聚合酶链反应及其应用

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1、52341678 PCR的 原 理 与 反 应 条 件PCR的 DNA聚 合 酶 与 扩 增 的 精 确 性PCR的 模 板 及 制 备PCR的 引 物 设 计 及 合 成PCR反 应 的 其 它 控 制 参 数PCR技 术 的 衍 生 与 发 展PCR技 术 在 生 命 科 学 研 究 中 的 应 用PCR技 术 在 临 床 医 学 方 面 的 应 用聚 合 酶 链 反 应 及 其 应 用 PCR技 术 的 诞 生 与 发 展1 PCR的 原 理 与 反 应 条 件PCR技 术 的 反 应 条 件PCR技 术 的 基 本 原 理PCR反 应 的 质 量 指 标 PCR技 术 的 诞 生 与

2、发 展 聚 合 酶 链 反 应 （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又 称 为 PCR扩 增 技 术 ， 是 一 种 高 效 、 快 速 、 特 异 性 的 体 外 DNA聚 合 程 序 。 1985年 ， 美 国 PE-cetus公 司 人 类 遗 传 研 究 室 的Kary mullis发 明 了 具 有 划 时 代 意 义 的 PCR技 术 ； 1988年 ， 美 国 PE-cetus公 司 推 出 世 界 上 第 一 台PCR热 循 环 仪 ， 从 而 使 PCR反 应 自 动 化 ； 1993年 ， Kary mullis因 发 明 PCR技 术 获

3、 得 诺 贝尔 化 学 奖 ； 1995年 ， 定 量 PCR仪 诞 生 ， 使 定 量 研 究 DNA靶 序 列 成 为 现 实 。 PCR技 术 的 基 本 原 理5 5待 扩 增 DNA区 域 5变 性 加 热5 5引 物退 火5 5底 物聚 合5 55 5加 热变 性5 55 555 555 555 55 55 55退 火 引 物 底 物聚 合 加 热变 性 引 物退 火 底 物聚 合12 3 5 55 PCR技 术 的 反 应 条 件DNA或 RNA模 板 5 5待 扩 增 DNA区 域 594 5 min5 555退 火5 5 聚 合5 55 55 循 环 25-30次目 标 DN

4、A片 段 达 106-107变 性 70DNA引 物DNA聚 合 酶dNTPsMg2+（ 缓 冲 液 ） PCR反 应 的 质 量 指 标 PCR反 应 的 质 量 标 准 有 ：特 异 性 （ 序 列 选 择 ）有 效 性 （ 序 列 产 量 ） 上 述 三 大 标 准 并 非 由 单 一 因 素 所 决 定 ， 因 此 在 PCR反 应 中 必 须准 确 性 （ 序 列 对 错 ）对 多 种 参 数 进 行 联 合 控 制 和 改 进 ， 但 由 于 PCR反 应 中 的 各 参 数 往 往是 相 互 影 响 的 ， 因 此 任 何 参 数 的 改 进 不 可 能 同 时 满 足 特 异

5、性 、 有 效性 、 准 确 性 。 PCR扩 增 反 应 的 精 确 性2 PCR的 DNA聚 合 酶 与 扩 增 的 精 确 性用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介DNA聚 合 酶 对 PCR精 确 性 的 重 要 影 响DNA聚 合 酶 的 使 用 PCR扩 增 反 应 的 精 确 性 利 用 PCR技 术 扩 增 DNA靶 序 列 的 一 个 重 要 问 题 是 这 种 DNA体 外 聚合 反 应 的 序 列 忠 实 程 度 ， 即 DNA扩 增 产 物 序 列 的 准 确 率 。 PCR反 应 的准 确 率 远 远 低 于 细 胞 内 的 DNA聚 合 反 应 ， 除 了 缺

6、少 完 善 的 DNA聚 合 校正 系 统 外 ， 影 响 PCR反 应 准 确 率 的 因 素 还 包 括 ：DNA聚 合 酶 的 保 真 性 能 （ 主 要 因 素 ）DNA链 的 物 理 损 伤PCR反 应 体 系 的 洁 净 度 DNA聚 合 酶 对 PCR精 确 性 的 重 要 影 响 DNA聚 合 酶 的 保 真 性 主 要 取 决 于 其 3 5 的 核 酸 外 切 酶 活 性 ，它负 责 对 错 误 掺 入 的 碱 基 进 行 校 正 。 相 关 研 究 结 果 表 明 ， DNA聚 合 酶 的出 错 率 在 每 轮 延 伸 每 核 苷 酸 1.6 X 106 - 2.1 X

7、104范 围 内 。 DNA聚 合酶 的 碱 基 掺 入 错 误 可 能 发 生 在 其 延 伸 阶 段 的 五 种 活 性 ：与 dNTP的 结 合 特 异 性 磷 酸 二 酯 键 的 形 成 速 率 焦 磷 酸 的 释 放 速 率 碱 基 错 误 掺 入 之 后 的 持 续 延 伸 性 3 5 的 核 酸 外 切 活 性 的 强 弱 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 Taq DNA酶 的 聚 合 出 错 率 较 高 （ 2.1X10-4） ， 因 为 它 没 有 3 5的的 核 酸 外 切 酶 活 性 和 校 正 功 能 。 然 而 通 过 优 化 反 应 条 件 ， 可 使 T

