细胞培养中的细部分问题

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1、细 胞 培 养 中 的 细 节 问 题 基 础 篇 -无 菌 操 作 基 本 技 术 1. 实 验 进 行 前 ， 无 菌 室 及 无 菌 操 作 台 (laminar flow) 以 紫 外 灯 照 射 30-60 分 钟 灭 菌 ， 以 70 %ethanol 擦 拭 无 菌 操 作 抬 面 ， 并 开 启 无 菌 操 作 台 风 扇 运 转10 分 钟 后 ， 才 开 始 实 验 操 作 。 每 次 操 作 只 处 理 一 株 细 胞 株 ， 且 即 使 培 养 基相 同 亦 不 共 享 培 养 基 ， 以 避 免 失 误 混 淆 或 细 胞 间 污 染 。 实 验 完 毕 后 ， 将

2、实 验物 品 带 出 工 作 台 ， 以 70 % ethanol 擦 拭 无 菌 操 作 抬 面 。 操 作 间 隔 应 让 无 菌操 作 台 运 转 10 分 钟 以 上 后 ， 再 进 行 下 一 个 细 胞 株 之 操 作 。 2. 无 菌 操 作 工 作 区 域 应 保 持 清 洁 及 宽 敞 ， 必 要 物 品 ， 例 如 试 管 架 、 吸 管 吸取 器 或 吸 管 盒 等 可 以 暂 时 放 置 ， 其 它 实 验 用 品 用 完 即 应 移 出 ， 以 利 于 气 流 之流 通 。 实 验 用 品 以 70 % ethanol 擦 拭 后 才 带 入 无 菌 操 作 台 内

3、。 实 验 操 作 应在 抬 面 之 中 央 无 菌 区 域 ， 勿 在 边 缘 之 非 无 菌 区 域 操 作 。 3. 小 心 取 用 无 菌 之 实 验 物 品 ， 避 免 造 成 污 染 。 勿 碰 触 吸 管 尖 头 部 或 是 容 器瓶 口 ， 亦 不 要 在 打 开 之 容 器 正 上 方 操 作 实 验 。 容 器 打 开 后 ， 以 手 夹 住 瓶 盖 并 握 住 瓶 身 ， 倾 斜 约 45 角 取 用 ， 尽 量 勿 将 瓶 盖 盖 口 朝 上 放 置 桌 面 。 4. 工 作 人 员 应 注 意 自 身 之 安 全 ， 须 穿 戴 实 验 衣 及 手 套 后 才 进 行

4、实 验 。 对 于 来 自 人 类 或 是 病 毒 感 染 之 细 胞 株 应 特 别 小 心 操 作 ， 并选 择 适 当 等 级 之 无 菌 操 作 台 (至 少 Class II)。 操 作 过 程 中 ， 应 避免 引 起 aerosol 之 产 生 ， 小 心 毒 性 药 品 ， 例 如 DMSO 及 TPA 等 ，并 避 免 尖 锐 针 头 之 伤 害 等 。 5. 定 期 检 测 下 列 项 目 ： 5.1. CO2 钢 瓶 之 CO2 压 力 5.2. CO2 培 养 箱 之 CO2 浓 度 、 温 度 、 及 水 盘 是 否 有 污 染 (水 盘 的水 用 无 菌 水 ， 每

5、 周 更 换 )。 5.3. 无 菌 操 作 台 内 之 airflow 压 力 ， 定 期 更 换 紫 外 线 灯 管 及HEPA 过 滤 膜 ， 预 滤 网 (300小 时 /预 滤 网 ， 3000 小 时 /HEPA)。 6. 水 槽 可 添 加 消 毒 剂 (Zephrin 1:750)， 定 期 更 换 水 槽 的 水 。 基 础 篇 -实 验 用 品 1. 种 类 1.1. 细 胞 培 养 实 验 用 品 均 为 无 菌 ， 除 了 玻 璃 容 器与 pasteur pipet 外 ， 其 它 均 为 塑 料 无 菌 制 品 。 1.2. TC 级 培 养 盘 表 面 均 有 c

6、oating 高 分 子 物 质 以 让细 胞 吸 附 ， 培 养 容 器 种 类 有 Tflask， plates, dishes, roller bottle 等 ， 依 实 验 需 要 使 用 。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑 料 离 心 管 : 15 ml, 50 ml， 均 有 2 种 不 同 材 质 ，其 中 polypropylene (PP) 为 不 透 明 材 质 ， polystyrene (PS) 为 透 明 材 质 ， 可 依 实 验 需 要 而 选 择 适 合 材 质之

7、 离 心 管 。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch， 用 以 抽 掉 废 弃 培 养液 等 。 1.6. 玻 璃 血 清 瓶 (Pyrex or Duran glassware)： 100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml 2. 清 洗 2.1. 新 购 玻 璃 血 清 瓶 先 以 0.10.05 N HCl 浸 泡 数 小 时 ， 洗净 后 才 开 始 使 用 。 2.2. 用 过 之 玻 璃 血 清 瓶 ， 以 高 压 蒸 汽 灭 菌 ， 洗 净 后 分 别用 一 次 与 二 次 去 离 子 水 冲 洗 干 净 ， 勿 加 清 洁 剂 清 洗

8、 。3. 灭 菌 3.1. 实 验 用 玻 璃 血 清 瓶 以 铝 箔 纸 包 覆 瓶 盖 ， 高 压 蒸 汽 灭菌 121 , 15 lb, 20 分 钟 ， 置 于 oven 中 烘 干 。 3.2. 实 验 用 玻 璃 pasteur pipet 以 干 热 灭 菌 170 , 4 小 时 。 3.3. 液 体 或 是 固 体 废 弃 物 可 用 10 % hypochloride 溶 液 (次氯 酸 ， 即 漂 白 水 ) 或 是 蒸 汽 高 压 灭 菌 121 , 15 lb, 20 分钟 处 理 。 基 础 篇 -培 养 基 1. 液 体 培 养 基 贮 存 于 4 冰 箱 ， 避

