高纯度低聚果糖生产技术的探讨模板

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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。高纯度低聚果糖生产技术的探讨摘要:低聚果糖是一种功能性低聚糖,用于特殊目的的低聚果糖必须具有很高的纯度。本文探讨了高纯度低聚果糖的生产技术。关键词:低聚果糖果糖转移酶呋喃果糖苷酶葡萄糖氧化酶葡萄糖异构酶0前言低聚果糖(Fructo2oligosaccharide、 FOS)是指在蔗糖分子的果糖残基上以-(1-2)-2糖苷键连接13个果糖分子而形成的蔗果三糖(12Kestose,GF2)、 蔗果四糖(Nystose,GF3)、 蔗果五糖(1F2fructofuranosylnystose,GF4)及其混合物。低聚果糖具有独特的生理功能

2、(如双歧杆菌增殖因子作用、 低热值、 防龋齿等)、 优良的物化性质及良好的食品加工特性,受到学者的重视。80年代日本对低聚果糖的代谢、 组成、 应用和工业化生产做了多方面的研究。1984年,日本明治制果株式会社用固定化增殖细胞实现了低聚果糖的工业化生产,推出了两种名为”明治低聚G(NeosugarG)”和”明治低聚P(NeosugarP)”的低聚果糖产品,表1显示两种产品的组成:表1两种产品的组成(%,干基)产品G+FGFGF2GF3GF4GF24明治低聚G明治低聚P注:G:葡萄糖;F:果糖;GF:蔗糖;GF2:蔗果三糖;GF3:蔗果四糖;GF4:蔗果五糖;GF24:GF2+GF3+GF4低聚

3、果糖的生产主要涉及两种酶:果糖转移酶和具有高果糖转移活性的呋喃果糖苷酶。进入90年代以来,国内外学者对低聚果糖的生产工艺条件作了大量的研究工作,取得了可喜的进展。用单一的果糖转移酶或呋喃果糖苷酶作用于蔗糖生产低聚果糖(单酶法),即使在最优条件下,由于副产物葡萄糖对呋喃果糖苷酶的抑制作用,蔗糖不可能完全转化,因此产物中低聚果糖的含量一般在50%60%,还含有30%左右的葡萄糖和10%左右的蔗糖。为了特殊的目的如供糖尿病患者食用必须使用高纯度的低聚果糖如明治低聚P。当前获得高纯度低聚果糖的方法有两种:一是用单酶法制得含50%60%低聚果糖的糖浆,然后用适当的方法去除其中的葡萄糖而得到高纯度的低聚果

4、糖,可称为两步法;一是使用双酶法或混合酶系在蔗糖转化反应过程中同时消除葡萄糖的抑制作用使蔗糖充分转化,同时葡萄糖转化为其它较易除去的形式,再经过简单的分离纯化得到高纯度的低聚果糖,可称为一步法。其中两步法生产高纯度低聚果糖的成本高,资料显示明治低聚的价格是明治低聚的218倍。一步法还处于探索中,可是探索新的生产工艺、 提高酶反应过程中蔗糖的转化率和低聚果糖的含量生产高含量的低聚果糖在经济性上可能是有益的。本文结合作者的部分研究工作及国内外学者已经进行的高纯度低聚果糖的生产技术研究情况对高纯度低聚果糖的可行生产工艺作一探讨。1低聚果糖的生物合成机制JongWonYun综述了不同来源的呋喃果糖苷酶

5、或果糖转移酶催化蔗糖转化为低聚果糖的机制。不同来源的酶的催化作用机制不同,概括起来大多数微生物果糖转移酶的催化作用分两步进行:第一步形成酶-果糖复合物,释出葡萄糖;第二步该复合物将果糖转移给水或蔗糖生成果糖或三糖。低聚果糖的生物合成机制可表示如下:GF+EnzFEnz+G(1)F-Enz+H2OF+Enz(2)F-Enz+GFn-1GFn+Enz(3)(n=2, 3, 4) 其中Enz:呋喃果糖苷酶或果糖转移酶;GF:蔗糖;F-Enz:果糖-酶复合物;G:葡萄糖;F:果糖;GFn:低聚果糖。在低聚果糖的生物合成两步反应中,第一步为快速可逆反应,第二步为不可逆反应,蔗糖既是果糖基的供体又是果糖基