8、aq酶 的聚 合 出 错 率 降 低 到 原 来 的 1/3。 Taq DNA聚 合 酶 催 化 的 聚 合 反 应 的 普 遍则 Taq DNA酶 还 常 常 导 致 扩 增 产 物 的 缺 失 突 变 。Taq DNA聚 合 酶 （ Thermus aquaticus）错 误 类 型 是 由 AT转 换 为 GC； 如 果 模 板 DNA具 有 形 成 二 级 结 构 的 可 能 性避 免 稀 释 保 存 Taq DNA聚 合 酶 Taq DNA聚 合 酶 在 室 温 下 也 具 有 延 伸 引 物 的 活 性 Taq DNA酶 在 使 用 时 应 注 意 ： 用 于 PCR的 DNA聚

9、合 酶 简 介 KlenTaq DNA聚 合 酶 是 一 种 N端 缺 失 了 的 Taq DNA聚 合 酶 ， 因 而没 有 5 的 核 酸 外 切 酶 活 性 ； KlenTaq DNA聚 合 酶 的 Mg2+最 佳 浓 度 范 围 很 宽 ， 因 此 很 容 易 优 化KlenTaq DNA聚 合 酶 （ Thermus aquaticus） 在 最 佳 反 应 条 件 下 ， KlenTaq DNA聚 合 酶 出 错 率 为 5.1 X 10 5，性 能 略 优 于 Taq DNA聚 合 酶 。反 应 条 件 ； 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 Tth DNA聚 合 酶 在

10、 Mn2+的 存 在 下 ， 能 有 效 地 反 转 录 长 度 在 1000碱基 以 下 的 RNA； Tth DNA聚 合 酶 在 Mg2+的 存 在 下 ， 能 由 DNA模 板 合 成 DNA； Tth DNA聚 合 酶 （ Thermus thermophilus）好 地 克 服 RNA链 中 普 遍 存 在 二 级 结 构 的 难 题 。 Tth DNA聚 合 酶 在 较 高 的 温 度 下 仍 具 有 逆 转 录 酶 活 性 ， 因 此 能 很 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 Pfu是 一 种 高 保 真 的 DNA聚 合 酶 ， 出 错 率 极 低 ； Pfu DN

11、A聚 合 酶 扩 增 出 的 产 物 带 有 平 头 末 端 ； Pfu DNA聚 合 酶 扩 增 速 度 极 快 ， 达 1.5 - 2 min / kb；Pfu DNA聚 合 酶 （ Pyrococcus furiosus） Pfu DNA聚 合 酶 的 热 稳 定 性 很 高 。 7.0 X 107 - 1.6 X 106 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 Vent DNA聚 合 酶 具 有 3 5 的 核 酸 外 切 酶 活 性 和 校 正 功 能 ，因 此与 其 它 DNA聚 合 酶 （ 如 Taq酶 ） 相 比 ， 具 有 相 对 较 好 的 高 保 真 性 ， 其出 错

12、 率 为 2.4 X 105 - 5.7 X 105 ； Vent DNA聚 合 酶 （ Thermococcus litoralis）度 小 于 2 kb时 ， 扩 增 产 物 的 长 度 与 Mg 2+的 浓 度 并 无 关 联 ； 如 果 扩 增 长 度 大 于 2 kb， 则 需 要 高 于 2 mM的 Mg2+， 而 在 扩 增 长 如 果 模 板 链 中 存 在 次 黄 嘌 呤 核 苷 或 脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷 ， Vent DNA聚 合 酶 不 能 延 伸 引 物 。 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 DeepVent DNA聚 合 酶 是 一 种 在 低 温 和

13、 高 温 条 件 下 均 极 其 稳 定 的聚 合 酶 ， 且 能 使 用 广 范 围 的 辅 助 溶 剂 如 甲 酰 胺 和 DMSO等 ； DeepVent DNA聚 合 酶 能 产 生 长 达 14 kb的 扩 增 产 物 ， 其 外 切 酶DeepVent DNA聚 合 酶 （ Pyrococcus species GB-D）活 性 比 Vent DNA聚 合 酶 高 4 倍 ， 聚 合 活 性 比 Taq DNA酶 高 5-15倍 ，度 小 于 2 kb时 ， 扩 增 产 物 的 长 度 与 Mg 2+的 浓 度 并 无 关 联 ； 如 果 扩 增 长 度 大 于 2 kb， 则 需

14、 要 高 于 2 mM的 Mg2+， 而 在 扩 增 长 如 果 模 板 链 中 存 在 次 黄 嘌 呤 核 苷 或 脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷 ， Vent DNA聚 合 酶 不 能 延 伸 引 物 。 出 错 率 比 Vent DNA聚 合 酶 低 2 倍 ； 用 于 PCR的 DNA聚 合 酶 简 介 UlTma是 一 种 高 保 真 的 DNA聚 合 酶 ， 可 以 较 高 的 产 量 扩 增 小 于3 kb的 DNA靶 序 列 ， 产 物 呈 平 头 末 端 。UITma DNA聚 合 酶 （ Thermotoga maritima） DNA聚 合 酶 的 使 用DNA聚 合 酶 的

