植物细胞大规模培养最新

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1、第十二章植物细胞大规模培养第十二章植物细胞大规模培养 教教 学学 内内 容容 1、植物细胞培养基 2、植物细胞培养方法 3、植物细胞的大规模培养技术 4、影响植物细胞培养的因素 5、植物细胞培养反应器前前 言言 植植物物中中含含有有数数量量极极为为可可观观的的次次代代谢谢物物质质。据据保保守守的的估估计计，目目前前已已发发现现的的植植物物天天然然代代谢谢物物已已超超过过2万万种种，而而且且还还在在以以每每年年新新发发现现1600种种的的速速度度递递增增。我我们们祖祖先先在在与与疾疾病病的的抗抗争争中中已已各各积积累累了了丰丰富富的的利利用用植植物物中中的的生生物物活活性性物物质质治治病病强强身

2、身的的经经验验。李李时时珍珍（1953）编编纂纂的的巨巨著著本本草草纲纲目目中中所所开开列列的的1892种种药药物物绝绝大大多多数数是是植植物物。目目前前仍仍约约25%的的法法定定药药品品来来自自植植物物。然然而而植植物物生生长长缦缦慢慢，自自然然灾灾害害频频繁繁。即即使使是是大大规规模模人人工工栽栽培培仍仍然然不不能能从从根根本本上上满满足足人人类类对对经经济济植植物物日日益益增增长长的的需需求求。因因此此早早在在1956年年，Routier和和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。第十二章第十二章 植物细胞的大

3、规模培养植物细胞的大规模培养 中草药中草药 Reinhard等等（1968）首首先先将将这这种种设设想想转转变变成成现现实实，生生产产出出了了哈哈尔尔碱碱(harmine)。紧紧接接着着Kaul等等（1969）、Furrya等等(1972)和和Teuscher等等（1973）分分别别培培养养植植物物细细胞胞获获取取了了其其中中的的薯薯蓣蓣(yu山山药药）皂皂苷苷、人人参参皂皂角角苷苷和和维维斯斯纳纳精精（visnagin）。现现在在一一些些发发达达国国家家已已集集中中相相当当数数量量的的人人力力、财财力力潜潜心心开开拓拓这这个个经经济济潜潜力力十十分分巨巨大大的的生生产产领领域域。目目前前世世

4、界界最最大大批批量量工工业业化化培培养养细细胞胞（烟烟草草细细胞胞）已已达达2万万升升（20吨吨）。我我国国在在“八八五五”、“九九五五”和和“863计计划划”中中连连续续拨拨款款资资助助工工业业化化培培养养红红豆豆杉杉细细胞胞生生产产抗抗肿肿瘤瘤药药物物紫杉醇紫杉醇的研究，目前已达到的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。的世界先进水平。植植物物细细胞胞培培养养是是指指在在离离体体条条件件下下将将愈愈伤伤组组织织或或其其他他易易分分散散的的组组织织置置于于液液体体培培养养基基中中，将将组组织织振振荡荡分分散散成成游游离离的的悬悬浮浮细细胞胞，通通过过继继代代培培养养使使细细胞胞增增殖殖

5、来来获获得得大大量量细胞群体的方法。细胞群体的方法。鉴鉴于于有有些些产产物物的的唯唯一一来来源源只只能能是是植植物物，而而许许多多有有价价值值的的植植物物只只能能生生长长在在某某一一特特定定的的地地理理区区域域，且且受受到到很很多多自自然然条条件件的的限限制制和和影影响响，尤尤其其是是有有些些植植物物从从种种植植到到收收获获要要花花几几年年时时间间，很很难难满满足足需需要要。采采用用大大规规模模植植物物细细胞胞培培养养技技术术就就可可以以直直接接生生产产这这些些产产物物。如如可可作作为为药药物物和和染染料料的的紫紫草草宁宁就就是是典典型型的的通通过过大大规规模模植植物物细细胞胞培培养养生生产产

6、的的产产品品，通通过过大大规规模模培培养养紫紫草草细细胞胞短短时时间间内内就就可可大大量量生生产产紫紫草草宁宁。表表12-1是是植植物物细细胞胞培培养和从完整的植物生产紫草宁的比较。养和从完整的植物生产紫草宁的比较。表表表表12-112-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式生产方式收获时间收获时间紫草宁浓度（紫草宁浓度（%干重）干重）完整植物完整植物2-3a2-3a1-21-2植物细胞培养植物细胞培养21d21d1414 目目前前，植植物物细细胞胞培培养

