荧光定量PCR在临床医学中的应用

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1、荧 光 定 量 PCR在 临 床医 学 中 的 应 用 内 容 提 要 一 、 基 因 诊 断 技 术 简 介二 、 乙 型 肝 炎 的 病 原 检 测三 、 丙 型 肝 炎 的 病 原 检 测四 、 性 病 相 关 病 原 体 的 检 测 基 因 诊 断 技 术 简 介 4 基因诊断3 免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录 m RNA翻译蛋白质1 形态学诊断2 生化诊断概 念 PCR与 基 因 诊 断 技 术l 基 因 诊 断 即 通 过 核 酸 的 分 子 生 物 学 检 测 直 接 检 测 基 因的 存 在 状 态 或 缺 陷 对 疾 病 作 出 诊 断 的 方 法 。l Polym

2、erase chain reaction(PCR)， 聚 合 酶 链 式 反 应 ，是 一 种 DNA的 快 速 扩 增 技 术 。 PCR技 术 通 过 两 个 短 的称 为 引 物 的 DNA小 片 段 和 一 种 耐 热 酶 的 作 用 ， 可 在 3个 小 时 内 把 特 定 的 DNA片 段 扩 增 1000万 倍 。 l 九 十 年 代 中 期 PCR临 床 应 用 在 国 内 全 面 开 展 ， 1998年 ， 荧 光 定 量 PCR技 术 开 始 在 中 国 应 用 于 临 床 检 测 。 荧 光 定 量 PCR技 术l 实 时 荧 光 定 量 PCR技 术 ， 是 指 在 反

3、 应 体 系 中 加 入荧 光 标 记 ， 利 用 荧 光 信 号 积 累 实 时 检 测 整 个 PCR过 程 ， 通 过 标 准 曲 线 对 PCR终 产 物 的 分 析 ， 最 终实 现 对 未 知 的 起 始 模 版 进 行 定 量 分 析 的 一 种 技 术 ，是 迄 今 对 已 知 基 因 序 列 的 核 酸 测 定 中 最 灵 敏 的 方法 。 荧 光 染 料 ： SYBR Green I、 EVA Green荧 光 探 针 ： TaqMan、 Hybridization Probes 、 Molecular Beacon 荧 光 定 量 PCR技 术 的 优 点l 特 异 性

4、强 ： 直 接 扩 增 病 原 体 的 特 异 DNA或 异 常 基 因 片 段l 灵 敏 度 高 ： 可 检 测 到 极 少 量 的 DNA， 有 效 降 低 漏 诊 率l 高 效 省 时 ： 扩 增 周 期 短 ， 有 利 于 快 速 诊 断l 取 材 范 围 广 ： 血 清 、 痰 液 、 体 液 、 毛 发 等 多 种 样 本l 全 封 闭 反 应 ： 无 需 PCR后 处 理 ， 降 低 污 染l 定 量 准 确 ： 利 用 标 准 曲 线 法 ， 采 用 对 数 期 分 析l 自 动 化 程 度 高 ： 操 作 安 全 ， 避 免 人 为 判 断 RocheLightCycler

5、荧 光 定 量 PCR技 术 的 临 床 应 用l 病 毒 性 肝 炎 （ HBV、 HBV-YMDD、 HCV） 的 基 因 检 测l 性 病 相 关 病 原 体 （ CT、 NG、 UU、 HPV） 的 基 因 检 测l 优 生 优 育 项 目 诊 断 ： 人 巨 细 胞 病 毒 （ HCMV） 、 单 纯疱 疹 病 毒 II型 （ HSV） 、 弓 形 虫 （ TOX） 、 风 疹 病 毒l 其 它 病 原 体 检 测 ： 结 核 杆 菌 、 肺 炎 支 原 体 、 EB病 毒 、伤 寒 杆 菌 、 幽 门 螺 旋 杆 菌 等 乙 型 肝 炎 的 病 原 检 测 乙 肝 病 毒 H BV