9、 免 光 照 ， 实 验 进 行 前放 在 37 水 槽 中 温 热 。 2. 液 体 培 养 基 (加 血 清 ) 存 放 期 为 六 个 月 ， 期 间 glutamine 可 能 会 分 解 ， 若 细 胞 生 长 不 佳 ， 可 以 再 添 加 适 量glutamine。 3. 粉 末 培 养 基 配 制 (以 1 升 为 例 )： 3.1. 细 胞 培 养 基 通 常 须 添 加 10 % 血 清 ， 因 此 粉 末 培 养 基之 配 制 体 积 为 900 ml， pH 为 7.2 - 7.4。 NaHCO3 为 另 外 添加 ， 若 将 NaHCO3 粉 末 直 接 加 入 液

10、体 培 养 基 中 会 造 成 pH 之 误 差 ， 或 局 部 过 碱 。 因 此 粉 末 培 养 基 及 NaHCO3 粉 末应 分 别 溶 解 后 才 混 合 ， 然 后 用 CO2 气 体 调 整 pH， 而 非 用强 酸 (HCl)或 强 碱 (NaOH)， 因 为 氯 离 子 对 细 胞 生 长 可 能 有影 响 ， 且 贮 存 时 培 养 基 的 pH 易 发 生 改 变 。 3.2. 材 料 ： 纯 水 (milli-Q 水 或 二 次 至 三 次 蒸 馏 水 ， 水 品 质 非 常 重 要 ) ， 粉 末 培养 基 ， NaHCO3 ， 电 磁 搅 拌 器 无 菌 血 清 瓶

11、 ， 0.1 或 0.2 mm无 菌 过滤 膜 ， pH 计 ， 真 空 泵 ， CO2 气 体 3.3. 步 骤 ： 3.3.1. 取 粉 末 培 养 基 溶 于 700 ml milli-Q 水 中 ， 搅 拌 使 其 溶 解 。 3.3.2. 称 取 适 量 之 NaHCO3 粉 末 溶 于 200ml milli-Q 水 中 ， 搅 拌 使 其 溶解 ， 然 后 通 入 CO2 气 体 至 饱 和 ， 约 3-5 分 钟 。 3.3.3. 将 溶 解 且 含 饱 和 CO2 之 NaHCO3 溶 液 加 入 溶 解 之 液 体 培 养 基中 混 合 。 混 后 溶 液 之 pH 应 为

12、 7.2-7.4， 除 非 pH 值 偏 差 太 大 ， 否 则 不需 用 酸 碱 再 调 整 之 。 若 为 太 碱 ， 可 再 通 入 CO2 气 体 调 整 pH。 培 养基 以 真 空 帮 浦 通 过 过 滤 膜 时 ， pH 会 升 高 0.1-0.2。 3.3.4. 以 0.1 或 0.2 mm 无 菌 过 滤 膜 过 滤 灭 菌 ， 同 时 分 装 至 无 菌 容 器中 ， 标 示 培 养 基 种 类 、 日 期 、 瓶 号 等 ， 贮 存 于 4 。 (血 清 亦 可 加入 培 养 基 中 一 起 过 滤 ) 3.3.5. 配 制 之 培 养 基 配 制 须 作 生 长 试 验

13、 与 污 染 测 试 。 附 -配 制 培 养 基 之 生 长 测 试 材 料 ： MDCK cell (ATCC CCL-34 或 CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步 骤 ： 1. 以 待 测 试 培 养 基 培 养 MDCK cell， 接 种 MDCK 细 胞 于 6-well plate (或35mm TC dish) 中 ， 每 个 well 接 种 1 102 活 细 胞 ， 同

14、时 作 对 照 组 实 验 。 2. 接 种 5 7 天 后 ， 在 100 倍 倒 立 显 微 镜 作 观 察 细 胞 群 落 之 生 长 ， 待 细胞 群 落 大 到 可 以 肉 眼 观 察 ， 而 群 落 间 不 互 相 接 触 时 即 可 。 3. 去 除 培 养 基 ， 加 入 1 ml Carnoys 固 定 液 (甲 醇 ： 冰 醋 酸 3:1)， 室 温下 静 置 10 min。 4. 去 除 固 定 液 ， 水 洗 二 次 。 5. 加 入 1 ml 10 % Giemsa solution， ， 室 温 下 静 置 染 色 2-3 min。 6. 去 除 染 液 ， 水 洗

15、 二 次 。 7. 以 肉 眼 计 数 群 落 数 ， 并 比 较 之 ， 若 新 配 制 或 新 批 号 的 培 养 基 对 细 胞生 长 不 佳 ， 则 丢 弃 之 。 基 础 篇 -抗 生 素 1. 细 胞 库 之 细 胞 培 养 基 不 加 抗 生 素 1.1. 培 养 自 ATCC 引 进 之 细 胞 株 ， 培 养 基 中 不 加 抗 生 素 。 1.2. 培 养 自 其 它 实 验 室 引 进 之 细 胞 株 ， 制 作 token freeze 前 培 养 基 须 添 加 抗 生 素 ， 待 token freeze 通 过 污 染 测 试 后 ，大 量 培 养 时 则 不 加

16、 抗 生 素 。 2. 寄 送 活 细 胞 时 ， 须 将 培 养 液 充 满 整 个 flask 时 ， 则 须 添加 抗 生 素 (penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若 要 检 测 mycoplasma， 则 培 养 基 内 不 可 添 加gentamicin， 因 gentamicin 会 抑 制 mycoplasma 生 长 。 4. 去 除 细 菌 污 染 之 抗 生 素 混 合 配 方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 25