7、养技技术术已已在在农农业业、医医药药、食食品品、化化妆妆品品、香香料料等等领领域域广广泛泛用用于于大大规规模模生生产产有有价价值值的的产产品品。小小规规模模的的细细胞胞培培养养通通常常在在培培养养瓶瓶中中完完成成，而而大大规规模模的的培培养可在发酵罐中进行。养可在发酵罐中进行。问题问题请列举出请列举出3至至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷薯蓣皂苷、人参皂角苷人参皂角苷和和维斯纳维斯纳精（精（visnagin）与与动动物物细细胞胞培培养养相相比比，植植物物细细胞胞培培养养的的最最大大

8、优优点点是是植植物物细细胞胞可可以以在在简简单单的的合合成成培培养养基基上上正正常常生生长长。用用于于植植物物细细胞胞培培养养的的基基础础培培养养基基成成分分基基本本上上与与整整个个植植物物的的要要求求一一样样，但但是是用用于于培培养养细细胞胞、组组织织和和器器官官的的培培养养基基需需要要满满足足各各自自的的特特殊殊要要求求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。一、植物细胞培养基 植植物物细细胞胞培培养养基基通通常常包包括括无无机机盐盐、碳碳源源、维维生生素素、生生长长调调节节素素和和有有机机添添加

9、加剂剂等。等。无机盐类无机盐类 包括：包括：无机盐浓度一般为多少？无机盐浓度一般为多少？微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。碳源和能源碳源和能源 P225 维维生生素素 植植物物细细胞胞的的生生长长都都需需要要硫硫胺胺素素。可可在在植植物物细细胞胞培培养养基基中中加加入入烟烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养原生质体培养通常需要大多数必需维生素。通常需要大多数必需维生素。1、植物细胞培养基的组成、植物细胞培养基的组成 植植物物生生长长激激素素 大大多多数数植植物物细细胞胞培培养养基基中

10、中都都含含有有天天然然的的或或合合成成的的植植物物生生长长激激素。生长激素包括了素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。等四大类。有有机机氮氮源源 通通常常采采用用的的有有机机氮氮源源有有蛋蛋白白质质水水解解物物、谷谷氨氨酰酰胺胺或或氨氨基基酸酸混混合合物物等。等。P225 有有机机酸酸 加加入入丙丙酮酮酸酸，或或者者柠柠檬檬酸酸、苹苹果果酸酸和和琥琥珀珀酸酸等等三三羟羟酸酸循循环环的的中中间间产产物物，能能够够保保证证植植物物细细胞胞在在以以铵铵盐盐作作为为单单一一氮氮源源的的培培养养基基上上生生长长，并并且且使使细细胞胞对对钾

11、钾盐盐的的耐耐受受能能力力至至少少提提高高到到10mmol/l。除除此此之之外外，这这些些有有机机酸酸还还能能提提高高低低密密度度接种的细胞和原生质体的生长。接种的细胞和原生质体的生长。复复合合物物质质 在在植植物物细细胞胞的的培培养养过过程程中中，酶酶母母抽抽提提液液、麦麦芽芽抽抽提提液液、椰椰子子汁汁和和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。目目前前应应用用最最广广的的基基础础培培养养基基主主要要有有MS、B5、E1以以及及N6培培养养基基。表表12-2列列出出了了这几种常用的植物细胞培养基。这几种常用的植物细胞培养基。1、植物细胞培养基组成包

12、括、植物细胞培养基组成包括 等。等。问题问题2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？2、植物细胞培养基的制备、植物细胞培养基的制备 制制备备培培养养基基时时，培培养养基基中中使使用用无无机机盐盐、碳碳源源、维维生生素素、有有机机酸酸和和植植物物生生物物激激素素都都应应该该采采用用最最高高纯纯度度级级的的试试剂剂和和药药品品。有有些些生生长长激激素素在在使使用用前前需需要要进进行行重重结结晶晶提提纯纯。由由于于一一些些生生长长激激素素难难溶溶于于水水，配配制制时时可可先先溶溶于于2-5ml的的酒酒精精中中，其其酒酒精精

13、-水水溶溶液液要要用用吸吸附附法法进进行行脱脱色色处处理理，然然后后慢慢慢慢加加入入蒸蒸馏馏水水，稍稍微微加加热热后后，再再稀稀释释至至所所需体积。需体积。配配制制培培养养基基的的用用水水应应严严格格地地采采用用蒸蒸馏馏水水或或高高纯纯度度的的去去离离子子水水，其其中中以以玻玻璃璃器器皿皿制制备备的的蒸蒸馏馏水水最最好好。培培养养基基的的PH值值应应用用0.5m0l.l-1的的HCL或或0.2 m0l.l-1的的NaOH进进行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。配配制制好好的的培培养养基基按按要要求求装装入入三三角角瓶瓶或或试试管管中中，121