6、的感染过程 乙 肝 如 何 传 染 ？ 慢 性 HBV感 染病 毒 持 续 6个 月 未 被 清 除 者l 免 疫 耐 受 期 ： HBV复 制 活 跃l 免 疫 清 除 期l 非 活 动 或 低 复 制 期 慢 性 乙 型 肝 炎l HBeAg阳 性 慢 性 乙 型 肝 炎l HBeAg阴 性 慢 性 乙 型 肝 炎 乙 型 肝 炎 肝 硬 化l 代 偿 期 肝 硬 化l 失 代 偿 期 肝 硬 化 HBsAg与 抗 HBsl HBsAg在 感 染 HBV两 周 后 即 可 阳 性 。 只 要 HBsAg阳性 就 可 诊 断 HBV感 染 ， 阴 性 则 不 能 排 除 HBV感 染 。l

7、抗 HBs为 保 护 性 抗 体 ， 阳 性 表 示 对 HBV有 免 疫 力 。 HBsAg和 抗 HBs同 时 阴 性 ： 即 所 谓 窗 口 期 ， 此 时 HBsAg和 抗 HBs都 未 产 生 。HBsAg和 抗 HBs同 时 阳 性 ： HBV感 染 恢 复 期 ， 此 时 HBsAg未 消 失 ， 抗 HBs已产 生 。 或 者 是 亚 型 感 染 。 为 什 么 HBsAg阴 性 不 能 排 除 HBV感 染 ？l 窗 口 期l 检 测 试 剂 不 够 灵 敏l 隐 匿 性 慢 性 乙 肝 （ S基 因 变 异 ）l 重 叠 HCV感 染 （ 干 扰 HBsAg合 成 ） 抗

8、HBs阳 性 就 万 无 一 失 了 吗 ？单 一 抗 HBs阳 性 HBV DNA检 出 率 0-11.8%l 先 后 感 染 了 不 同 的 HBV亚 型l HBV病 毒 S基 因 变 异 如 何 诊 断 血 清 HBsAg阴 性 的 HBV感 染 ？l 提 高 检 测 敏 感 性l 采 用 针 对 变 异 抗 原 的 检 测 试 剂lHBV DNA的 检 测 ！ HBeAg与 抗 HBel HBeAg的 存 在 表 示 病 毒 复 制 活 跃 且 有 较 强 的传 染 性 。 HBeAg消 失 而 抗 HBe产 生 称 为 血 清转 换 。 抗 HBe阳 转 后 ， 病 毒 复 制 水

9、平 低 ， 传 染性 降 低 。l 但 长 期 抗 HBe阳 性 者 并 不 代 表 病 毒 复 制 停 止 或无 传 染 性 ， 研 究 显 示 20% 50%仍 可 检 测 到HBV DNA， 部 分 可 能 由 于 前 C区 基 因 变 异 ，导 致 不 能 形 成 HBeAg。 HBeAg与 抗 HBe共 存 ？l处 于 血 清 转 换 过 程 中l野 生 株 与 变 异 株 同 时 存 在 HBeAg水 平 与 HBV DNA的 关 系l HBeAg阳 性 标 本 HBV DNA检 出 率 90 左 右l HBeAg与 HBV DNA有 着 良 好 的 相 关 性 HBeAg阴 性

10、/抗 HBe阳 性 /HBV DNA阳 性HBV DNA水 平 一 般 较 低l HBV低 水 平 复 制l HBV病 毒 前 C区 基 因 变 异l 重 叠 HCV感 染 “两 对 半 ” 缺 陷l “两 对 半 ” 是 HBV DNA 是 病 毒 复 制 和 传 染 性 的 直 接 标 志 。 HBV DNA定 量 对 于 判 断 病 毒 复 制 程 度 、 传 染 性 大小 、 病 毒 药 物 疗 效 等 有 重 要 意 义 。HBV DNA拷 贝 数 乙 肝 病 毒 载 量 HBV DNA检 测 的 临 床 意 义l HBV DNA是 HBV存 在 最 直 接 的 依 据l HBV D