15、 标 准 使 用 范 围 ： 1 - 5 Units / mL特 异 性 的 改 进 ： 在 建 议 使 用 的 范 围 内 尽 可 能 地 降 低 酶 浓 度 。 聚 合 酶 的 浓 度 是 决 定 PCR反 应 成 本 的 的 重 要 参 数 ， 浓 度 过 高 不 仅 能 降 特 异 性 ， 同 时 也 导 致 不 必 要 的 消 耗 。准 确 性 的 改 进 ： 建 议 使 用 高 保 真 的 DNA聚 合 酶 PCR模 板 制 备 与 纯 化3 PCR的 模 板 与 制 备PCR模 板 的 使 用粗 样 品 中 的 PCR抑 制 剂 PCR模 板 制 备 与 纯 化 DNA和 RNA

16、均 可 作 为 PCR扩 增 反 应 的 模 板 ， 但 一 般 情 况 下 ， mRNA先 逆 转 录 成 cDNA再 进 行 扩 增 。 PCR模 板 的 来 源 主 要 有 两 大 类 ：纯 净 物 如 重 组 质 粒 、 制 备 的 染 色 体 DNA、 回 收 的 DNA片 段粗 样 品 如 粪 便 、 脑 脊 髓 液 、 血 液 、 食 物 、 动 物 贝 壳 、 土 壤 、 尿 液 、 唾 液 、 福 尔 马 林 固 定 剂 、 组 织 切 片 、 脓 汁 、 喷 嚏 液 、 痰 液 等 上 述 粗 样 品 含 有 大 量 的 PCR反 应 抑 制 物 质 ， 因 此 如 何 去

17、 除 这 些 种 类繁 多 的 抑 制 剂 或 者 添 加 必 要 的 PCR反 应 增 强 剂 显 得 十 分 重 要 。 PCR模 板 制 备 与 纯 化 从 各 种 粗 样 品 中 去 除 PCR反 应 抑 制 剂 的 程 序 不 尽 相 同 ， 但 常 用 的手 段 包 括 ： 样 品 稀 释溶 剂 萃 取 （ 氯 仿 异 戊 基 乙 醇 49 1 ）乙 醇 沉 淀高 速 离 心超 滤 粗 样 品 中 的 PCR抑 制 剂粪 便 胆 盐 、 胆 红 素 （ 抑 制 浓 度 50mg / mL）血 液 亚 铁 血 红 素 、 聚 乙 醇 磺 酸 钠 、 heparin（ 抗 凝 剂 ）土

18、 壤 腐 殖 物 质 、 含 铁 化 合 物植 物 硫 酸 右 旋 糖 苷 食 品 未 鉴 定 的 抑 制 剂痰 液 未 鉴 定 的 抑 制 剂 PCR模 板 的 使 用PCR模 板 的 标 准 使 用 范 围 ： 102 - 105 拷 贝 特 异 性 的 改 进 ： 增 加 模 板 DNA的 量 、 降 低 引 物 与 模 板 的 分 子 比 有 效 性 的 改 进 ： 增 加 引 物 与 模 板 的 分 子 比 模 板 浓 度 的 变 化 很 大 程 度 上 取 决 于 待 扩 增 的 碱 基 序 列 ， 但 一 般而 言 ， 模 板 DNA长 度 小 ， PCR扩 增 产 物 的 量

19、就 大 ， 因 此 对 于 大 分 子量 的 模 板 DNA（ 尤 其 是 真 核 生 物 基 因 组 DNA） ， 在 扩 增 之 前 最 好 先用 超 声 波 处 理 或 限 制 性 酶 消 化 。 PCR引 物 的 设 计 原 则4 PCR的 引 物 设 计 及 合 成PCR引 物 的 使 用引 物 的 在 线 设 计 工 具 及 免 费 软 件 简 介 PCR引 物 的 设 计 原 则 选 择 合 适 的 引 物 是 PCR实 验 设 计 的 重 要 步 骤 ， 合 适 引 物 最 基 本 的引 物 的 长 度标 准 就 是 与 靶 序 列 的 高 特 异 性 杂 交 。 为 达 到

20、此 目 的 ， 引 物 设 计 应 注 意下 列 几 点 ： 理 想 的 引 物 长 度 应 该 在 18-30个 碱 基 之 间 ， 常 见 的 是 20-27个 碱 基 PCR引 物 的 设 计 原 则引 物 的 GC含 量 引 物 序 列 中 的 GC含 量 应 在 35% - 65%之 间 ， 最 好 在 45% - 55%范围 内 。 如 果 因 靶 序 列 的 原 因 ， 引 物 不 得 不 含 有 过 高 的 GC碱 基 ， 那 么 就在 其 5 端 设 计 一 串 A或 T； 同 样 ， 如 果 引 物 中 的 AT含 量 过 高 ， 就 在 其 5 端 设 计 一 串 G或

21、C， 以 便 将 整 条 引 物 的 GC含 量 控 制 在 合 适 的 范 围 内 。 PCR引 物 的 设 计 原 则退 火 温 度 （ Ta） 引 物 的 退 火 温 度 一 般 要 比 估 计 的 相 应 熔 点 温 度 低 5 左 右 ， 在 很 多情 况 下 ， 两 条 引 物 的 退 火 温 度 不 尽 相 同 ， 只 要 两 者 相 差 不 到 4-6 ， 尚不 至 于 影 响 RCR扩 增 反 应 的 产 量 ， 但 它 们 的 退 火 温 度 应 在 55-75 范 围 引 物 碱 基 20， Ta = 4 X（ G+C） + 2 X（ A+T） - 5（ ） 内 。 如

