《凝胶层析》PPT课件.ppt

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1、层 析CH ROMATOG RAPH Y 掌 握 ： 凝 胶 的 结 构 与 性 质 凝 胶 层 析 的 基 本 原 理 装 层 析 柱 的 过 程 及 装 柱 要 求 熟 悉 ： 层 析 技 术 的 分 类 凝 胶 层 析 的 特 点 层 析 的 概 念 、 一 般 原 理 了 解 ： 凝 胶 的 选 择 柱 、 样 品 、 洗 脱 液 的 选 择 凝 胶 的 保 存 一 .概 述 层 析 Chromatography(色 谱 ),利 用 混 合物 中 各 组 分 的 物 理 化 学 性 质 间 的 差 异 (溶 解度 、 分 子 极 性 、 分 子 大 小 、 分 子 形 状 、 吸附 能

2、 力 、 分 子 亲 合 力 等 ) ， 使 各 组 分 在 支 持物 上 集 中 分 布 在 不 同 区 域 ， 借 此 将 各 组 分分 离 。 层 析 法 进 行 时 有 两 个 相 ， 一 个 相称 为 固 定 相 (Stationary phase )， 另 一相 称 为 流 动 相 (Mobile phase )。 由 于 各组 分 所 受 固 定 相 的 阻 力 和 流 动 相 的 推力 影 响 不 同 ， 各 组 分 移 动 速 度 也 各 异 ，从 而 使 各 组 分 得 到 分 离 。 二 .层 析 技 术 的 分 类 1. 按 两 相 所 处 的 状 态 分 类 以 液

3、体 作 为 流 动 相 的 层 析 称 为 液 相 层析 ， 以 气 体 作 为 流 动 相 的 称 为 气 相 层 析 。 其 固 定 相 也 可 有 两 种 状 态 ， 一 种 是 以固 体 作 为 吸 附 剂 的 固 定 相 ， 另 一 种 是 以 涂布 在 固 体 载 体 表 面 的 液 体 作 为 固 定 相 。 层 析 气 相 层 析 （ gas-chromatography）液 相 层 析 （ liquid-chromatography） 气 -固 层 析 （ gas-solid chromatography）气 -液 层 析 （ gas-liquid chromatograph

4、y）液 -固 层 析 （ liquid-solid chromatography）液 -液 层 析 （ liquid-liquid chromatography） 2.按 层 析 过 程 的 机 制 可 分 为.吸 附 层 析 (adsorption chromatography ) -利 用 吸 附 剂 对 不 同 组 分 吸 附 能 力 的 不 同 加 以 分 离 的 方 法 。.分 配 层 析 (partition chromatography ) -利 用 不 同 组 分 在 流 动 相 和 固 定 相 中 的 分 配 系 数 不 同 而 进 行 分 离 的 方 法 。 .离 子 交

5、换 层 析（ ion-exchange chromatography ） -利 用 离 子 交 换 剂 与 各 组 分 之 间 的 离 子 亲 和 力 不 同 而 进 行 层 析 分 离 的 方 法 。.凝 胶 层 析 （ gel chromatography） -利 用 不 同 组 分 之 间 分 子 大 小 不 同 ， 在 通 过凝 胶 介 质 时 所 受 到 的 阻 滞 作 用 的 差 异 而 进行 分 离 的 方 法 。.亲 和 层 析 （ affinity chromatography）-利 用 生 物 大 分 子 之 间 特 有 亲 和 力 的 不 同 进分 离 纯 化 的 方 法

6、 。 3.按 操 作 技 术 形 式 分 类.柱 层 析 （ colum chromatography） -将 固 定 相 装 在 层 析 柱 中 ， 使 样 品 朝 着 一 个 方 向 移 动 ， 通 过 各 组 分 随 流 动 相 流动 而 得 到 分 离 的 方 法 。 纸 层 析 （ paper chrmatography） -用 纸 作 为 液 体 的 载 体 ， 样 品 点 在 纸 上 随 后 展 开 达 到 分 离 鉴 定 的 方 法 。.薄 层 层 析 （ thin layper chromatography） -将 适 当 的 吸 附 剂 在 玻 璃 板 或 其 他 材 料

