 ，

43、尤 其 对 疏 水 性 较 强 的 蛋 白 质 。 其 主 要 优点 在 于 很 多 蛋 白 质 的 等 电 点 都 在 偏 酸 性 范 围 内 ， 而无 机 酸 通 常 价 格 低 廉 ， 因 此 可 以 省 去 除 酸 的 步 骤 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 41第 三 章 沉 淀 技 术 2、 应 用 在 生 化 产 品 的 分 离 纯 化 过 程 中 ， 常 利 用 两 性 物 质 如 氨基

44、 酸 、 蛋 白 质 、 多 肽 、 酶 、 核 酸 等 具 有 不 同 的 等 电 点的 特 性 来 进 行 产 品 的 分 离 纯 化 。 由 于 许 多 蛋 白 质 的 等 电 点 十 分 接 近 ， 而 且 带 有 水 膜 的蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 仍 有 一 定 的 溶 解 度 ， 不 能 完 全 沉淀 析 出 ， 因 此 ， 单 独 使 用 此 法 分 辨 率 较 低 ， 因 而 此 法常 与 盐 析 法 、 有 机 溶 剂 沉 淀 法 或 其 他 沉 淀 剂 一 起 配 合使 用 ， 以 提 高 沉 淀 能 力 和 分 离 效 果 。 Anhui University

45、 of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 42第 三 章 沉 淀 技 术 3、 实 例 从 猪 胰 脏 中 提 取 胰 蛋 白 酶 原 ： 胰 蛋 白 酶 原 的 pI 8.9， 可 先于 pH 3.0左 右 进 行 等 电 点 沉 淀 ， 除 去 共 存 的 许 多 酸 性 蛋 白 质(pI=3 O)。 工 业 生 产 胰 岛 素 (pI 5.3)时 ， 先 调 pH至 8.0除去 碱 性 蛋 白 质 ， 再 调 pH至 3.0除 去 酸 性 蛋

46、 白 质 (同 时 加 入 一 定浓 度 的 有 机 溶 剂 以 提 高 沉 淀 效 果 )。 碱 性 磷 酸 酯 酶 的 pI沉 淀 提 取 ： 发 酵 液 调 pH 4.0后 出 现 含 碱 性磷 酸 酯 酶 的 沉 淀 物 ， 离 心 收 集 沉 淀 物 。 用 pH 9.0的 0.1 mol/L Tris-HCl缓 冲 液 重 新 溶 解 ， 加 入 20 40%饱 和 度 的 硫酸 铵 分 级 ， 离 心 收 集 的 沉 淀 Tris-HCl缓 冲 液 再 次 沉 淀 ， 即 得较 纯 的 碱 性 磷 酸 酯 酶 。 Anhui University of Technology an

47、d Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 43第 三 章 沉 淀 技 术 F水 溶 性 非 离 子 型 聚 合 物 沉 淀 法定 义 许 多 水 溶 性 非 离 子 型 聚 合 物 ， 特 别 是 PEG可 用 来进 行 选 择 性 沉 淀 以 纯 化 蛋 白 质 。原 理 聚 合 物 的 作 用 认 为 与 有 机 溶 剂 相 似 ， 能 降 低 水 化度 ， 使 蛋 白 质 沉 淀 。 此 现 象 和 两 水 相 的 形 成 有 联系 。 使 低 分 子 量 的 蛋 白 质 沉

48、 淀 ， 需 加 入 大 量 PEG： 而使 高 分 子 量 的 蛋 白 质 沉 淀 ， 加 入 的 量 较 小 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 44第 三 章 沉 淀 技 术 常 用 的 非 离 子 型 多 聚 物 ： 不 同 分 子 量 的 聚 乙 二 醇 （ PEG）和 葡 聚 糖 PEG： 亲 水 性 强 ， 溶 干 水 和 许 多 有 机 溶 剂 ， 对 热 稳 定 ， 有广 泛 围 的 分

49、子 量 （ 聚 合 程 度 ） Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 45第 三 章 沉 淀 技 术 PEG是 一 种 特 别 有 用 的 沉 淀 剂 ， 因 为 无 毒 ， 不 可 燃 性 且 对 大 多 数蛋 白 质 有 保 护 作 用 。 PEG沉 淀 法 能 在 室 温 下 进 行 ， 得 到 的 沉 淀 颗粒 较 大 ， 收 集 容 易 。 PEG的 分 子 量 需 大 于 4000， 最 常 用 的

50、是 6000和 20 000。 所 用 的PEG浓 度 通 常 为 20 ， 浓 度 再 高 ， 会 使 粘 度 增 大 ， 造 成 沉 淀 的 回收 比 较 困 难 。 PEG对 后 续 分 离 步 骤 ， 影 响 较 少 ， 因 此 可 以 不 必 除去 。 但 它 的 存 在 会 干 扰 A280和 Lowry法 测 定 蛋 白 质 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 46第 三 章 沉 淀 技 术 优

51、点 ： 室 温 条 件 下 操 作 ； 沉 淀 的 颗 粒 往 往 比 较 大 ； 不 容 易破 坏 蛋 白 质 活 性 。缺 点 ： 所 得 的 沉 淀 中 含 有 大 量 的 PEG Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 47第 三 章 沉 淀 技 术 F 其 他 沉 析 技 术一 、 成 盐 沉 淀 法 1.金 属 离 子 沉 淀 法 ： 蛋 白 质 在 碱 性 溶 液 中 带 负 电 荷， 能 与 金 属