22、果 两 条 引 物 的 退 火 温 度 差 别 过 大 ， 可 以 适 当 延 长 较 低 Ta值 的 引物 的 3 端 （ 这 样 可 以 保 持 扩 增 产 物 的 长 度 不 变 ） 或 5 端 。 引 物 的 Ta值 估 算 有 多 种 公 式 ， 最 好 根 据 RCR试 剂 盒 建 议 的 计 算 方法 ， 例 如 Alkami Quick Guide试 剂 盒 建 议 的 计 算 方 法 如 下 ： 引 物 碱 基 20， Ta = 62.5 + 0.41 X（ GC%） - 500 / 长 度 - 5（ ） PCR引 物 的 设 计 原 则杜 绝 互 补 区 域 的 存 在 引

23、 物 序 列 和 靶 序 列 各 自 内 部 应 杜 绝 互 补 区 域 的 存 在 。为 扩 增 后 操 作 提 供 便 利 条 件 在 不 影 响 扩 增 反 应 特 异 性 的 前 提 下 ， 可 在 引 物 的 5 端 引 入 诸 如 限限 制 性 内 切 酶 识 别 位 点 、 启 动 子 序 列 等 有 用 的 非 模 板 序 列 ， 以 便 于 扩增 后 操 作 。 PCR引 物 的 设 计 原 则引 物 与 模 板 的 互 补 程 度 在 一 般 情 况 下 ， 并 不 要 求 引 物 与 模 板 的 序 列 达 到 100%互 补 ， 但检 查 靶 序 列 上 其 它 可 能

24、 存 在 的 引 物 同 源 区 域 为 了 减 少 PCR扩 增 产 物 的 污 染 本 底 ， 在 设 计 引 物 序 列 时 应 检 查 模板 DNA上 是 否 存 在 潜 在 的 引 物 同 源 区 域 。 尽 可 能 高 的 互 补 程 度 是 必 要 的 。 PCR引 物 的 设 计 原 则选 择 内 含 子 序 列 作 为 引 物 序 列 在 真 核 生 物 中 ， 即 便 是 在 重 复 基 因 的 不 同 家 族 成 员 之 间 ， 其 内 含引 物 的 末 端 序 列 在 引 物 的 两 端 设 置 1-2个 嘌 呤 碱 基 ， 最 好 在 引 物 的 3 端 避 免 G或

25、 C 这 样 可 以 在 聚 合 反 应 开 始 时 增 加 引 物 后 面 碱 基 掺 入 的 机 会 。 引 物 3 端子 序 列 也 是 随 机 多 样 性 的 。至 少 应 有 1-2个 碱 基 必 须 是 特 异 性 的 。 引 物 的 在 线 设 计 工 具 及 免 费 软 件 简 介The Primer Generator（ TPG） http:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi TPG是 一 种 基 于 CGI数 据 库 便 利 的 用 于 定 点 突 变 的 引 物 设 计 工 具 。只 要 在 网 页 上 相 应 的 位

26、 置 中 键 入 不 超 过 15个 碱 基 的 短 核 苷 酸 序 列 、 所期 望 的 氨 基 酸 序 列 、 以 及 允 许 替 换 的 最 大 碱 基 数 ， 设 计 工 具 便 会 提 供满 足 初 始 要 求 的 所 有 可 能 的 引 物 序 列 ， 还 能 显 示 酶 切 位 点 的 消 失 或 增加 。 但 TPG的 一 个 明 显 缺 陷 是 不 能 计 算 引 物 的 Tm值 并 判 断 其 稳 定 性 。 引 物 的 在 线 设 计 工 具 及 免 费 软 件 简 介Primers! http:/ /javascript/ Primers!是 一 种 基 于 Java的

27、 引 物 设 计 程 序 ， 可 以 选 择 所 期 望 的 引 物长 度 、 最 大 Tm值 、 最 小 Tm值 、 误 配 碱 基 对 数 等 四 种 参 数 输 入 引 物 序 列其 特 殊 的 优 点 是 能 限 定 所 输 入 的 序 列 中 适 合 引 物 设 计 的 区 域 ， 这 对 检 索若 干 kb长 的 DNA片 段 中 各 种 可 能 的 引 物 是 很 有 利 的 。 而 且 能 根 据 三 种 计算 方 法 显 示 正 反 向 引 物 的 Tm值 ， 可 以 随 意 更 换 碱 基 以 提 高 或 降 低 Tm值同 时 还 能 提 供 引 物 稳 定 性 的 参 数

28、 ， 包 括 发 夹 结 构 、 引 物 二 聚 体 、 引 物 相 似 性 等 。 缺 点 是 不 能 计 算 发 夹 结 构 、 引 物 二 聚 体 的 响 应 Tm值 。 引 物 的 在 线 设 计 工 具 及 免 费 软 件 简 介其 它 的 在 线 设 计 网 站 WWW GeneFisher http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/ Web Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.html Project DOPE2http:/dope.interactiva.de/ NetP