14、下下灭灭菌菌20min，待待冷冷却却后后就就可可以以使使用用。对对于于一一些些热热敏敏性性化化合合物物，如如L-谷谷氨氨酰酰胺胺、植植物物生生长长激激素素等等，灭灭菌菌时时不不可采用加热法，而应该采用可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。植物细胞培养基的制备植物细胞培养基的制备是非常严格的是非常严格的植物细胞培养基制备时对水有哪些植物细胞培养基制备时对水有哪些严格要求？严格要求？问题问题 由由于于培培养养基基中中的的组组份份种种类类繁繁多多，且且一一些些组组份份量量很很小小，配配制制起起来来很很繁繁锁锁，因因此此

15、往往往往把把培培养养基基配配制制成成使使用用浓浓度度的的10或或100倍倍的的母母液液，使使用用时时再再按按需需要要稀稀释释至至使使用用浓浓度度。培培养养基基母母液液或或经经稀稀释释后后的的培培养养基基应应置置于于冰冰箱箱内内，在在10度度以以下下保保存存待待用用。一一般般含含有有有有机物或激素类物质机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十不超过十天。天。在在培培养养基基配配制制过过程程中中需需要要注注意意的的是是，为为了了防防止止在在高高浓浓度度下下，培培养养基基份份间间相相互互作作用用产产生生沉沉淀淀，诸诸如如CaCL2、KI、EDTA的的钠

16、钠或或亚亚铁铁盐盐需需要要单单独独配配制制保保存存，使使用用时时再再稀释混合。稀释混合。二、植物细胞培养方法 原生质体培养：原生质体培养：植植物物的的体体细细胞胞（二二倍倍体体细细胞胞）经经过过纤纤维维素素酶酶处处理理后后可可去去掉掉细细胞胞壁壁，获获得得的的去去壁壁细细胞胞称称为为原原生生质质体体。该该原原生生质质体体在在良良好好的的无无菌菌培培养养基基中中可可以以生生长长、分分裂裂，最最后后可可以以长长成成植植株株。实实际际过过程程中中，可可以以用用不不同同植植物物的的原原生生质质体体进进行行融融合合与与体体细细胞胞杂杂交交，由由此此可可获得体细胞杂交的植株获得体细胞杂交的植株。植物因受创

17、伤而在伤口附近产生的薄壁组织植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织 植植物物细细胞胞培培养养方方法法主主要要有有-等。等。单倍体细胞培养：单倍体细胞培养：主主要要用用花花药药在在人人工工培培养养基基上上进进行行培培养养，可可以以从从小小孢孢子子（雄雄性性生生殖殖细细胞胞）直直接接发发育育成成胚胚状状体体，然然后后长长成成单单倍倍体体植植株株；或或者者是是通通过过愈愈伤伤组组织织诱诱导导分分化化出出芽芽和和根根，最最终终长成植株。长成植株。固体培养：固体培养：固固体体培培养养是是在在微微生生物物培培养养的的基基础础上上发发展展起起来来的的植植物物细细胞胞培培养养方方法法。固固体体培培养养基基的的

18、凝凝固固剂剂除除特特殊殊研研究究外外，几几乎乎都都使使用用琼琼脂脂，浓浓度度一一般般为为6%-10%。接接种种材材料料放放在在培培养养基基上上，原原生生质质体体固固体体培培养养则则需需混混入入培培养养基基内内进进行行嵌嵌合合培培养养，或或者者使使原原生生质质体体在在固固体体-液液体体之之间间进行双相培养。进行双相培养。液体培养：液体培养：液液体体培培养养也也是是在在微微生生物物培培养养的的基基础础上上发发展展起起来来的的植植物物细细胞胞培培养养方方法法。液液体体培培养养可可分分为为静静止止培培养养和和振振荡荡培培养养等等两两类类。静静止止培培养养不不需需要要任任何何设设备备，适适合合于于某某些

19、些原原生生质质体体的的培培养养。振荡培养需要振荡培养需要摇床或转床摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交换。等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交换。悬浮培养：悬浮培养：（主要）（主要）植植物物细细胞胞的的悬悬浮浮培培养养是是一一种种使使组组织织培培养养物物分分离离成成单单细细胞胞并并不不断断扩扩增增的的方方法法。在在进进行行细细胞胞培培养养时时，需需要要提提供供容容易易破破裂裂的的愈愈伤伤组组织织进进行行液液体体振振荡荡培培养养，愈愈伤伤组组织织经经过过悬悬浮浮培培养养可可以以产产生生比比较较纯纯一一的的单单细细胞胞。用用于于悬悬浮浮培培养养的的愈愈伤伤组组织织应应