17、0 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml， 注意 混 合 使 用 后 药 物 毒 性 会 增 强 。 5. 抗 生 素 使 用 种 类 与 浓 度 ： 工 作 浓 度 . 储 存 温 度 . 杀 灭 细 菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) b

18、acteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基 础 篇 -血 清 1. 血 清 必 须 贮 存 于 20 -70 ， 若 存 放 于 4 ， 请 勿 超过 一 个 月 。 如 果 一 次 无 法 用 完 一 瓶 ， 可 将 40 45 ml 分装 于 无 菌 50 ml 离 心 管 中 ， 由 于 血 清 结 冻 时 体 积 会 增 加约 10 %， 必 须

19、 预 留 此 膨 胀 体 积 之 空 间 ， 否 则 易 发 生 污 染或 容 器 冻 裂 之 情 形 。 2. 一 般 厂 商 提 供 之 血 清 为 无 菌 ， 不 需 再 无 菌 过 滤 。 若 发现 血 清 有 许 多 悬 浮 物 ， 则 可 将 血 清 加 入 培 养 基 内 一 起 过滤 ， 勿 直 接 过 滤 血 清 。 3. 瓶 装 (500ml) 血 清 解 冻 步 骤 (逐 步 解 冻 法 ): -20 或 70至 4 冰 箱 溶 解 一 天 ， 至 室 温 下 全 溶 后 再 分 装 ， 一 般 以50 ml 无 菌 离 心 管 可 分 装 40 45 ml。 在 溶 解

20、 过 程 中 须 规则 摇 晃 均 匀 (小 心 勿 造 成 气 泡 )， 使 温 度 与 成 分 均 一 ， 减少 沈 淀 的 发 生 。 勿 直 接 由 20 直 接 至 37 解 冻 ， 因 温度 改 变 太 大 ， 容 易 造 成 蛋 白 质 凝 结 而 发 生 沈 淀 。 4. heat-inactivation 是 指 56 , 30 分 钟 加 热 已 完 全 解 冻 之 血清 。 加 热 过 程 中 须 规 则 摇 晃 均 匀 。 此 热 处 理 之 目 的 是 使血 清 中 之 补 体 成 份 (complement) 去 活 化 。 除 非 必 须 ， 一般 不 建 议 作

21、 此 热 处 理 ， 因 为 会 造 成 沈 淀 物 之 显 著 增 多 ，且 会 影 响 血 清 之 品 质 。 补 体 参 与 之 反 应 有 ： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿 将 血 清 置 于 37 太 久 ， 若 在 37

22、 放 置 太 久 ， 血 清 会变 得 混 浊 ， 同 时 血 清 中 许 多 较 不 稳 定 之 成 份 亦 会 因 此 受到 破 坏 ， 而 影 响 血 清 之 品 质 。 6. 血 清 之 沈 淀 物 6.1. 凝 絮 物 ： 发 生 之 原 因 有 许 多 种 ， 但 普 遍 之 原 因 是 血清 中 之 脂 蛋 白 (lipoprotein) 变 性 及 解 冻 后 血 清 中 存 在 之血 纤 维 蛋 白 (fibrin) 造 成 ， 这 些 凝 絮 沈 淀 物 不 会 影 响 血清 本 身 之 品 质 。 若 欲 减 少 这 些 凝 絮 沈 淀 物 ， 可 用 离 心3000 r

23、pm, 5 min 去 除 ， 或 离 心 后 上 清 液 可 以 加 入 培 养 基中 一 起 过 滤 。 不 建 议 用 过 滤 步 骤 去 除 这 些 凝 絮 沈 淀 物 ，因 为 会 阻 塞 过 滤 膜 。 6.2. 显 微 镜 下 观 察 之 “ 小 黑 点 ” ： 通 常 经 过 热 处 理 之 血清 ， 沈 淀 物 的 形 成 会 显 著 的 增 多 。 有 些 沈 淀 物 在 显 微镜 下 观 察 像 是 “ 小 黑 点 ” ， 常 会 误 认 为 血 清 遭 受 污 染 ，而 将 血 清 放 在 37 中 欲 培 养 此 “ 微 生 物 “ ， 但 在 37环 境 下 ， 又

24、 会 使 此 沈 淀 物 增 多 ， 更 会 误 认 为 微 生 物 之增 殖 ， 但 以 培 养 细 菌 之 培 养 基 检 测 ， 又 没 有 污 染 。 一般 而 言 ， 此 小 黑 点 应 不 会 影 响 细 胞 之 生 长 ， 但 若 怀 疑此 血 清 之 品 质 ， 应 立 即 停 用 ， 更 换 另 一 批 号 的 血 清 。 附 -血 清 之 生 长 测 试 材 料 ： MDCK cell (ATCC CCL-34 或 CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )

25、 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步 骤 ： 1. 以 a-MEM with 10 % FBS (已 测 试 过 ) 培 养 MDCK 细 胞 于 T75 flask 至80% confluency。 2. 以 trypsin-EDTA 处 理 细 胞 ， 离 心 后 ， 加 入 适 量 不 加 血 清 之 a-MEM 制 成 细 胞 悬 浮 液 ， 并 测 细 胞 浓 度 。 以 不 加 血 清 之 a-MEM 稀 释

26、 细 胞浓 度 为 1 102活 细 胞 数 / ml。 3. 将 1 ml 细 胞 悬 浮 液 接 种 入 6-well plate 中 ， 并 另 加 入 1 ml 含 不 同浓 度 的 血 清 (20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之 a-MEM， 使 血 清 最终 浓 度 为 10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。 用 已 测 试 过 之 血 清 同 时 进 行 对 照 组 试 验 。 4. 37 oC， 5 % CO2 培 养 箱 培 养 5-7 天 ， 期 间 不 需 更 换 培 养 基 ， 待细 胞