6、的受体。在反应(1)中,蔗糖在酶的作用下分解成果糖基的葡萄糖,该反应为必须步骤,故酶反应产物中葡萄糖的存在是不可避免的;另外研究者发现葡萄糖抑制酶的果糖转移活性,0.9%5.4%( W/V) 的葡萄糖即抑制黑曲霉ACTT20611呋喃果糖苷酶的果糖转移反应,Ki=0.12mol/L,因此蔗糖不能完全转化。为了提高蔗糖的转化率和产物中低聚果糖的含量就必须设法消除副产物葡萄糖的抑制作用,这是一步法高纯度低聚果糖生产技术的关键。在两步反应中能够看出,蔗糖(n=2)浓度较低时将主要发生反应(2),总的结果是蔗糖水解为葡萄糖和果糖,因此为了提高酶反应产物中低聚果糖的浓度就必须提高蔗糖浓度以抑制反应(2)

7、的发生。2酶源选择和产酶工艺条件优化一个好的酶源是生产低聚果糖的保证,对产酶发酵工艺条件进行优化是使酶源的产酶能力得到最大程度的发挥,从而得到大量而廉价的呋喃果糖苷酶或果糖转移酶。2.1酶源的选择一个好的酶源应具有以下几个特征:(1)高的果糖转移活性; (2)果糖转移活性与蔗糖水解活性之比(即Ut/Uh)大; (3)区域专一性高,如图1只生成1-蔗果三糖(1-kestose);(4)产酶能力大。图1酶的专一性示意图许多植物、 酵母、 霉菌等均能产生呋喃果糖苷酶或果糖转移酶,但植物产生的酶的活性低且产量受季节的限制;而酵母转化酶水解活性较强不利于低聚果糖的积累,故工业生产中使用的产酶菌多为霉菌,

8、如黑曲霉ACTT20611、 臭曲霉NRRL4337、 日本曲霉TIT-KJ1等。作者等从土壤中分离出一株具有高果糖转移活性的菌株黑曲霉ECBT-3,测定条件下比酶活达0.450U/mg湿细胞,Ut/Uh达14.2,具有严格的区域专一性只生成1-蔗果三糖系产物。2.2产酶工艺条件优化对产酶工艺进行优化的目的在于使产酶菌的产酶能力得到最大程度的发挥,影响酶产率的因素主要有培养时间、 碳源浓度、 氮源浓度和无机盐浓度等。2.2.1培养时间黑曲霉ECBT-3在摇床培养条件下,间隔24h取样测定发酵液中细胞密度、 胞内酶活等,结果如图2。最佳培养时间为72h,与黑曲霉ACTT20611及黑曲霉AS-0

9、023相同。2.2.2碳源浓度呋喃果糖苷酶是诱导酶,培养基中初始蔗糖的浓度对酶产率有较大的影响;另一方面,蔗糖浓度过高会抑制菌体的生长,图3显示蔗糖浓度对酶产率的影响。蔗糖最佳浓度为15%20%。蔗糖浓度太高、 渗透压太大不利于菌体生长。WenChangchen报道了相似的结果。2.2.3无机盐作者发现添加K2HPO4及MgSO47H2O对黑曲霉ECBT-3的酶产率无明显影响,与S.Hayashi等的结果不同。添加适量硝酸钠能够明显提高酶产率。图2培养时间对酶产率的影响图3蔗糖浓度对酶产率的影响3两步法生产高纯度低聚果糖3.1低聚果糖的生成在50%60%的蔗糖溶液中加入25U/g蔗糖的呋喃果糖