20、该该是是易易碎碎的的，这这样样在在液液体体培培养养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。固定化培养固定化培养 主要主要 固固定定化化培培养养是是在在微微生生物物和和酶酶的的固固定定化化培培养养基基础础上上发发展展起起来来的的植植物物细细胞胞培培养养方方法法。该该法法与与固固定定化化酶酶或或微微生生物物细细胞胞类类似似，应应用用最最广广泛泛的的、能能够够保保持持细细胞胞活活性性的的固固定定化化方方法法是是将将细胞包埋于细胞包埋于海藻酸盐海藻酸盐或或卡拉胶卡拉胶中。中。三、植物细胞的大规模培养技术 目

21、目前前用用于于植植物物细细胞胞大大规规模模培培养养的的技技术术主主要要有有植植物物细细胞胞的的大大规规模模悬悬浮浮培培养养和和植植物物细胞或原生质体的细胞或原生质体的固定化培养固定化培养。1、植物细胞的大规模悬浮培养、植物细胞的大规模悬浮培养 前前者者适适于于大大量量快快速速地地增增殖殖细细胞胞，但但往往往往不不利利于于次次生生物物质质的的积积累累；后后者者则则相相反反，细细胞生长缓慢而胞生长缓慢而次生物质含量相对较高次生物质含量相对较高。1953年年Muir成成功功地地对对烟烟草草和和直直立立万万寿寿菊菊的的愈愈伤伤组组织织进进行行了了悬悬浮浮培培养养。继继之之Tulecke和和Nickel

22、l（1959）推推出出了了一一个个20L的的植植物物细细胞胞封封闭闭式式悬悬浮浮培培养养系系统统。经经蒸蒸汽汽灭灭菌菌后后接接入入目目的的培培养养物物，以以无无菌菌压压缩缩空空气气进进行行搅搅拌拌。当当营营养养耗耗尽尽，细细胞胞数数目目不不再再增增加加且且次次生生物物质质达达一一定定含含量量时时，收收获获细细胞胞，提提取取产产物物。他他们们用用此此系系统统成成功功地地培培养养了了银银杏杏、冬冬青青、黑黑麦麦草草和和蔷蔷薇薇等等细细胞胞。结结构构简简单单，易易于于操操作作是是本本系系统统的的突突出出优优点点。但但它它的的生生产产效效率率不不够够高高，次生物质累积的量也较少。次生物质累积的量也较少

23、。阅读课本P228-23010分钟悬浮培养中的植物细胞的特性悬浮培养中的植物细胞的特性 由由于于植植物物细细胞胞有有其其自自身身的的特特性性，尽尽管管人人们们已已经经在在各各种种微微生生物物反反应应器器中中成成功功地地进进行了植物细胞的培养，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养是不同的。行了植物细胞的培养，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养是不同的。植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的流变特性 1、在悬浮培养时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团形式存在？、在悬浮培养时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团形式存在？问题问题2、植物细胞以细胞团形式存在存在原因？、植物细胞以细胞团形

24、式存在存在原因？3、人们常用粘度这一参数来描述植物细胞培养液的流变学特征，培养液粘度、人们常用粘度这一参数来描述植物细胞培养液的流变学特征，培养液粘度的变化主要是由于什么引起，而不是分泌物引起？的变化主要是由于什么引起，而不是分泌物引起？植物细胞培养过程中的氧传递植物细胞培养过程中的氧传递 由由上上述述情情况况可可以以看看出出，氧氧对对植植物物细细胞胞的的生生长长来来说说是是很很重重要要的的，但但是是CO2的的含含量量水水平平对对细细胞胞的的生生长长同同样样相相当当重重要要。研研究究发发现现，植植物物细细胞胞能能非非光光合合地地固固定定一一定定浓浓度度的的CO2，如如在在空空气气中中混混以以2

25、%-4%的的CO2能能够够消消除除高高通通气气速速率率对对长长春春花花细细胞胞生生长长和和次次级级代代谢谢物物产产率率的的影影响响。因因此此，对对植植物物细细胞胞培培养养来来说说，在在要要求求培培养养液液充充分分混混合合的的同同时时，CO2和和氧氧气气的的浓浓度度只只有有达达到到某某一一平平衡衡时时，才才会会很很好好地地生生长长，所所以以植植物物细细胞胞培培养养有有时时间需要通入一定量的间需要通入一定量的CO2等气体。等气体。把课本的两句话划线把课本的两句话划线4、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利原因？、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利原因？5、植物细胞培养时为什么有时要通入一定量