11、NA是 HBV复 制 的 标 志l HBV DNA是 患 者 具 有 传 染 性 的 标 志l HBV DNA对 乙 肝 两 对 半 起 补 充 作 用l HBV DNA是 目 前 判 断 乙 肝 抗 病 毒 药 物 疗 效 最 敏 感 的 指 标l HBV DNA可 检 测 出 隐 匿 性 慢 性 乙 型 肝 炎 提 供 直 接 证 据 缩 短 “ 窗 口 期 ” PCR检 测 “ 窗 口 期 ” 核 酸 检 测 缩 短 的 “ 窗 口 期 ” 的 天 数HBV 56 6-15HCV 70 41-60HIV 22 10-15有 利 于 献 血 员 窗 口 期 病 毒 核 酸 的 筛 查 和

12、早 期 诊 断HBV DNA检 测 的 临 床 意 义 HBV DNA检 测 的 临 床 意 义 调 查 表 明 并 不 是 所 有 “ 大 三 阳 ” 的 病 人都 处 于 HBV复 制 期 ， 具 有 传 染 性 ； 也 不 是 所有 “ 小 三 阳 ” 的 病 人 HBV都 无 复 制 。 因 此 ，要 准 确 知 道 HBV是 否 处 于 复 制 状 态 ， 最 准 确的 方 法 还 是 通 过 检 测 HBV DNA来 决 定 。 HBV DNA检 测 方 法l 斑 点 杂 交 （ 基 本 淘 汰 ）l 定 性 PCR（ 基 本 淘 汰 ）l 荧 光 定 量 PCR（ 主 流 ）l

13、基 因 芯 片 （ 将 来 ？ ） 为 什 么 建 议 病 人 要 进 行HBV DNA检 测 ？ 荧 光 定 量 PCR方 法 检 测 HBV感 染 的 各 期血 清 标 本 Copies/mlHBeAg阳 性 慢 性 乙 型 肝 炎 病 人 8.3 x 108经 干 扰 素 治 疗 后 HBeAg转 阴 6.2 x 103非 活 动 性 HBsAg携 带 者 血 清 5.6 x 103原 先 血 中 HBV DNA阳 性 ， 已 痊 愈超 过 12个 月 的 血 清 10 3 HBsAg和 HBeAg均 阳 性 而 HBV DNA阴 性 ？l 干 扰 素 或 拉 米 夫 定 等 治 疗 后

14、 病 毒 复 制 受 抑 制 。l PCR所 用 引 物 相 应 的 DNA序 列 发 生 突 变 ， 此引 物 与 突 变 DNA不 能 配 对 结 合 。l 病 毒 DNA整 合 于 宿 主 肝 细 胞 染 色 体 而 血 中 游离 HBV DNA很 少 或 缺 乏 。 乙 肝 的 治 疗l 目 前 尚 无 一 种 能 迅 速 、 直 接 杀 死 清 除 乙 肝 病 毒 的 药 物 ，最 好 的 抗 病 毒 药 物 疗 效 也 仅 能 达 到 50 左 右 。l 目 前 国 际 医 学 界 公 认 的 治 疗 慢 性 乙 肝 有 确 切 疗 效 的 抗病 毒 药 物 主 要 有 两 大 类

15、 ： 干 扰 素 ： 重 组 人 -1b干 扰 素 、 - 2a、 -2b干 扰 素 等 。核 苷 类 似 物 ： 拉 米 夫 定 、 阿 德 福 韦 。 乙 肝 的 治 疗主 要 包 括 抗 病 毒 、 免 疫 调 节 、 抗 炎 保 肝 、 抗 纤 维 化 等对 于 HBV DNA105的 患 者 应 进 行 抗 病 毒 治 疗 拉 米 夫 定l 可 迅 速 降 低 HBV DNA的 浓 度 ， 改 善 肝 脏 组 织 的病 变 ， 还 可 能 阻 断 肝 纤 维 化 的 进 程 ， 终 止 肝 硬化 的 发 展 。l 尤 其 是 拉 米 夫 定 不 受 病 毒 感 染 的 模 式 、 野