27、群 落 大 到 可 以 肉 眼 观 察 ， 而 群 落 间 不 互 相 接 触 即 可 。 5. 去 除 培 养 基 ， 加 入 1 ml Carnoys 固 定 液 (甲 醇 :冰 醋 酸 3:1)，室 温 下 静 置 10 min。 6. 去 除 固 定 液 ， 水 洗 二 次 。 7. 加 入 1 ml 10 % Giemsa solution， ， 室 温 下 静 置 染 色 2-3 min。 8. 去 除 染 液 ， 水 洗 二 次 。 9. 以 肉 眼 计 数 群 落 数 10. 计 算 SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. o

28、f colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 计 算 RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比 较 各 浓 度 血 清 培 养 基 之 RPE， 即 可 得 知 待 测 血 清 对 细 胞 生 长的 影 响 。 订 购 多 量 同 一 批 号 的 优 良 血 清 ， 置 于 70 保 存 之 基 础 篇 -细 胞 传 代 培 养 1. 细 胞 生 长 至 高 密 度

29、 时 ， 即 须 分 殖 至 新 的 培 养 瓶 中 ， 一 般 稀 释 比 例 为 1:3 至 1:6，依 细 胞 种 类 而 异 。 2. 材 料 ： 2.1. 无 菌 磷 酸 生 理 缓 冲 液 (Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以 10 ml 分 装 于 15 ml 无 菌 离 心 管 中 ， 保 存 于

30、20 ， 使 用 前 放 在 37 水 槽 回 温 。 2.3. 新 鲜 培 养 基 2.4. 无 菌 吸 管 /离 心 管 /培 养 瓶 3. 步 骤 ： 3.1. 附 着 型 胞 (adherent cell) 3.1.1. 吸 掉 旧 培 养 液 。 3.1.2. 用 D-PBS 洗 涤 细 胞 一 至 二 次 。 3.1.3. 加 入 trypsin-EDTA 溶 液 (1ml/25cm2, 2ml/75cm2)， 37 作 用 数 分 钟 ， 于 倒 立 显 微 镜下 观 察 ， 当 细 胞 将 要 分 离 而 呈 现 圆 粒 状 时 ， 吸掉 trypsin-EDTA 溶 液 。

31、(若 不 移 去 trypsin-EDTA，则 在 trypsin-EDTA 作 用 后 ， 加 入 适 量 含 血 清 之新 鲜 培 养 基 终 止 trypsin 作 用 ， 离 心 后 再 吸 掉 上清 液 。 ) 3.1.4. 轻 拍 培 养 瓶 使 细 胞 自 瓶 壁 脱 落 ， 加 入 适量 之 新 鲜 培 养 基 ， 以 吸 管 上 下 吸 放 数 次 以 打 散细 胞 团 块 ， 混 和 均 匀 后 ， 依 稀 释 比 例 转 移 至 新的 培 养 瓶 中 ， 以 正 常 培 养 条 件 培 养 。 3.2. 悬 浮 型 细 胞 (suspension cell) 3.2.1.

32、 吸 出 细 胞 培 养 液 ， 放 入 离 心 管 中 ， 离 心1000 rpm 5 分 钟 。 3.2.2. 吸 掉 上 清 液 ， 加 入 适 量 之 新 鲜 培 养 基 ，混 和 均 匀 后 ， 依 稀 释 比 例 转 移 至 新 的 培 养 瓶中 ， 以 正 常 培 养 条 件 培 养 。 3.3. 融 合 瘤 (hybridoma) 3.3.1. 有 些 hybridoma cell 需 培 养 三 天 以 上 才 会产 生 抗 体 ， 若 是 更 换 培 养 基 ， 则 可 能 会 失 去抗 体 。 因 此 继 代 培 养 不 需 离 心 后 更 换 培 养 基 ，直 接 添

33、加 新 鲜 培 养 基 稀 释 细 胞 浓 度 即 可 。 若体 积 太 大 ， 可 倾 斜 放 置 ， 或 分 殖 至 新 培 养 瓶中 。 基 础 篇 -细 胞 冷 冻 保 存 （ 一 ）1. 注 意 事 项 ： 1.1. 欲 冷 冻 保 存 之 细 胞 应 在 生 长 良 好 (log phase) 且 存 活 率 高 之 状态 ， 约 为 80 90 致 密 度 。 1.2. 冷 冻 前 检 测 细 胞 是 否 仍 保 有 其 特 有 性 质 ， 例 如 hybridoma 应 在冷 冻 保 存 前 一 至 二 日 测 试 是 否 有 抗 体 之 产 生 。 1.3. 注 意 冷 冻

34、保 护 剂 之 品 质 。 DMSO 应 为 试 剂 级 等 级 ， 无 菌 且 无色 (以 0.22 micronFGLP Telflon 过 滤 或 是 直 接 购 买 无 菌 产 品 ， 如Sigma D-2650)， 以 510 ml 小 体 积 分 装 ， 4 避 光 保 存 ， 勿 作 多 次解 冻 。 Glycerol 亦 应 为 试 剂 级 等 级 ， 以 高 压 蒸 汽 灭 菌 后 避 光 保 存 。在 开 启 后 一 年 内 使 用 ， 因 长 期 储 存 后 对 细 胞 会 有 毒 性 。 1.4. 冷 冻保 存 之 细 胞 浓 度 ： 1.4.1. normal hum

35、an fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml， 细 胞 浓 度 不 要 太 高 ， 某 些hybridoma 会 因 冷 冻 浓 度 太 高 而 在 解 冻 24 小 时 后 死 去 。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106， 依 细 胞 种 类 而 异 。Adenocarcinoma 解 冻 后 须 较 高 之 浓 度 ， 而 HeLa 只 需 1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/m