26、的、植物细胞培养时为什么有时要通入一定量的CO2气体？气体？泡沫和表面粘附性泡沫和表面粘附性 6、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？悬浮细胞的生长与增殖悬浮细胞的生长与增殖 悬悬浮浮培培养养时时细细胞胞的的生生长长曲曲线线如如图图12-1所所示示，细细胞胞数数量量随随着着时时间间的的变变化化曲曲线线呈呈现现S形形。在在细细胞胞接接种种到到培培养养基基中中最最初初的的时时间间内内细细胞胞很很少少分分裂裂，经经历历一一个个延延迟迟期期后后进进入入对对数数生生长长期期和和细细胞胞迅迅速速增增殖殖的的直直线线生生长长期期，接接着着是是细细胞胞增增殖殖减减慢慢的的的的

27、减减慢慢期期和和停停止止生生长长的的静静止止期期。整整个个周周期期经经历历时时间间的的长长短短植植物物种种类类和和起起培培养养细细胞胞密密度度的的不不同同而而不不同同。在在细细胞胞培培养养过过程程中中，一一般般在在静静止止期期或或静静止止期期前前后后进进行行继继代代培培养养，具具体体时时间间可可根根据据静静止期细胞活力的变化而定止期细胞活力的变化而定。图图12-1 悬浮培养时细胞的生长曲线悬浮培养时细胞的生长曲线0培养时间（d）细细胞胞数数静止期静止期减慢期减慢期直线生长期直线生长期对数生长期对数生长期延滞期延滞期 由由于于悬悬浮浮培培养养具具有有：增增加加培培养养细细胞胞与与培培养养液液的的

28、接接触触面面，改改善善营营养养供供应应；可可带带走走培培养养物物产产生生的的有有害害代代谢谢产产物物，避避免免有有害害代代谢谢产产物物局局部部浓浓度度过过高高等等问问题题；保保证证氧氧的的充充分分供供给给等等三三个个基基本本优优点点，使使悬悬浮浮培培养养细细胞胞的的生长条件比固体培养有很大的改善。生长条件比固体培养有很大的改善。细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生 悬悬浮浮培培养养的的单单个个细细胞胞在在3-5d内内即即可可见见细细胞胞分分裂裂，经经过过一一星星期期左左右右的的培培养养，单单个个细细胞胞和和小小的的聚聚集集体体不不断断分分裂裂而而形形成成肉肉

29、眼眼可可见见的的小小细细胞胞团团。大大约约培培养养两两周周后后，将将细细胞胞分分裂裂再再形形成成的的小小愈愈伤伤组组织织团团块块及及时时转转移移到到分分化化培培养养基基上上，连连续续光光照照，三三星星期期后后可可分分化出试管苗。化出试管苗。表表表表12-112-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式生产方式收获时间收获时间紫草宁浓度（紫草宁浓度（%干重）干重）完整植物完整植物2-3a2-3a1-21-2植物细胞培养植物细胞培养21d21d1414 紫紫杉杉

30、醇醇是是近近年年发发现现的的重重要要的的抗抗癌癌药药物物，能能有有效效地地治治疗疗卵卵巢巢癌癌、乳乳腺腺癌癌等等妇妇科科癌癌症症。但但由由于于紫紫杉杉醇醇是是从从珍珍稀稀植植物物紫紫杉杉提提取取的的，所所以以如如何何得得到到充充足足的的药药物物一一直直是是医医学学和和环环境境学学家家争争论论的的问问题题。紫紫杉杉醇醇的的生生产产只只能能通通过过大大量量的的砍砍伐伐这这种种珍珍稀稀植植物物，这这显显然然将将对对环环境境产产生生不不良良影影响响。所所以以目目前前科科学学家家们们正正在在开开展展紫紫杉杉醇醇细细胞胞培培养养法法进进行行生生产产和和研研究究。我我国国在在“八八五五”、“九九五五”和和“

31、863计计划划”中中连连续续拨拨款款资资助助工工业业化化培培养养和和生生产产抗肿瘤药物紫杉醇抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。的世界先进水平。复习复习请列举出请列举出3至至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷薯蓣皂苷、人参皂角苷人参皂角苷和和维斯纳维斯纳精（精（visnagin）2、植物细胞或原生质体的固定化培养、植物细胞或原生质体的固定化培养 由由于于固固定定化化植植物物细细胞胞培培养养比比自自由由悬悬浮浮细细胞胞培培养养具具有有较较高高