7、薄 板 上 铺 成 薄 层 ， 样 品 点 在 上 面 随 后 用 流 动 相 展 开 达 到 分 离 鉴 定 的 方 法 。 三 .层 析 的 一 般 原 理 二 、 塔 板 理 论 最 早 由 Martin等 人 提 出 塔 板 理 论 ， 把 色谱 柱 比 作 一 个 精 馏 塔 ， 沿 用 精 馏 塔 中 塔 板的 概 念 来 描 述 组 分 在 两 相 间 的 分 配 行 为 ，同 时 引 入 理 论 塔 板 数 作 为 衡 量 柱 效 率 的 指标 。 凝 胶 层 析 G el Chromatography 一 、 定 义 凝 胶 层 析 是 按 照 被 分 离 物 质 分 子 大

8、小 ,经 过 具 有 一 定 孔 径 的 多 孔 物 质 进 行 分 离的 一 种 方 法 。 其 又 称 为 凝 胶 过 滤 或 分 子 筛过 滤 或 排 阻 层 析 。 主 要 机 理 是 分 子 筛 效 应 ,当 被 分 离 物 质流 经 凝 胶 柱 时 ,因 各 组 份 的 分 子 大 小 不 同 ,在凝 胶 受 到 的 阻 滞 作 用 有 差 异 ,从 而 造 成 各 组分 在 凝 胶 柱 中 的 迁 移 速 度 不 同 得 到 分 离 。 二 .基 本 原 理 流 动 相 （ 洗 脱 液 ）固 定 相 （ 凝 胶 ） 原 理 ： 被 分 离 物 质 中 各 组 分 的 分 子 量不

9、 同 。 进 入 具 有 一 定 孔 径 的 凝 胶 柱 后 ,较 大 的分 子 不 能 进 入 凝 胶 孔 隙 中 ,被 排 阻 在 外 ,而 较小 的 分 子 则 能 进 入 凝 胶 孔 隙 ,加 入 洗 脱 剂 后 ,大 分 子 就 随 洗 脱 剂 从 凝 胶 间 隙 洗 脱 下 来 ,受到 的 阻 力 小 ,其 流 速 较 快 ,小 分 子 物 质 从 上 一层 凝 胶 孔 隙 中 出 来 又 扩 散 到 下 一 层 凝 胶 孔隙 中 ,这 样 多 次 反 复 ,大 分 子 物 质 先 从 柱 中 流出 ,小 分 子 物 质 后 流 出 。 小 分 子 由 于 扩 散 作 用 进 入

10、凝 胶 颗 粒 内部 而 被 滞 留 ,大 分 子 被 排 阻 在 凝 胶 颗 粒 外 面 ,在 颗 粒 之 间 迅 速 通 过 。 三 、 常 用 术 语 1 固 定 相 固 定 相 是 由 层 析 基 质 组 成 的 。 其 基 质 包 括 ： 固 体 物 质 (如 吸 附 剂 、 离 子 交 换 剂 ) 液 体 物 质 (如 固 定 在 纤 维 素 或 硅 胶 上 的 溶 液 )， 这 些 物 质 能 与 相 关 的 化 合 物 进 行 可 逆 性 的 、和 作 用 。 2 流 动 相 在 层 析 过 程 中 推 动 固 定 相 上 的 物 质 向 一 定 方 向移 动 的 称 为 流

11、动 相 。 在 柱 层 析 时 ， 流 动 相 又 称 或 (即推 动 有 效 成 分 或 杂 质 向 一 定 方 面 移 动 的 溶 液 )。 在 薄 层 层 析 时 ， 流 动 相 又 称 。 3 层 析 以 基 质 为 固 定 相 (柱 状 或 薄 层 状 )， 以 液 体 或 气 体 为 流 动 相 ， 有 效 成 分 和 杂 质 在 这 两 个 相 中 连 续 多 次 地 进 行、 或 作 用 ， 最 终 结 果 是 使 混 合 物 得 到 分 离 。 4 操 作 容 量 即 在 特 定 条 件 下 ， 某 种 成 分 与 基 质 达 到 平衡 时 ， 存 在 于 基 质 上 的 ；