36、l, human lymphocyte 须 至 少 5 x 106cells/ml。 1.5. 冷 冻 保 护 剂 浓 度 为 5 或 10 DMSO， 若 是 不 确 定 细 胞 之冷 冻 条 件 ， 在 做 冷 冻 保 存 之 同 时 ， 亦 应 作 一 个 backup culture，以 防 止 冷 冻 失 败 。 1.6. 冷 冻 方 法 ： 1.6.1. 传 统 方 法 : 4 10 分 钟 - -20 30 分 钟 - -80 16 - 18 小 时 (或 隔 夜 ) - 液 氮 槽 vapor phase 长 期 储 存 。 1.6.2. 程 序 降 温 ： 利 用 等 速 降

37、 温 机 以 1 -3 /分 钟 之 速 度 由室 温 降 至 120 ， 放 在 液 氮 槽 vapor phase 长 期 储 存 。 适 用于 悬 浮 型 细 胞 与 hybridoma 之 保 存 。 基 础 篇 -细 胞 冷 冻 保 存 （ 二 ）2. 材 料 ： 2.1. 生 长 良 好 之 培 养 细 胞 2.2. 新 鲜 培 养 基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无 菌 塑 料 冷 冻 保 存 管 (Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血 球 计

38、 数 盘 与 盖 玻 片 2.7. 等 速 降 温 机 (KRYO 10 Series II) 3. 步 骤 ： 3.1. 冷 冻 前 一 日 前 更 换 半 量 或 全 量 培 养 基 ， 观 察 细 胞 生 长 情形 。 3.2. 配 制 冷 冻 保 存 溶 液 (使 用 前 配 制 )： 将 DMSO 加 入 新 鲜 培 养基 中 ， 最 后 浓 度 为 5-10 ， 混 合 均 匀 ， 置 于 室 温 下 待 用 。 3.3. 依 细 胞 继 代 培 养 之 操 作 ， 收 集 培 养 之 细 胞 ， 取 少 量 细 胞悬 浮 液 (约 0.1 ml) 计 数 细 胞 浓 度 及 冻

39、前 存 活 率 。 3.4. 离 心 ， 去 除 上 清 液 ， 加 入 适 量 冷 冻 保 存 溶 液 ， 使 细 胞 浓度 为 1-5 x 106 cells/ml， 混 合 均 匀 ， 分 装 于 已 标 示 完 全 之 冷 冻保 存 管 中 ， 1 ml/vial， 并 取 少 量 细 胞 悬 浮 液 作 污 染 检 测 。 3.5. 冷 冻 保 存 方 法 1: 冷 冻 管 置 于 4 10 分 钟 -20 30 分 钟 -80 16 18 小 时 (或 隔 夜 ) 液 氮 槽 vapor phase 长 期 储 存 。 3.6. 冷 冻 保 存 方 法 2: 冷 冻 管 置 于 已

40、 设 定 程 序 之 等 速 降 温 机 中 ，再 放 入 液 氮 槽 中 。 程 序 为 : program 7: HB CELL 基 础 篇 -冷 冻 细 胞 活 化 1. 冷 冻 细 胞 之 活 化 原 则 为 快 速 解 冻 ， 以 避 免 冰 晶重 新 结 晶 而 对 细 胞 造 成 伤 害 ， 导 致 细 胞 之 死 亡 。 2. 细 胞 活 化 后 ， 约 需 数 日 ， 或 继 代 一 至 二 代 ， 其细 胞 生 长 或 特 性 表 现 才 会 恢 复 正 常 (例 如 产 生 单株 抗 体 或 是 其 它 蛋 白 质 )。 3. 材 料 37 恒 温 水 ， 新 鲜 培 养

41、 基 ， 无 菌 吸 管 / 离 心 管 / 培 养 瓶 ， 液 氮 或 干 冰 容 器 4. 步 骤 ： 4.1 操 作 人 员 应 戴 防 护 面 罩 及 手 套 ， 防 止 冷 冻 管 可 能 爆 裂 之伤 害 。 4.2 自 液 氮 或 干 冰 容 器 中 取 出 冷 冻 管 ， 检 查 盖 子 是 否 旋 紧 ，由 于 热 胀 冷 缩 过 程 ， 此 时 盖 子 易 松 掉 。 4.3 将 新 鲜 培 养 基 置 于 37 C 水 槽 中 回 温 ， 回 温 后 喷 以 70 % 酒 精 并 擦 拭 之 ， 移 入 无 菌 操 作 台 内 。 4.4 取 出 冷 冻 管 ， 立 即

42、放 入 37 C 水 槽 中 快 速 解 冻 ， 轻 摇 冷冻 管 使 其 在 1 分 钟 内 全 部 融 化 ， 以 70 % ethanol 擦 拭 保 存 管 外部 ， 移 入 无 菌 操 作 台 内 。 4.5 取 出 0.9 ml 解 冻 之 细 胞 悬 浮 液 ， 缓 缓 加 入 有 培 养 基 之 培 养容 器 内 (稀 释 比 例 1:10 1:15)， 混 合 均 匀 ， 放 入 CO2 培 养 箱 培养 。 另 取 0.1 ml 解 冻 细 胞 悬 浮 液 作 存 活 测 试 。 4.6 解 冻 后 是 否 立 即 去 除 冷 冻 保 护 剂 (例 如 DMSO 或 gly

43、cerol)，依 细 胞 种 类 而 异 ， 一 般 而 言 ， 大 都 不 需 要 立 即 去 除 冷 冻 保 护剂 。 惟 若 要 立 即 去 除 ， 则 将 解 冻 之 细 胞 悬 浮 液 加 入 含 有 5-10 ml 培 养 基 之 离 心 管 内 ， 离 心 1,000 rpm, 5 分 钟 ， 移 去 上 清 液 ，加 入 新 鲜 培 养 基 ， 混 合 均 匀 ， 放 入 CO2 培 养 箱 培 养 。 4.7 若 不 需 立 即 去 除 冷 冻 保 存 剂 ， 则 在 解 冻 培 养 后 隔 日 更 换 培 养 基 。 基 础 篇 -收 到 细 胞 的 处 理 方 式 (一