32、的的机机械械稳稳定定性性、产产率率，更更长长的的稳稳定定（生生产产期期）等等许许多多优优点点，因因此此，通通常常采采用用固固定定化化来来进进行行植植物物细细胞胞的的培培养。这类培养包括了植物细胞和原生质体的固定化培养。养。这类培养包括了植物细胞和原生质体的固定化培养。植物细胞固定化的常用方法有哪些？问题问题 细细胞胞固固定定化化是是将将细细胞胞包包埋埋在在惰惰性性支支持持物物的的内内部部或或贴贴附附在在它它的的表表面面。其其前前提提就就是是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。通过悬浮培养获得足够数量的细胞。针针对对上上述述细细胞胞悬悬浮浮培培养养的的缺缺点点，Brodelius等等（1979）首首

33、次次报报道道了了用用海海藻藻酸酸钙钙成成功功固固定定培培养养橘橘叶叶鸡鸡眼眼藤藤、长长春春花花、希希腊腊毛毛地地黄黄细细胞胞。实实验验证证明明，细细胞胞分分化化和和次次生生物物质质积积累累之之间间存存在在正正相相关关性性。细细胞胞固固定定化化后后的的密密集集而而缓缓慢慢的的生生长长有有利利细细胞胞的的分分化化和和组组织织化化，从从而而有有利利于于次次生生物物质质的的合合成成。此此外外，细细胞胞固固定定化化后后不不仅仅便便于于对对环环境境因因子子的的参参数数进进行行调调控控，而而且且有有利利于于在在细细胞胞团团间间形形成成各各种种化化学学物物质质和和物物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关

34、键理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。海藻细胞的固定化海藻细胞的固定化 为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？问题问题 以下简要介绍褐藻钙固定植物细胞的技术路线：以下简要介绍褐藻钙固定植物细胞的技术路线：大量培养植物细胞大量培养植物细胞 混合混合 倒入塑料注射器倒入塑料注射器 慢慢滴入含氯化钙的培养基慢慢滴入含氯化钙的培养基一定浓度的海藻酸钠溶液一定浓度的海藻酸钠溶液 海藻酸钙固定的细胞团海藻酸钙固定的细胞团 小小规规模模固固定定化化小小规规模模的的植植物物细细胞胞固固定定化化可可用用无无菌菌的的塑塑料料注注射射器器进进行

35、行。配配制制一一定定浓浓度度的的海海藻藻酸酸钠钠溶溶液液，高高温温、高高压压灭灭菌菌。通通过过离离心心或或过过滤滤收收集集植植物物细细胞胞，将将细细胞胞悬悬浮浮于于海海藻藻酸酸钠钠溶溶液液混混合合，倒倒入入塑塑料料注注射射器器中中，慢慢慢慢滴滴入入到到含含有有CaCl2的的培培养养基基中中，不不断断搅搅拌拌，使使之之形形成成球球形形颗颗粒粒，然然后后通通过过过过滤滤收收集集颗颗粒粒，用用含含有有CaCl2的的培培养养基基清清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。图图12-2大规模植物细胞固定化装置大规模植物细胞固定化装置含含CaCl2的培养基的培养基盖子盖

36、子空气出口空气出口海藻酸钠海藻酸钠+细胞悬浮液细胞悬浮液喷嘴喷嘴无菌空气入口无菌空气入口 大大规规模模固固定定化化植植物物细细胞胞的的大大规规模模固固定定化化原原则则上上可可根根据据上上述述方方法法进进行行，但但是是不不能能再再用用塑塑料料注注射射器器，而而需需要要采采用用如如图图12-2所所示示的的大大规规模模细细胞胞固固定定化化装装置置进进行行细细胞胞的的固固定定化。化。卡拉胶固定化卡拉胶固定化 P230 琼脂糖固定化琼脂糖固定化 P231 琼脂固定化琼脂固定化P231 由由于于原原生生质质体体比比完完整整的的细细胞胞更更脆脆弱弱，因因此此，只只能能采采用用最最温温和和的的固固定定化化方方

37、法法进进行行固固定化。通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。定化。通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。原生质体的固定化原生质体的固定化1、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？问题问题2、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？3、在植物细胞固定化的四种方法，哪些方法需要其它离子来保持胶的稳、在植物细胞固定化的四种方法，哪些方法需要其它离子来保持胶的稳定性？分别用什么离子？定性？分别用什么离子？总总之之，人人类类迄迄今今通通过过植植物物细细胞胞培培养养获获得得的的生生物物碱碱、维维生生素素、色色素素