10、苷酶或果糖转移酶,用缓冲溶液调节pH5.06.0,保温5060,反应2024h即制得含50%60%的低聚果糖,为了重复利用酶一般采用固定化酶(IE)或固定化细胞(IC)(或菌丝体(IM),而让高浓度的蔗糖溶液以一定流速流过固定化酶柱或填充床式反应器,表2显示近年来开发的低聚果糖生产工艺。3.2两步法生产高纯度低聚果糖表2近年来开发的低聚果糖生产工艺酶源底物操作方式FOSS含量( %) 操作稳定性黑曲霉500g/L蔗糖分批-连续( IC) 50%-55%30d屈芽短梗菌600g/L蔗糖连续( IE) 55%30d日本曲霉250g/L蔗糖外循环分批( IM) 55%35d屈芽短梗菌770g/L蔗糖

11、分批( IC) 55%60批黑曲霉300g/L蔗糖分批( IM) 55%-曲霉500g/L蔗糖分批( IE) 61%-日本曲霉650g/L蔗糖分批( IM) 61.28%23批如表2所示,由于副产物葡萄糖的抑制作用,产物中低聚果糖的含量仅为5060%。要提高低聚果糖的含量,能够对上述50%60%的低聚果糖进行分离纯化去除其中的单糖(葡萄糖和果糖),方法是用碳柱层析或碳柱层析和制备性HPLC串联,可得到95%的低聚果糖。但几种使用市售离子交换树脂柱层析分离过程的回收率都很低而不适于大生产。另一种两步法生产高纯度低聚果糖的工艺是用葡萄糖氧化酶(GOD)(或葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶(CAT)协同作用

12、)将单酶法制得的低聚果糖糖浆中的葡萄糖转化为葡萄糖酸,然后用离子交换法将葡萄糖酸分离除去,可得87%左右的低聚果糖。该法的工艺过程是:由单酶法得到的50%60%低聚果糖沸水浴灭酶5min,调节总糖浓度至20%(w/v),加入GOD,GOD用量为50U/g总糖,水浴保持温度35,反应过程中连续搅拌,通气,并滴加1mol/LNaOH溶液中和释放出的葡萄糖酸以使pH保持5.0左右,反应20h后,加热灭酶活。或调节总糖浓度为30%(w/v),按50U/g总糖和725U/g总糖的比例加入GOD和CAT,水浴保温30,搅拌并通气,滴加NaOH控制pH5.0,定时取样用HPLC分析反应体系中的总低聚果糖、

13、葡萄糖和蔗糖的变化。反应过程中低聚果糖的含量不断上升,葡萄糖的浓度不断下降,而蔗糖的浓度基本不变,反应至16h葡萄糖的浓度降至0,表3显示单酶法、 GOD、 GOD+CAT去除葡萄糖后产品中成分的比较。表3单酶法、 GOD、 GOD+CAT除去葡萄糖后的成分比较(%,w/v)方法GGFGF2GF3GF4GF5单酶法31.4011.9627.7924.474.3856.64GOD26.1112.6330.0225.565.6861.26GOD+ACT未检出13.0842.4337.526.9786.92GOD和CAT协同作用去除葡萄糖后,产品中总低聚果糖的含量比单酶法提高了53.5%,但该法尚存

14、在不少问题,如GOD和CAT的最佳用量、 最适pH、 最适反应温度等有待研究,特别是GOD和CAT的用量直接关系到该过程的经济性。另一方面最终产物中蔗糖的浓度并没有降低,原因是第一步单酶法生产低聚果糖的过程中产生的葡萄糖抑制了果糖转移酶使蔗糖不能进一步转化,但该法的优点是两步均可在最优条件下操作。4一步法生产高纯度低聚果糖该法又能够称为双酶法或混合酶系法,指在反应体系中同时加入果糖转移酶(FTase)(或呋喃果糖苷酶(FFase)和另一种或两种能把葡萄糖转化为其它形式的酶使其协同作用,部分或全部消去葡萄糖的抑制作用,从而提高蔗糖的转化率得到高纯度的低聚果糖。转化葡萄糖的酶一般是葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶(GI),表4显示一步法生产高纯度低聚果糖的研究现状。4.1FFase(或FTase)和GOD协同作用由表4可知,FFase(或FTase)和GOD协同作用特别FFase同GOD协同作用是生产高纯度低聚果糖的有