44、)1. 收 到 细 胞 株 包 裹 时 ， 请 检 查 细 胞 株 冷 冻 管 是 否 有 解冻 情 形 ， 若 有 请 立 即 通 知 。 细 胞 株 请 尽 速 开 始 培 养 ， 或 立 即 冷 冻 保 存 (置 于 70 C， 隔 夜 后 ， 移 到 液 氮 )。 2. 冷 冻 细 胞 解 冻 程 序 : 2.1. 依 据 细 胞 株 数 据 单 指 定 之 基 础 培 养 基 种 类 、 血 清 种类 和 其 它 指 定 之 成 份 和 比 例 ， 制 备 培 养 基 。 绝 大 多 数 之细 胞 均 无 法 立 即 适 应 不 同 之 基 础 培 养 基 或 不 同 之 血 清 种

45、类 ， 若 因 实 验 需 要 ， 必 须 有 所 不 同 时 ， 务 必 以 缓 慢 比例 渐 次 改 变 培 养 基 组 成 ， 确 定 细 胞 适 应 后 ， 方 进 行 所需 之 实 验 。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚 牛 血 清 ), CS (calf serum, 小牛 血 清 )和 HS (horse serum, 马 血 清 )， 对 细 胞 而 言 差 异 极大 ， 请 务 必 依 据 细 胞 株 资 料 单 指 定 之 血 清 种 类 培 养 之 。 2.3. 将 培 养 基 置 于 37 C 水 槽 中 回 温 ， 回 温 后 喷 以

46、70 % 酒精 并 擦 拭 之 ， 移 入 无 菌 操 作 台 内 。 取 出 冷 冻 管 ， 立 即 放 入37 C 水 槽 中 快 速 解 冻 ， 水 面 高 度 不 可 接 近 或 高 过 冷 冻 管之 盖 沿 ， 否 则 易 发 生 污 染 。 轻 摇 冷 冻 管 使 其 在 1 分 钟 内 全部 融 化 后 ， 以 70 % ethanol 擦 拭 冷 冻 管 外 部 ， 移 入 无 菌 操作 台 内 。 2.4. 依 据 细 胞 种 类 和 浓 度 ， 于 无 菌 操 作 台 内 取 10 ml 培 养 基加 至 T25 或 T75 flask中 。 取 出 已 解 冻 之 细 胞

47、 悬 浮 液 ， 缓 缓 加入 T25 或 T75 flask 内 之 培 养 基 ， 混 合 均 匀 ， 放 入 37 C， 5 % CO2 培 养 箱 培 养 。 2.5. 对 绝 大 多 数 细 胞 而 言 ， 1 % 以 下 之 冷 冻 保 护 剂 DMSO，不 会 对 细 胞 之 贴 附 或 活 化 有 不 良 影 响 ， 不 需 立 刻 由 解 冻 细胞 中 去 除 ， 待 第 二 天 确 定 细 胞 生 长 或 贴 附 良 好 后 再 去 除 即可 。 惟 对 极 少 数 因 对 DMSO 敏 感 或 会 造 成 细 胞 分 化 之 细 胞 ，需 立 即 去 除 DMSO 者 ，

48、 则 可 将 解 冻 后 之 细 胞 悬 浮 液 放 入 5 - 10 ml 培 养 基 中 ， 离 心 300 xg (约 1000 rpm)， 5 分 钟 ， 小 心 移去 上 清 液 ， 加 入 适 量 新 鲜 培 养 基 ， 将 细 胞 均 匀 混 合 后 ， 转移 至 培 养 瓶 中 ， 再 放 入 37 C， 5 % CO2 培 养 箱 培 养 。 基 础 篇 -收 到 细 胞 的 处 理 方 式 (二 )收 到 T25 flask 细 胞 时 ， 处 理 方 式 为 1. 于 寄 送 过 程 中 ， 为 避 免 起 泡 造 成 细 胞 脱 落 死 亡 ，T25 flask 均 加

49、 满 培 养 基 。 请 检 查 flask 外 观 ， 并 于显 微 镜 下 观 察 细 胞 生 长 状 况 和 有 无 污 染 现 象 ， 若 有 任何 问 题 ， 不 要 打 开 盖 子 ， 请 立 即 通 知 细 胞 实 验 室 。 2. 将 原 封 之 T25 flask 静 置 于 37 C， 5 % CO2 培养 箱 中 ， 使 细 胞 回 温 至 37 C， 并 让 运 送 过 程 中 少 数脱 落 的 细 胞 可 再 附 着 生 长 。 隔 天 后 ， 于 无 菌 操 作 箱 内取 出 flask内 之 培 养 基 ， (取 出 之 培 养 基 可 以 再 使 用 )，仅 留

50、 约 5-10ml 培 养 基 于 flask 内 ， 依 一 般 培 养 方 式 再将 细 胞 置 入 培 养 箱 中 ， 或 细 胞 已 长 满 盘 ， 则 将 细 胞 做传 代 培 养 。 附 -细 胞 计 数 与 存 活 测 试 （ 一 ） 1. 原 理 ： 1.1. 计 算 细 胞 数 目 可 用 血 球 计 数 盘 或 是 Coulter counter 粒 子 计 数器 自 动 计 数 。 1.2. 血 球 计 数 盘 一 般 有 二 个 chambers， 每 个 chamber 中 细 刻 9 个 1 mm2 大 正 方 形 ， 其 中 4 个 角 落 之 正 方 形 再 细