16、 生 型或 基 因 组 前 C区 突 变 的 影 响 。l 此 外 拉 米 夫 定 还 能 抑 制 肝 移 植 受 体 和 AIDS病 人体 内 的 HBV复 制 。 拉 米 夫 定 治 疗 人 群l 有 明 显 HBV DNA复 制 者l 前 C区 变 异 的 慢 性 乙 型 肝 炎l 代 偿 期 的 慢 性 乙 型 肝 炎l 接 受 肝 脏 移 植 的 患 者l 干 扰 素 治 疗 失 败 拉 米 夫 定 治 疗 效 果l 绝 大 多 数 患 者 HBV DNA水 平 显 著 下 降 。l 用 药 4周 开 始 下 降 ， 12至 16周 约 半 数 以 上 的 病例 血 清 HBV DN

17、A降 到 可 检 测 水 平 以 下 。l 治 疗 1年 后 HBeAg阴 转 率 约 为 20%。 l 病 毒 学 应 答 ： HBV DNA低 于 检 测 下 限l 血 清 学 应 答l 生 化 学 应 答l 组 织 学 应 答应 用 抗 病 毒 药 物 后 如 何 判 断 疗 效 ？ 应 用 抗 病 毒 药 物 后 如 何 判 断 疗 效 ？l治 疗 结 束 时 完 全 应 答l随 访 1年 持 续 应 答l无 应 答 YMDD变 异l YMDD： 酪 氨 酸 蛋 氨 酸 天 门 冬 氨 酸 天 门 冬 氨 酸l 蛋 氨 酸 （ M） 突 变 为 异 亮 氨 （ I） 或 缬 氨 酸 （

18、 V）形 成 YIDD变 异 株 或 YVDD变 异 株 。抗 病 毒 治 疗 中 存 在 的 问 题 HBV-YMDD变 异 检 测 的 临 床 意 义l 动 态 检 测 ： 服 用 拉 米 夫 定 3个 月 开 始 ， 每 月 检 测 1次l 提 前 发 现 ： 可 在 耐 药 临 床 表 现 发 生 前 1-4个 月 检 测 出 突 变 株l 及 时 调 整 ： 适 时 调 整 用 药 方 案 ， 防 止 因 耐 药 而 导 致 病 情 恶 化 丙 型 肝 炎 的 病 原 检 测 丙 肝 病 毒l HCV是 单 链 RNA病 毒l 主 要 通 过 血 液 和 血 制 品 传 播l 感 染

19、 后 易 转 变 为 慢 性 肝 炎 或 发 展 为 肝 硬 化 、 肝 癌l 呈 全 球 性 分 布 ， 约 1%普 通 人 群 感 染 抗 HCV IgM和 抗 HCV IgGl HCV抗 体 不 是 保 护 性 抗 体 ， 是 存 在 HCV感 染 的 标 志 。l 抗 HCV IgM在 发 病 后 即 可 检 测 到 ， 一 般 持 续 1 3个 月 。l 如 果 抗 HCV IgM持 续 阳 性 ， 提 示 病 毒 持 续 复 制 ， 易 转为 慢 性 。l 低 滴 度 抗 HCV IgG提 示 病 毒 处 于 静 止 状 态 ， 高 滴 度 提示 病 毒 复 制 活 跃 。 HCV

20、抗 原 检 测 的 困 难l HCV在 血 液 中 含 量 极 低 ， 仅 为 HBV的 1%l HCV病 毒 颗 粒 很 难 有 效 地 分 离 纯 化 、 人 工 合 成 抗 原l 丙 型 肝 炎 的 窗 口 期 很 长 ， 血 清 学 检 测 无 法 早 期 诊 断l 抗 体 持 续 性 存 在 ， 无 法 提 示 正 确 的 病 毒 载 量l HCV的 型 别 复 杂 ， 高 突 变 率 l HCV核 心 抗 原 检 测 试 剂 盒 敏 感 性 差 ： 45.68% HCV RNA HCV RNA阳 性 是 病 毒 感 染 和 复 制 的 直 接 标 志 。HCV RNA的 定 量 测