38、、抗抗生生素素以以及及抗抗肿肿瘤瘤药药物物不不下下50多多个个大大类类，其其中中已已有有30多多种种次次生生物物质质的的含含量量在在人人工工培培养养时时已已达达到到或或超超过过亲亲本本植植物物的的水水平平。在在已已研研究究过过的的200多多种种植植物物细细胞胞培培养养物物中中，已已发发现现可可产产生生300余余种种对对人人类类有有用用的的成成份份，其其中中不不乏乏临临床床上上广广为为应应用用的的重重要要药药物物。利利用用培培养养植植物物细细胞胞工工厂厂化化生生产产生生物物天天然然次次级级代代谢谢产产物物的的美美好好前前景景已已经经十十分分清清楚楚地地展展现现在在我我们们面面前前。深深入入发发掘

39、掘我我国国特特有有的的巨巨大大中中草草药药宝宝库库，结结合合现现代代细细胞胞培培养养技技术术，我我国国植植物物细细胞胞次次生生物质的研制与生产一定会硕果累累，后来居上。物质的研制与生产一定会硕果累累，后来居上。3、植物细胞培养方式、植物细胞培养方式 植物细胞的培养方式主要有间歇培养、连续和固定化培养等多种。植物细胞的培养方式主要有间歇培养、连续和固定化培养等多种。间歇培养间歇培养 两级或多级间歇培养两级或多级间歇培养 流加间歇培养流加间歇培养 阅读课本P232-2338分钟固定化细胞培养固定化细胞培养 连续培养连续培养 单级连续培养单级连续培养 多级连续培养多级连续培养 回流式连续培养回流式连

40、续培养 固固定定化化细细胞胞培培养养具具有有许许多多潜潜在在的的优优越越性性，如如能能提提高高生生产产能能力力、保保护护细细胞胞、换换液液方方便、能除去有毒或抑制性代谢物等。这些优越性使固定化细胞培养具有很大的吸引力。便、能除去有毒或抑制性代谢物等。这些优越性使固定化细胞培养具有很大的吸引力。选选用用固固定定化化细细胞胞培培养养应应具具有有如如下下两两个个条条件件：目目的的产产物物应应自自然然分分泌泌到到培培养养液液中中，或或者者通通过过改改变变PH值值、离离子子强强度度或或使使用用渗渗透透剂剂使使之之分分泌泌于于培培养养基基中中；要要求求产产物物的的形形成成在在细胞生长之后。细胞生长之后。四

41、、影响植物细胞培养的因素 植植物物细细胞胞生生长长和和产产物物合合成成动动力力学学也也可可分分三三种种类类型型：生生长长偶偶联联型型，产产物物的的合合成成与与细细胞胞的的生生长长呈呈正正比比；中中间间型型，产产物物仅仅在在细细胞胞生生长长下下降降时时才才能能合合成成，细细胞胞处处于于指指数数生生长长期期时时，次次级级产产物物含含量量下下降降，但但细细胞胞生生长长停停止止时时，产产物物合合成成也也停停止止；非非生生长长偶偶联联型型，产产物物只只有有在在细细胞胞生生长长停停止止时时才才能能合合成成。事事实实上上，由由于于细细胞胞培培养养过过程程较较复复杂杂，细细胞胞生生长长和和次次级级代代谢谢物物

42、的的合合成成很很少少符符合合以以上上模模式式，特特别别是是在在较较大大的的细细胞胞群群体体中中，由由于于各各细细胞胞所所处处的的生生理理阶阶段段不不同同，细细胞胞生生长长和和产产物物合合成成也也许许是是群群体体中中部部分分细细胞胞代代谢谢的的结结果果。此此外外，不同的环境条件对产物动力学也有很大的影响。不同的环境条件对产物动力学也有很大的影响。1、细胞的遗传特性、细胞的遗传特性 对对于于植植物物细细胞胞的的培培养养及及其其产产物物的的合合成成，影影响响细细胞胞培培养养的的因因素素很很多多，除除了了细细胞胞本本身身的特性外，环境等其他因素对细胞的培养也有很大影响。的特性外，环境等其他因素对细胞的

43、培养也有很大影响。阅读课本P233-2348分钟1、在进行植物细胞的培养时，为什么先弄清楚产物的合成部位？、在进行植物细胞的培养时，为什么先弄清楚产物的合成部位？问题问题2、培养的环境条件、培养的环境条件 PH值值 温度温度 营养成分营养成分 光光 2、影响植物细胞培养的环境条件有哪些？、影响植物细胞培养的环境条件有哪些？搅拌和通气搅拌和通气 前体和调节因子前体和调节因子 3、植物细胞培养的温度和、植物细胞培养的温度和PH值一般为多少？值一般为多少？4、一般说，增加、一般说，增加 的含量会使细胞的生长加快，增加培养基的的含量会使细胞的生长加快，增加培养基的 含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物