29、rimer http:/ Oligos-U-Like Primers3 http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi PCR引 物 的 使 用PCR引 物 的 标 准 使 用 范 围 ： 0.1 - 1.0 mM， 最 好 0.2 - 0.5 mM 特 异 性 的 改 进 ： 降 低 引 物 和 dNTP的 浓 度 可 以 在 很 大 程 度 上 改有 效 性 的 改 进 ： 增 加 引 物 与 模 板 的 分 子 比 ； 如 果 引 物 中 有 不 配善 PCR扩 增 反 应 的 特 异 性 ， 高 浓 度 的 引 物 往 往 会 导 致 非 特

30、异 性的 退 火 及 副 产 物 形 成 ， 同 时 也 会 促 进 引 物 二 聚 体 的 产 生 。 在 模板 量 一 定 的 情 况 下 ， 降 低 引 物 浓 度 实 际 上 也 是 降 低 引 物 与 模 板的 分 子 之 比 。对 的 碱 基 ， 则 适 当 降 低 引 物 的 浓 度 。 5 PCR反 应 的 其 它 控 制 参 数脱 氧 三 磷 酸 核 苷 酸 （ dNTPs） 预 热 变 性 温 度 和 时 间Mg+2离 子退 火 杂 交 温 度 和 时 间延 伸 聚 合 温 度 和 时 间循 环 次 数反 应 体 积 脱 氧 三 磷 酸 核 苷 酸 （ dNTPs）dNTP

31、s的 标 准 使 用 范 围 ： 20 - 200 mM特 异 性 的 改 进 ： 降 低 dNTPs的 浓 度 ， 但 要 注 意 Mg+2的 摩 尔 浓 度有 效 性 的 改 进 ： 对 于 较 大 分 子 量 的 模 板 ， 应 适 当 提 高 dNTPs的 量如 果 一 种 dNTP的 浓 度 过 高 ， 它 就 会 优 先 掺 入 到 延 长 链 中 ， 造 成扩 增 产 物 的 不 准 确 ， 因 此 要 保 持 四 种 dNTPs的 一 致 。 此 外 ， 保持 四 种 dNTPs的 浓 度 略 高 于 DNA聚 合 酶 对 各 种 dNTPs的 Km值 也很 重 要 （ 10-

32、15 mM） 。 也 应 同 步 降 低 。准 确 性 的 改 进 ： 降 低 dNTPs的 浓 度 ， 但 要 注 意 Mg +2的 摩 尔 浓 度也 应 同 步 降 低 。 Mg+2离 子Mg+2的 标 准 使 用 范 围 ： 0.5 - 10 mM特 异 性 的 改 进 ： 降 低 Mg +2浓 度 ， 但 要 注 意 过 低 的 Mg+2浓 度 又 会 影有 效 性 的 改 进 ： 提 高 Mg+2浓 度 ， 但 过 量 Mg+2将 导 致 非 特 异 性 扩 增游 离 的 Mg+2离 子 浓 度 应 高 于 dNTPs总 浓 度 0.5-3.0mM。 由 于 Mg+2 能 与 dNT

33、Ps形 成 可 溶 性 的 复 合 物 ， 过 低 浓 度 的 Mg+2离 子 将 会 影 响dNTPs的 有 效 浓 度 。 Mg+2的 浓 度 影 响 扩 增 产 物 的 特 异 性 、 引 物 退火 、 引 物 二 聚 体 的 形 成 、 熔 点 温 度 、 酶 的 活 性 和 准 确 性 。 因 此 ，PCR反 应 系 统 的 主 要 优 化 参 数 是 Mg+2的 浓 度 ， 尤 其 当 扩 增 产 物 大大 于 1kb时 ， 这 个 因 素 显 得 更 为 重 要 。响 扩 增 产 物 的 产 量 。 预 热 变 性 温 度 和 时 间预 热 温 度 和 时 间 的 标 准 使 用

34、 范 围 ： 92 - 96 30 secs - 10 mins 在 酶 不 存 在 时 ， 预 热 能 灭 活 样 品 中 有 害 的 蛋 白 酶 和 核 酸 酶 ， 同 时又 能 保 证 模 板 的 完 全 变 性 ， 尤 其 是 基 因 组 DNA直 接 作 为 模 板 使 用时 ， 更 显 得 重 要 。 变 性 温 度 和 时 间 的 标 准 使 用 范 围 ： 92 - 96 30 - 120 secs 退 火 杂 交 温 度 和 时 间退 火 温 度 和 时 间 的 标 准 使 用 范 围 ： 37 - 65 10 - 120 secs 退 火 时 ， 引 物 迅 速 杂 交 。

35、 不 同 DNA聚 合 酶 所 拥 有 的 Tm值 的 差 异会 改 变 有 效 的 引 物 退 火 温 度 。特 异 性 的 改 进 ： 提 高 退 火 温 度 （ 比 建 议 退 火 温 度 提 高 2-5 ） ；减 少 退 火 时 间 。 过 长 的 退 火 时 间 在 正 常 情 况 下 并 不 能 提 高 产 量 ，只 会 增 加 非 特 异 性 引 物 杂 交 的 可 能 性 。 延 伸 聚 合 温 度 和 时 间延 伸 聚 合 温 度 和 时 间 的 标 准 使 用 范 围 ： 72 60 - 120 secs PCR扩 增 反 应 中 普 遍 使 用 的 DNA聚 合 酶 的