21、 定 有 助 于 了 解 病 毒 复 制 程 度 、 抗病 毒 治 疗 的 选 择 及 疗 效 评 估 等 。 HCV RNA荧 光 定 量 PCR检 测 的 临 床 意 义l 早 期 诊 断 ： 在 免 疫 学 检 测 的 “ 窗 口 期 ” 或 一 部 分 不 产 生 抗 体 的 丙 肝 病毒 携 带 者 ， 都 可 出 现 HCV RNA阳 性 ， 抗 HCV阴 性 的 检 测 结 果 。l 弥 补 ELISA方 法 的 高 漏 检 率 ,HCV RNA可 作 为 HCV感 染 诊 断 的 指 标 。l HCV RNA定 量 可 指 导 用 药 ， 为 疗 效 观 察 及 预 后 判 断

22、 提 供 客 观 指 标 。 抗HCV不 能 作 为 抗 病 毒 疗 效 的 指 标 。l 慢 性 丙 型 肝 炎 长 期 抗 HCV阳 性 ， 这 只 表 示 曾 经 感 染 了 丙 肝 病 毒 并 出 现了 相 应 的 免 疫 应 答 ， 并 不 代 表 体 内 仍 有 丙 肝 病 毒 的 存 在 或 复 制 ， 这 时只 能 通 过 HCV RNA定 量 检 测 鉴 别 丙 肝 病 毒 的 活 动 性 和 复 制 程 度 。l HCV主 要 通 过 输 血 和 血 制 品 传 播 ， 对 献 血 员 及 血 制 品 进 行 检 测 ， 以 减少 医 源 性 丙 型 肝 炎 的 发 生 和

23、 传 播 。 核 酸 检 测 在 HCV感 染 的 诊 断 中 要 比 HBV感 染 的 诊 断 重 要 得 多 ！ 性 病 相 关 病 原 体 的 检 测 性 病 在 我 国 已 成 为一 个 重 要 的 公 共 卫 生 问题 ， 自 99年 以 来 ， 性 病的 发 生 率 居 高 不 下 ， 其发 病 率 在 传 染 性 疾 病 中位 居 第 3位 ， 03年 我 国 累计 报 道 性 病 病 例 数 （ HIV除 外 ） 73万 。 浙 江 省 为高 发 区 ， 位 居 全 国 第 三 。 常 见 性 传 播 疾 病 病 原 体l 淋 病 双 球 菌 (NG)l 沙 眼 衣 原 体 (

24、CT)l 解 脲 支 原 体 (UU)l 人 类 乳 头 瘤 病 毒 (HPV)l 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 (HIV) 淋 病 双 球 菌 的 传 统 检 测 方 法l 涂 片 染 色 ： 对 于 女 性 患 者 检 出 率 低 ， 易出 现 假 阴 性l 分 离 培 养 ： 培 养 较 困 难 ， 生 化 鉴 定 复 杂 ，时 间 长l ELISA抗 原 检 测 法 ： 存 在 交 叉 反 应 ， 非 特异 反 应 较 严 重 荧 光 定 量 PCR检 测 NG的 优 势l 可 在 短 时 间 内 快 速 、 准 确 地 直 接 从 临床 各 种 标 本 中 检 出 含 量 极 低

25、的 病 原 菌l 对 女 性 疑 似 淋 球 菌 引 起 的 各 种 炎 症 的诊 断 及 鉴 别 诊 断 起 决 定 性 作 用l 对 症 状 轻 者 或 无 症 状 的 淋 球 菌 感 染 者做 到 早 期 诊 断 和 鉴 别 诊 断l 可 用 于 疗 效 考 核 沙 眼 衣 原 体 沙 眼 衣 原 体 感 染 与 致 病l 近 年 来 在 欧 美 等 国 ， 沙 眼 衣 原 体 的 感 染 率和 危 害 性 已 超 过 淋 球 菌l 在 我 国 ， 在 非 淋 球 菌 性 尿 道 炎 中 居 首 位l 泌 尿 生 殖 道 感 染 ， 妨 碍 妊 娠l 盆 腔 感 染 ， 可 致 生 殖