44、？含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物？5、为什么说机械搅拌造成的剪切对植物细胞影响较大？、为什么说机械搅拌造成的剪切对植物细胞影响较大？6、在植物细胞培养中，生长调节剂有何作用？、在植物细胞培养中，生长调节剂有何作用？7、在植物细胞培养中，加入外源前体物质有何作用？、在植物细胞培养中，加入外源前体物质有何作用？8、植物细胞大规模培养可划分为哪两个阶段？、植物细胞大规模培养可划分为哪两个阶段？值值得得注注意意的的是是，影影响响植植物物细细胞胞培培养养物物的的生生物物量量增增长长和和次次生生代代谢谢物物积积累累的的因因素素是是错错综综复复杂杂的的，往往往往一一个个因因素素的的调调整整会会影影响响

45、到到其其他他因因素素的的变变化化，所所以以，需需要要在在培培养养过过程程中中不不断断加加以以平平衡衡和和研研究究。同同时时，由由于于不不同同的的植植物物有有机机体体有有其其本本身身的的特特殊殊性性，因因此此，对对于于一一种种植植物物或或一一种种次次生生代代谢谢物物合合适适的的条条件件，不不一一定定对对其其他他的的细细胞胞或或次次生生代代谢谢作作用用也也是是合合适适的的。目目的的，对对植植物物细细胞胞大大量量培培养养一一般般分分成成两两个个阶阶段段：第第一一阶阶段段是是利利用用生生长长培培养养基基，尽尽可可能能快快地地使使细细胞胞的的生生物物量量得得到到增增长长；第第二二阶阶段段是是通通过过生生

46、产产培培养养基基来来诱诱发和保持次生代谢作用。发和保持次生代谢作用。五、植物细胞培养反应器 植植物物细细胞胞培培养养用用的的反反应应器器主主要要有有机机械械式式搅搅拌拌生生物物反反应应器器、鼓鼓泡泡塔塔与与气气升升式式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器等。等。1、机械式搅拌生物反应器机械式搅拌生物反应器 (P234)2、鼓泡塔与气升式生物反应器鼓泡塔与气升式生物反应器(P234)3、填充床生物反应器、填充床生物反应器 如如图图12-4（a）是是填填充充床床生生物物反反应应器器。在在填填充充床床生生物物

47、反反应应器器中中，细细胞胞可可以以位位于于支支撑撑物物表表面面，也也可可以以包包埋埋于于支支撑撑物物之之中中，培培养养液液可可以以流流经经支支撑撑物物颗颗粒粒，不不断断被被细细胞胞所所利利用用。填填充充床床生生物物反反应应器器已已被被用用于于植物细胞的培养。植物细胞的培养。（a）（b）出口出口出口出口进口进口进口进口填充床生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器流化床生物反应器 填充床生物反应器的优点在于单位体积固定细胞量大，但是填充床反应器还存在许多缺点，它的混合效果低，对必要的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除

48、的困难，限制了填充床反应器应用于不要求细胞活性的生物转化。2、流化床生物反应器、流化床生物反应器 典典型型的的流流化化床床生生物物反反应应器器是是利利用用流流体体的的能能量量来来悬悬浮浮颗颗粒粒的的。如如图图12-4（b）是是流流化化床床细细胞胞反反应应器器。由由于于使使颗颗粒粒呈呈流流化化状状态态所所需需的的能能量量与与颗颗粒粒大大小小成成正正比比，因因此此，通通常常采采用用小小固固定定化化颗颗粒粒，这这些些小小颗颗粒粒良良好好的的传传质质特特性性是是流流化化床床反反应应器器的的主主要要优优点点。流流化化床床生生物物反反应应器器的的最最大大缺缺点点是是剪剪切切和和颗颗粒粒碰碰撞撞会会损损坏坏

49、固固定定化化细细胞胞。（a）（b）出口出口出口出口进口进口进口进口填充床生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器流化床生物反应器3、膜生物反应器、膜生物反应器 在在植植物物细细胞胞培培养养过过程程中中，主主要要采采用用的的是是中中空空纤纤维维和和螺螺线线式式卷卷绕绕反反应应器器。如如图图12-5所所示示。膜膜反反应应器器的的优优点点是是可可以以重重复复使使用用，因因此此，尽尽管管投投资资较较大大，仍仍较较经经济济。另另外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。细胞细胞细胞细胞营养物入口营养物入口营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物出口营养物出口营养物质营养物质图图12-5 固定化细胞膜反应器固定化细胞膜反应器a-中空纤维反应器中空纤维反应器b-螺线式卷绕反应器螺线式卷绕反应器Thank youThank youENDEND