36、聚 合 速 度 每 秒 至 少 50个 碱 基 ， 所 以 如 果 PCR扩 增 产 物 长 度 小 于 400 bp， 聚 合 时 间 可 以 少于 15秒 ， 特 别 是 当 退 火 温 度 选 得 较 高 的 时 候 ， 在 退 火 阶 段 就 有 一 些单 体 掺 入 。 较 长 PCR产 物 的 扩 增 需 要 相 应 延 长 反 应 时 间 ， 但 最 好 要比 理 论 计 算 时 间 更 长 些 ， 以 弥 补 由 于 反 应 系 统 粘 度 增 大 所 产 生 的 反应 滞 后 作 用 。 循 环 次 数 在 一 定 的 循 环 次 数 下 ， PCR反 应 的 最 终 产 量

37、 可 由 下 式 估 算 ： 由 上 式 可 以 看 出 ， PCR产 物 呈 指 数 扩 增 ， 但 当 然 产 物 拷 贝 数 达 到 1012（ 阈 值 ） 时产 物 的 扩 增 速 度 一 般 急 剧 下 降 。 达 到 这 个 阶 段 所 需 要 的 循 环 次 数 可 由 下 式 计 算 ： 影 响 上 述 扩 增 阈 值 的 主 要 因 素 包 括 ：扩 增 底 物 （ 引 物 和 dNTPs） 有 效 浓 度 的 下 降 Nf = N0 X 2 N 其 中 N为 循 环 次 数 ， N0为 起 始 拷 贝 数 ， N0为 最 终 拷 贝 数 Nf = N0 （ 1 + Y） N

38、非 特 异 性 产 物 或 引 物 二 聚 体 对 反 应 试 剂 的 竞 争 作 用反 应 试 剂 的 稳 定 性扩 增 产 物 抑 制 作 用 高 浓 度 产 物 的 退 活 作 用 以 及 不 完 全 变 性 特 异 性 的 改 进 ： 降 低 循 环 次 数 ， 减 小 扩 增 片 段 长 度 。 有 效 性 的 改 进 ： 对 于 1kb以 上 片 段 的 扩 增 ， 增 加 循 环 中 各 步 骤 的 滞 留 时 间 。 反 应 体 积反 应 体 积 的 标 准 范 围 ： 20 - 100 ml（ 0.5 ml的 小 离 心 管 ）有 效 性 的 改 进 ： 增 加 反 应 体

39、积 以 及 保 温 时 间 ， 以 充 分 保 证 热 平 衡 ；5 ml的 反 应 体 积 也 有 成 功 的 例 子 。 反 应 体 积 过 大 会 影 响 加 热 和 冷却 ， 而 过 小 的 反 应 体 积 又 容 易 导 致 温 度 变 化 不 稳 定 ， 进 而 降 低 产量 ， 甚 至 反 应 管 的 几 何 尺 寸 、 管 壁 厚 薄 、 扩 增 仪 的 加 热 冷 却 装 置也 能 影 响 各 循 环 步 骤 所 需 的 时 间 。对 于 100ml以 下 的 反 应 体 积 还 应 该 用 油 封 顶 ， 以 减 少 反 应 体 系 的蒸 发 浓 缩 效 应 。 6 PCR

40、技 术 的 衍 生 与 发 展LA PCR（ Long and Accurate PCR） RT PCR（ Reverse Transcriptase） 原 位 PCR（ In Situ PCR） 定 量 PCR（ Quantitative PCR）锚 定 PCR（ Anchored PCR）多 重 PCR（ Multi PCR）反 向 PCR（ Inverted PCR） 不 对 称 PCR（ Asymmetric PCR） LA PCR（ Long and Accurate PCR） LA PCR是 一 种 专 门 用 于 精 确 扩 增 较 长 DNA片 段 的 特 种 PCR程序 ，

41、其 关 键 的 技 术 是 结 合 使 用 两 种 热 稳 定 的 DNA聚 合 酶 ， 可 以 扩 增出 5 - 40 kb的 DNA大 片 段 。 两 种 酶 的 配 比 如 下 ： 其 中 ， Pfu和 DeepVent起 着 二 次 校 对 的 作 用 。KlenTaq Pfu = 16 1KlenTaq DeepVent = 50 1 RT PCR（ Reverse Transcriptase） RT-PCR是 一 种 以 mRNA为 模 板 ， 经 cDNA扩 增 出 DNA的 技 术 ，能 极 其 灵 敏 地 检 测 到 任 何 基 因 的 转 录 物 ， 而 与 mRNA的 相

42、 对 量 无 关 。 标 准 的 RT-PCR程 序 包 括 ：mRNA的 分 离cDNA反 应 的 引 物 退 火mRNA反 转 录 为 cDNAcDNA的 PCR扩 增 引 物 选 择 有 三 种 战 略 ：基 因 特 异 性 引 物 化 （ GSP） ， 最 精 确 最 灵 敏寡 聚 dT引 物 化 随 机 六 聚 体 引 物 化 反 向 PCR（ Inverted PCR） 通 常 ， PCR反 应 是 对 两 条 引 物 之 间的 序 列 进 行 扩 增 ， 但 如 果 将 模 板 DNA稍 酶 切环 化酶 切 扩 增做 处 理 ， 即 可 实 现 对 已 知 序 列 两 侧 的 片