51、 刻 16 个 小 格 ， 深 度 均 为0.1 mm。 当 chamber 上 方 盖 上 盖 玻 片 后 ， 每 个 大 正 方 形 之 体 积 为 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。 使 用 时 ， 计 数 每 个 大 正 方 形 内 之 细 胞数 目 ， 乘 以 稀 释 倍 数 ， 再 乘 以 104， 即 为 每 ml 中 之 细 胞 数 目 。 1.3. 存 活 测 试 之 步 骤 为 dye exclusion， 利 用 染 料 会 渗 入 死 细 胞 中 而呈 色 ， 而 活 细 胞 因 细 胞 膜 完 整 ， 染 料 无 法 渗 入 而 不 会 呈 色

52、 。 一 般 使 用蓝 色 之 trypan blue 染 料 ， 如 果 细 胞 不 易 吸 收 trypan blue， 则 用 红色 之 Erythrosin bluish。 附 -细 胞 计 数 与 存 活 测 试 （ 二 ）2. 材 料 ： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取 0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及 0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶 于 100 m

53、l Ca+/Mg+ free saline 血 球 计 数 盘 及 盖 玻 片 (Hemocytometer and coverslip) ， 计 数 器 (counter) ，低 倍 倒 立 显 微 镜 粒 子 计 数 器 (Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步 骤 ： 3.1. 取 50ml 细 胞 悬 浮 液 与 50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体 积 混 合 均 匀 于 1.5ml 小 离 心 管 中 。3.2. 取 少 许 混 合 液 (约 15ml) 自 血 球 计 数 盘 chamb

54、er 上 方 凹 槽 加 入 ， 盖 上 盖玻 片 ， 于 100 倍 倒 立 显 微 镜 下 观 察 ， 活 细 胞 不 染 色 ， 死 细 胞 则 为 蓝 色 (或 红 色- Erythrosinbluish)。 3.3. 计 数 四 个 大 方 格 之 细 胞 总 数 ， 再 除 4， 乘 以 稀 释 倍 数 (至 少 乘 以 2， 因 与 trypan blue等 体 积 混 合 )， 最 后 乘 以 104， 即 为 每 ml 中 细 胞 悬 浮 液 之 细 胞 数 。若 细 胞 位 于 线 上 ， 只 计 上 线 与 右 线 之 细 胞 (或 计 下 线 与 左 线 之 细 胞 )

55、。 4 大 格 *细 胞 总 数 x 2 x 104 / 4= 细 胞 数 /ml *每 一 大 格 的 体 积 = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若 不 用 血 球 计 数 盘 ， 可 用 Coulter counter 作 自动 计 数 ， 惟 无 法 辨 别 死 细 胞 或 活 细 胞 。 3.5. 范 例 ： T75 monolayer culture 制 成 10ml 细 胞 悬 浮 液 ， 取0.1 ml 溶 液 与 0.1ml trypan blue 混 合 均 匀 于 试 管中 ， 取 少 许 混 合 液 加 入 血 球 计 数 盘

56、 ， 计 数 四 大 方 格 内之 细 胞 数 目 。 活 细 胞 数 /方 格 ： 55 ,62, 49, 59 死 细 胞 数 /方 格 ： 5, 3, 4, 6 细 胞 总 数 = 243 平 均 细 胞 数 /方 格 = 60.75 稀 释 倍 数 = 2 细 胞 数 /ml： 60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细 胞 数 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存 活 率 ： 225/243 92.6 % 升 级 篇 -细 胞 培 养 11 冷 冻 管 应 如 何 解 冻 ？ 取 出 冷 冻 管 后 ， 须 立 即 放 入

57、 37 C 水 槽 中 快 速 解冻 ， 轻 摇 冷 冻 管 使 其 在 1 分 钟 内 全 部 融 化 ， 并 注意 水 面 不 可 超 过 冷 冻 管 盖 沿 ， 否 则 易 发 生 污 染 情形 。 另 冷 冻 管 由 液 氮 桶 中 取 出 解 冻 时 ， 必 须 注 意安 全 ， 预 防 冷 冻 管 之 爆 裂 。 2 细 胞 冷 冻 管 解 冻 培 养 时 ， 是 否 应 马 上 去 除 DMSO？ 除 少 数 特 别 注 明 对 DMSO 敏 感 之 细 胞 外 ， 绝 大 部分 细 胞 株 （ 包 括 悬 浮 性 细 胞 ） ， 在 解 冻 之 后 ， 应直 接 放 入 含 有

58、 10-15ml新 鲜 培 养 基 之 培 养 角 瓶 中 ， 待 隔 天 再 置 换 新 鲜 培 养 基 以 去 除 DMSO 即 可 ， 如此 可 避 免 大 部 分 解 冻 后 细 胞 无 法 生 长 或 贴 附 之 问题 。 3 可 否 使 用 与 原 先 培 养 条 件 不 同 之 培 养 基 ？ 不 能 。 每 一 细 胞 株 均 有 其 特 定 使 用 且 已 适 应 之细 胞 培 养 基 ， 若 骤 然 使 用 和 原 先 提 供 之 培 养 条件 不 同 之 培 养 基 ， 细 胞 大 都 无 法 立 即 适 应 ， 造 成 细 胞 无 法 存 活 。 4 可 否 使 用 与

59、 原 先 培 养 条 件 不 同 之 血 清 种 类 ？ 不 能 。 血 清 是 细 胞 培 养 上 一 个 极 为 重 要 的 营 养来 源 ， 所 以 血 清 的 种 类 和 品 质 对 于 细 胞 的 生 长会 产 生 极 大 的 影 响 。 来 自 不 同 物 种 的 血 清 ， 在一 些 物 质 或 分 子 的 量 或 内 容 物 上 都 有 所 不 同 ，血 清 使 用 错 误 常 会 造 成 细 胞 无 法 存 活 。 升 级 篇 -细 胞 培 养 25 何 谓 FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal ca