52、 离 子 形 成 金 属 复 合 盐 沉 淀 。 常 用 的 金 属 离子 Zn2+ 、 Ca2+ 、 Pb22.有 机 酸 沉 淀 法 ： 含 氮 有 机 酸 如 苦 味 酸 和 鞣 酸 等 能 够与 有 机 分 子 的 碱 性 功 能 团 形 成 复 合 物 而 沉 淀 析 出 。3.无 机 酸 沉 淀 法 ： 磷 钨 酸 、 磷 钼 酸 等 能 与 阳 离 子 形 式的 蛋 白 质 形 成 溶 解 度 极 低 的 复 合 盐 ， 从 而 使 蛋 白 质 沉淀 析 出特 点 ： 常 使 蛋 白 质 发 生 不 可 逆 的 沉 淀 ， 应 用 时 必 须 谨慎 。 Anhui Univers

53、ity of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 48第 三 章 沉 淀 技 术 二 、 选 择 性 变 性 沉 淀 法 选 择 变 性 沉 析 法 原 理 是 利 用 蛋 白 质 、 酶 与 核 酸 等 生 物 大分 子 对 某 些 物 理 或 化 学 因 素 敏 感 性 不 同 ， 而 有 选 择 地 使之 变 性 沉 析 ， 以 达 到 目 的 物 与 杂 蛋 白 分 离 的 技 术 ， 称 为选 择 变 性 沉 淀 。1、 选 择 性 热 变

54、 性 ： 适 用 对 象 ： 热 稳 定 性 高 的 蛋 白 质2、 选 择 性 酸 碱 变 性 3、 选 择 性 变 性 剂 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 49第 三 章 沉 淀 技 术 实 例酵 母 干 粉 中 加 入 0.066 mol/L磷 酸 氢 二 钠 溶 液 ， 37水 浴 保 温 2 h， 室 温 搅 拌 3 h， 离 心 收 集 上 清 液 ， 升 温至 55 ， 保 温 20 min后

55、 迅 速 冷 却 离 心 去 除 热 变 性 蛋 白， 上 清 液 中 多 为 热 稳 定 性 较 高 的 醇 脱 氢 酶 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 50第 三 章 沉 淀 技 术 CTAB(十 六 烷 基 三 甲 基 季 铵 盐 溴 化 物 ) 与 多 糖 上 的 阴 离 子 形 成 形 成 季 铵 络 合 物 ， 降 低 离 子 强 度 ， 络合 物 析 出 。 酚 、 氯 仿 、 十 二 烷

56、 基 磺 酸 钠 等 目 的 是 使 核 酸 和 蛋 白 质 分 离 ， 蛋 白 质 变 性 沉 淀 ， 核 酸 则 存 在于 水 溶 液 中 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 51第 三 章 沉 淀 技 术 第 三 节 沉 淀 技 术 的 应 用 3.3.1 蛋 白 质 蛋 白 质 （ 酶 ） 的 纯 化 在 粗 分 离 阶 段 常 用 到 沉 淀 技 术 ，以 盐 析 、 有 机 溶 剂 沉 淀 、

57、多 聚 物 沉 淀 的 应 用 最 广 泛 。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 52第 三 章 沉 淀 技 术 棉 铃 虫 谷 胱 甘 肽 S-转 移 酶 （ glutathione S-transferase， GST） 的 纯 化- 聚 乙 烯 亚 胺 （ PEI） +硫 酸 铵 +PEG+亲 和 层 析 ， 棉 铃 虫 幼 虫中 的 GST- PEG10000PEG20000(NH4)2SO4 多 种

58、 沉 淀 技 术 的 结 合 使 用 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 53第 三 章 沉 淀 技 术 -甘 露 聚 糖 酶 （ -mannanase）- 枯 草 芽 孢 杆 菌 发 酵- 丙 酮 沉 淀 /(NH4)2SO4/PEG- 比 较 后 丙 酮 最 佳 不 同 沉 淀 技 术 的 比 较 Anhui University of Technology and Science Teaching and

59、 Research Section Department of Biochemical Engineering 54第 三 章 沉 淀 技 术 3.3.2 核 酸 核 酸 的 高 电 荷 磷 酸 骨 架 （ 3-） 比 蛋 白 质 ， 多 糖 等 更具 亲 水 性 PEG应 用 于 DNA沉 淀 已 普 遍 （ 0.01M 磷 酸 缓 冲 液 中 PEG浓 度 10%） 酚 、 氯 仿 抽 提 后 （ 变 性 蛋 白 质 ） ， 乙 酸 钠 中 和 磷 酸骨 架 负 电 荷 （ 降 低 其 亲 水 性 ， 促 聚 集 ） ， 乙 醇 可 有效 沉 淀 DAN（ 有 机 溶 剂 沉 淀 ） 分 子 克 隆 第 三 版 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 55第 三 章 沉 淀 技 术 3.3.3 多 糖多 糖 提 取 的 初 级 阶 段 多 用 到 乙 醇 沉 淀 或 乙 醇 分 级 沉淀 ， 选 择 性 沉 淀 （ TCA） 去 除 多 糖 中 的 蛋 白 质 杂 质。 教 材 例 子