43、段 进 行 扩 增 ， 这 种 战 略 称 为 反 向 PCR技术 。 不 对 称 PCR（ Asymmetric PCR） 在 PCR扩 增 循 环 中 引 入 不 同的 引 物 浓 度 ， 使 得 由 两 条 引 物 介导 扩 增 反 应 呈 不 对 称 状 态 ， 这 种战 略 称 为 不 对 称 PCR技 术 。 不 对 称 PCR中 的 两 条 引 物 浓度 一 般 采 用 50-100 1的 配 比 ，在 最 初 的 10 - 15个 循 环 中 ， 主 要产 物 还 是 双 链 DNA， 但 当 低 浓 度的 引 物 耗 尽 后 ， 高 浓 度 引 物 引 导 的 PCR反 应

44、便 会 产 生 大 量 的 单 链 原 位 PCR（ In Situ PCR） 原 位 PCR是 PCR技 术 与 原 位 杂 交 技 术 结 合 的 产 物 。 原 位 杂 交 技 术可 以 检 测 到 10个 拷 贝 的 DNA或 细 胞 ， 而 原 位 PCR技 术 能 使 杂 交 的 灵 敏度 提 高 10倍 ， 也 就 是 说 人 们 可 以 在 1mg的 细 胞 DNA样 品 中 检 测 到 1个 拷贝 的 特 定 DNA序 列 。 一 个 典 型 的 原 位 PCR程 序 包 括 下 列 四 个 步 骤 ： 待 检 测 的 组 织 或 细 胞 用 甲 醛 溶 液 固 定 用 蛋

45、白 酶 对 细 胞 进 行 通 透 性 处 理 ， 确 保 PCR试 剂 能 进 入 细 胞 对 DNA或 RNA靶 序 列 进 行 胞 内 原 位 扩 增 PCR扩 增 产 物 通 常 用 地 高 辛 系 统 标 记 ， 色 谱 检 测 仪 检 测 定 量 PCR（ Quantitative PCR） 理 论 上 讲 ， PCR产 物 以 指 数 规 律 增 殖 ， 但 在 所 有 的 扩 增 循 环 （ 尤其 是 后 十 轮 ） 中 ， 众 多 引 物 -模 板 分 子 上 的 反 应 由 于 抑 制 剂 的 作 用 并 非100%的 有 效 ， 因 此 精 确 定 量 PCR产 物 必

46、须 使 用 内 标 （ 扩 增 对 照 ） 。贝 的 特 定 DNA序 列 。 内 标 使 用 相 同 的 引 物 ， 与 待 测 样 品 具 有 相 似 的 长 度 、 碱 基 组 成 以 及 对 抑 制 剂 的 敏 感 性 ， 但 又 必 须 与 待 测 样 品 有 所 区 别 ， 以 便 在 扩 增 产物 检 测 分 析 时 能 够 辨 认 （ 如 引 物 的 检 测 方 式 不 同 ） 。C 0 / X0 = Cn / Xn X0 = C0（ Cn / Xn ） 其 中 ， C0和 X0分 别 为 内 标 和 待 测 样 品 的 初 始 拷 贝 数 ， 在 1 10到10 1的 范 围

47、 内 最 佳 ； Cn / Xn分 别 为 内 标 和 待 测 样 品 的 扩 增 产 物 分 子 比 多 重 PCR（ Multi PCR）加 入 多 对 引 物 ， 对 同 一 P1 P2 P3 P4P1 P2 P3 P4正 常 人 扩 增 物 病 人 扩 增 物模 板 的 若 干 区 域 进 行 同时 扩 增 。 适 用 于 绘 制 真核 生 物 庞 大 基 因 或 基 因组 中 的 缺 失 图 谱 ， 如 分子 病 的 临 床 辅 助 诊 断 。 锚 定 PCR（ Anchored PCR）反 转 录AAAAA 353 GGGGGGGGTdT 锚 定 引 物锚 定 PCR又称 为 cD

48、NA末 端 快 速 扩增 PCR， 主要 用 于 5端 序 列 未 知的 cDNA的扩 增 和 克 隆。 5 55 dGTP 55 CCCCCCCCPCR3 GGGGGGGG55 CCCCCCCC3PCR5 CCCCCCCC5 特 异 性 引 物 7 PCR技 术 在 生 命 科 学 研 究 中 的 应 用特 定 DNA序 列 的 克 隆 与 重 组 子 的 鉴 定 PCR-SSCP检 测 基 因 序 列DNA洗 牌 术 （ Shuffling）染 色 体 DNA的 引 物 原 位 杂 交DNA的 体 外 定 点 突 变 与 分 析同 源 重 组 子 的 检 测 特 定 DNA序 列 的 克