60、lf serum) 是 相同 的 意 思 ， 两 者 都 是 指 胎 牛 血 清 ， FCS 乃 错 误 的使 用 字 眼 ， 请 不 要 再 使 用 。 CS (calf serum) 则 是 指小 牛 血 清 。 HS (horseserum) 则 是 指 马 血 清 。 6 培 养 细 胞 时 应 使 用 5 % 或 10% CO2？ 或 根 本 没 有影 响 ？ 一 般 培 养 基 中 大 都 使 用 HCO3-/CO32-/H+ 作 为 pH 的缓 冲 系 统 ， 而 培 养 基 中 NaHCO3 的 含 量 将 决 定 细胞 培 养 时 应 使 用 的 CO2 浓 度 。 当 培

61、养 基 中 NaHCO3 含 量 为 每 公 升 3.7 g 时 ， 细 胞 培 养 时 应 使 用 10 % CO2； 当 培 养 基 中 NaHCO3 为 每 公 升 1.5 g 时 ， 则 应使 用 5 % CO2 培 养 细 胞 。 7 何 时 须 更 换 培 养 基 ？ 视 细 胞 生 长 密 度 而 定 ， 或 遵 照 细 胞 株 基 本 数 据 上 之 更 换 时 间 ， 按时 更 换 培 养 基 即 可 。 8 培 养 基 中 是 否 须 添 加 抗 生 素 ？ 除 于 特 殊 筛 选 系 统 中 外 ， 一 般 正 常 培 养 状 态 下 ， 培 养 基 中 不 应添 加 任

62、 何 抗 生 素 。 9 附 着 性 细 胞 继 代 时 所 使 用 之 trypsin-EDTA 浓 度 ？ 应 如 何 处 理 ？ 一 般 使 用 之 trypsin-EDTA 浓 度 为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。 第一 次 开 瓶 后 应 立 即 少 量 分 装 于 无 菌 试 管 中 ， 保 存 于 20 C， 避免 反 复 冷 冻 解 冻 造 成 trypsin 之 活 性 降 低 ， 并 可 减 少 污 染 之 机 会 。 10 悬 浮 性 细 胞 应 如 何 继 代 处 理 ？ 一 般 仅 需 持 续 加 入 新 鲜 培 养 基 于 原 培 养

63、 角 瓶 中 ， 稀 释 细 胞 浓 度 即可 ， 若 培 养 液 太 多 时 ， 可 将 培 养 角 瓶 口 端 稍 微 抬 高 ， 直 到 无 法容 纳 为 止 。 分 瓶 时 取 出 一 部 份 含 细 胞 之 培 养 液 至 另 一 新 的 培 养 角瓶 ， 加 入 新 鲜 培 养 基 稀 释 至 适 当 浓 度 ， 重 复 前 述 步 骤 即 可 。 升 级 篇 -细 胞 培 养 311 欲 将 一 般 动 物 细 胞 离 心 下 来 ， 其 离 心 速 率 应 为 多 少 转 速 ？ 欲 回 收 动 物 细 胞 ， 其 离 心 速 率 一 般 为 300 xg (约 1,000rp

64、m)，5 - 10 分 钟 ， 过 高 之 转 速 ， 将 造 成 细 胞 死 亡 。 12 细 胞 之 接 种 密 度 为 何 ？ 依 照 细 胞 株 基 本 数 据 上 之 接 种 密 度 或 稀 释 分 盘 之 比 例 接种 即 可 。 细 胞 数 太 少 或 稀 释 的 太 多 亦 是 造 成 细 胞 无 法 生 长之 一 重 要 原 因 。 13 细 胞 冷 冻 培 养 基 之 成 份 为 何 ？ 动 物 细 胞 冷 冻 保 存 时 最 常 使 用 的 冷 冻 培 养 基 是 含 5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 % 原 来 细

65、胞 生 长 用 之 新鲜 培 养 基 均 匀 混 合 之 。 注 意 ： 由 于 DMSO 稀 释 时 会 放 出 大量 热 能 ， 故 不 可 将 DMSO 直 接 加 入 细 胞 液 中 ， 必 须 使 用 前 先 行 配 制 完 成 。 14 DMSO 之 等 级 和 无 菌 过 滤 之 方 式 为 何 ？ 冷 冻 保 存 使 用 之 DMSO 等 级 ， 必 须 为 Tissue culture grade之 DMSO (如 Sigma D2650)， 其 本 身 即 为 无 菌 状 况 ， 第 一 次 开 瓶 后 应 立 即 少量 分 装 于 无 菌 试 管 中 ， 保 存 于 4

66、C， 避 免 反 复 冷 冻 解 冻 造 成DMSO 之 裂 解 而 释 出 有 害 物 质 ， 并 可 减 少 污 染 之 机 会 。 若 要 过 滤DMSO， 则 须 使 用 耐 DMSO 之 Nylon 材 质 滤 膜 。15 冷 冻 保 存 细 胞 之 方 法 ？ 冷 冻 保 存 方 法 一 : 冷 冻 管 置 于 4 C 3060 分 钟 (-20 C30 分 钟 *) -80 C 1618 小 时 (或 隔 夜 ) 液 氮 槽 vaporphase 长 期 储 存 。 冷 冻 保 存 方 法 二 : 冷 冻 管 置 于 已 设 定 程 序 之 可 程 序 降 温 机 中 每 分钟 降 1-3 C 至 80 C 以 下 ， 再 放 入 液 氮 槽 vapor phase长 期 储 存 。*-20 C 不 可 超 过 1 小 时 ， 以 防 止 冰 晶 过 大 ， 造 成 细 胞 大 量 死 亡 ，亦 可 跳 过 此 步 骤 直 接 放 入 -80 C 冰 箱 中 ， 惟 存 活 率 稍 微 降 低 一 些 。 升 级 篇 -细 胞 培 养 416 细 胞 欲 冷 冻 保 存