26、能 力 损 害 传 统 方 法 检 测 沙 眼 衣 原 体 的 缺 陷l “ 窗 口 期 ” 检 测 不 出l 不 能 判 定 是 现 症 感 染 还 是 既 往 感 染 荧 光 定 量 PCR检 测 衣 原 体 的 优 势l 灵 敏 度 98%以 上 、 特 异 性 100%l 提 高 阳 性 检 出 率l 适 用 于 感 染 的 早 期 诊 断 和 无 症 状 携 带者 的 检 查 解 脲 支 原 体 l UU难 以 分 离 ， 需 特 殊 培 养 基 培 养 ， 操 作 费时 ， 需 1-3天 才 能 得 到 初 步 结 果 。l 血 清 学 检 查 ， 仅 10%UU尿 道 炎 患 者

27、 在 病 程中 特 异 性 抗 体 滴 度 升 高 4倍 ， 使 其 方 法 学应 用 受 限 。l 一 些 非 致 病 的 脲 原 体 或 培 养 过 程 中 的 污 染都 可 能 导 致 假 阳 性 的 结 果 。传 统 方 法 检 测 解 脲 支 原 体 的 缺 陷 l 具 有 高 度 的 敏 感 性 和 特 异 性 ， 提 高 阳性 检 出 率l 快 速 、 定 量 准 确 ， 可 以 为 临 床 评 价 疗效 提 供 依 据荧 光 定 量 PCR检 测 支 原 体 的 优 势 人 类 乳 头 瘤 病 毒l 有 100多 个 型l 只 能 感 染 人 的 皮 肤 和 黏 膜 上 皮 细

28、 胞 ， 人是 HPV的 惟 一 宿 主 HPV 宫 颈 癌 l 传 统 巴 氏 涂 片 漏 诊 率 可 达 30%l 从 细 胞 学 水 平 来 观 察 细 胞 的 形 态 学 改 变 ， 其中 80%的 患 者 确 诊 时 已 是 宫 颈 癌 晚 期传 统 方 法 检 测 HPV的 缺 陷 l 早 期 感 染 的 病 原 检 测l 可 对 HPV进 行 分 型l 可 以 评 估 病 毒 载 量 与 患 癌 症 风 险l 可 以 考 核 疗 效 与 预 后l 用 于 HPV感 染 与 生 殖 器 肿 瘤 相 关 性 的 研 究荧 光 定 量 PCR检 测 HPV的 优 势 人 类 免 疫 缺

29、 陷 病 毒是 引 起 艾 滋 病 的 病 原 体 l 可 判 定 无 症 状 且 血 清 阴 性 患 者 潜 在 的 HIV传 播 性l 检 测 长 潜 伏 期 的 HIV携 带 者l 使 “ 窗 口 期 ” 缩 短 10天l 在 治 疗 过 程 中 观 察 患 者 血 清 HIV载 量 的 变 化 预 示病 情 的 转 归 和 指 导 临 床 用 药l 对 于 新 生 儿 是 否 从 母 体 感 染 HIV的 诊 断 尤 为 适 用荧 光 定 量 PCR检 测 HIV 小 结l 荧 光 定 量 PCR是 特 异 、 灵 敏 、 高 效 的 基 因 诊 断 技 术l 对 致 病 微 生 物

30、核 酸 含 量 进 行 定 量 检 测l 弥 补 免 疫 检 测 的 缺 陷 （ 如 HCV）l 缩 短 诊 断 的 窗 口 期 （ 如 HIV） ， 利 于 早 期 诊 断 l 对 治 疗 过 程 进 行 疗 效 监 测l 指 导 用 药 过 程 及 剂 量 ， 以 制 定 合 理 的 疗 效 方 案l 定 量 PCR的 临 床 应 用 可 结 合 临 床 表 现 ， 并 与 传 统 的 免疫 学 、 影 像 学 等 诊 断 方 法 来 综 合 评 判 ， 更 为 科 学小 结 04年 6月 ， 卫 生 部 临 检 中 心 主 任 申 子 瑜 、 中 国 医 科 大 学 附 属 一 院副 院 长 尚 红 等 专 家 对 迪 安 医 学 检 验 中 心 的 进 行验 收 ， 并 顺 利 通 过 ！ 谢 谢 大 家 ！