49、隆 与 重 组 子 的 鉴 定GAATTC GGATCCGAATTCCTTAAG GGATCCCCTAGGPCR扩 增PCR产 物 克 隆EcoRI BamHI PCR鉴 定 DNA的 体 外 定 点 突 变 与 分 析PCR扩 增 突 变 位 点变 性 复 性 除 去 引 物 延 伸 加 外 侧 引 物 同 源 重 组 子 的 检 测同 源 整 合目 的 基 因同 源 交 换 目 的 基 因整 合 位 点 PCR扩 增 PCR扩 增 PCR-SSCP检 测 基 因 序 列 将 PCR技 术 与 单 链 构 型 多 态 性 （ SSCP） 分 析 技 术 联 合 使 用 ， 可 以有 效 地

50、检 测 和 分 析 基 因 序 列 的 突 变 性 质 。 在 非 变 性 的 聚 丙 烯 酰 凝 胶 电 泳条 件 下 ， 单 链 DNA由 于 分 子 内 的 作 用 力 而 形 成 卷 曲 构 型 ， 即 便 是 单 一 碱基 的 突 变 也 会 导 致 整 条 单 链 DNA的 构 型 发 生 变 化 ， 并 被 检 测 。 采 用 不 对 称 性 PCR程 序 扩 增 待 分 析 的 靶 基 因 序 列 ， 获 得 特 异 性 单 链DNA， 然 后 在 非 变 性 条 件 下 走 聚 丙 烯 酰 凝 胶 电 泳 ， 与 对 照 样 品 进 行 比 较即 可 检 测 出 可 能 存

51、在 的 碱 基 突 变 类 型 。 染 色 体 DNA的 引 物 原 位 杂 交 通 过 荧 光 探 针 使 染 色 体 发 光 是 细 胞 遗 传 学 的 一 种 绘 图 技 术 ， 涉 及 到荧 光 原 位 杂 交 （ FISH， Fluorescent In Situ Hybridization ） 和 引 物 原 位杂 交 （ PRINS， Primed In Situ hybridization ） 程 序 ， 用 于 基 因 图 谱 绘制 、 染 色 体 畸 形 展 示 、 基 因 表 达 、 基 因 组 构 成 、 感 染 病 定 性 、 病 毒 整 合位 点 调 查 等 方 面

52、 。 PRINS是 FISH和 PCR的 结 合 ： 首 先 使 寡 聚 核 苷 酸 引 物 与 处 于 M期 的染 色 体 DNA退 火 ， 然 后 在 荧 光 标 记 的 核 苷 酸 和 Taq DNA聚 合 酶 的 存 在 下进 行 延 伸 反 应 ， 合 成 一 系 列 长 度 在 200-1000 bp之 间 的 荧 光 探 针 ， 进 而绘 制 细 胞 染 色 体 的 彩 色 图 谱 。 DNA洗 牌 术 （ Shuffling）随 机 切 割 成 20 - 50bp的 小 片 段DNA同 源 序 列混 合 退 火PCR扩 增 克 隆 高 通 量 筛 选 8 PCR技 术 在 临

53、床 医 学 方 面 的 应 用PCR检 测 病 原 体 PCR临 床 诊 断 术 PCR检 测 病 原 体 临 床 上 检 测 病 原 体 通 常 有 三 类 方 法 ： 病 原 菌 和 病 毒 的 生 物 培 养 富 集 病 原 菌 和 病 毒 的 抗 原 免 疫 检 测 病 原 菌 和 病 毒 核 酸 特 征 序 列 的 PCR检 测 相 比 较 而 言 ， PCR检 测 法 在 很 多 情 况 下 不 需 要 培 养 富 集 待 检 测 样 品 这 不 仅 省 时 ， 更 重 要 的 是 很 多 病 原 微 生 物 难 以 培 养 ， 如 某 些 病 毒 、 真 菌厌 氧 菌 、 支 原

54、 体 等 ； PCR检 测 法 比 免 疫 分 析 法 更 廉 价 ； PCR检 测 法 可 以 使 用 多 重 引 物 同 时 检 测 若 干 种 病 原 微 生 物 。 为 数 不少 的 PCR检 测 程 序 已 自 动 化 ， 包 括 样 品 预 处 理 、 扩 增 反 应 、 产 物 检 测 。 PCR临 床 诊 断 术 PCR临 床 疾 病 诊 断 术 的 主 要 原 理 有 下 列 几 个 方 面 ：检 测 病 变 基 因 的 缺 失 或 缺 损 （ 扩 增 产 物 变 小 或 无 扩 增 产 物 ）检 测 病 变 基 因 的 点 突 变 （ 扩 增 产 物 电 泳 迁 移 率 改

55、 变 ）检 测 病 变 基 因 的 重 排 （ 扩 增 产 物 大 小 改 变 ） 上 述 方 法 可 以 诊 断 包 括 各 类 遗 传 病 、 恶 性 肿 瘤 、 免 疫 紊 乱 在 内 的 多种 疾 病 ， 但 始 终 没 有 获 得 美 国 FDA的 批 准 ， 其 主 要 原 因 是 PCR诊 断 术 的检 测 染 色 体 易 位 （ 扩 增 产 物 大 小 改 变 ）骨 髓 移 植 的 PCR指 纹 图 谱 快 速 配 型 （ 随 机 引 物 扩 增 ）检 测 病 变 mRNA的 结 构 （ 扩 增 产 物 大 小 改 变 ）可 靠 性 还 受 到 置 疑 ， 有 时 使 用 不 同 的 程 序 会 产 生 两 种 截 然 不 同 的 结 果 。