12、 一 般 以 每 克 (或 毫 升 )基 质 结 合 某 种 成 分 的 毫 摩尔 数 或 毫 克 数 来 表 示 。 (mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml) 其 数 值 大 ， 表 明 基 质 对 某 种 成 分 的 结 合 力 强 ；否 则 反 之 。 5 床 体 积 (Vt) 通 常 床 体 积 是 指 膨 胀后 的 基 质 在 层 析 柱 中所 占 有 的 体 积 (Vt)。 Vt是 基 质 的 外 水 体 积(V0)和 内 水 体 积 (Vi)以及 自 身 体 积 (Vg)的， 即 : (详 见 图 3-1) 6 洗 脱 体 积 (Ve) 洗 脱 体 积 是 指

13、 某 一 成分 从 柱 顶 部 到 底 部 的洗 脱 液 中 出 现 浓 度 达到 最 大 值 时 的 流 动 相体 积 。 用 Ve表 示 (见图 3-7中 OB)。 7 外 水 体 积 (V0) 外 水 体 积 指 基 质 颗 粒 之 间 体 积 的 总 和 。 8 内 水 体 积 (Vi) 内 水 体 积 是 指 基 质 颗 粒 内 部 体 积 的 总 和 。 9 基 质 体 积 (Vg) 基 质 体 积 是 指 基 质 自 身 所 具 有 的 体 积 。 V0、 Vi 、 Vg都 是 随 着 床 体 积 和 基 质 性 质 变 化而 变 化 的 。 + 凝 胶 过 滤 层 析 所 用

14、的 基 质 是 具 有 立 体 网 状 结 构 、 筛 孔 直径 较 一 致 ， 且 呈 珠 状 颗 粒 的 物 质 。 这 种 物 质 可 完 全 或 部 分 排阻 某 些 大 分 子 化 合 物 于 筛 孔 之 外 ， 而 小 分 子 化 合 物 则 可 以 在筛 孔 中 自 由 扩 散 和 渗 透 。 某 种 组 分 凝 胶 层 析 柱 中 被 排 阻 的 程度 用 分 配 系 数 表 示avk ot oeav VV VVk 洗 脱 体 积 ； 外 水 体 积 ； 凝 胶 床 体 积 eV oV tV 在 一 定 层 析 条 件 下 ， 和 均 为 固 定 值 ， 而 随 着 被 分 离

15、 物 分 子 量 的变 化 而 变 化 。 组 分 分 子 量 越 大 ， 则 洗 脱 更 容 易 （ 排 阻 越 多 ） ， 越 小 ， 越 小tV oV eV eV avk 各 组 分 间 的 值 差 异 越 大 ， 分 离 效 果 越 好 ； 差 异 越 小 ,则 分 离 效 果 很 差 ， 或 根 本 无 法 分 离 流 出 物 用 部 分 收 集 器 等 量 或 等 时 收 集 ， 检 测 后 分 段 合 并相 同 组 分 的 各 管 流 出 物 ， 得 到 分 子 量 不 同 的 各 种 组 分avk avk 1、 当 K av=0时 ， 则 Ve=Vo ， 即 对 于 根 本不

16、能 进 入 凝 胶 内 部 的 大 分 子 物 质 全 排 阻 ，洗 脱 体 积 等 于 空 隙 体 积 即 外 水 体 积 （ 图中 组 分 ） 2、 当 K av=1时 ， Ve=Vo+Vi 。 即 小 分 子可 完 全 渗 入 凝 胶 内 部 时 ， 洗 脱 体 积 应 为空 隙 体 积 与 内 水 体 积 之 和 。 Ve=Vo+Vi （ 图 中 组 分 ） 3、 当 0 Kav 1时 ， Ve=Vo+ Kav（ Vi Vg ） 。 表 示 固 定 相中 只 有 一 部 分 可 被 组 分 扩 散 渗 入 ， 一 部 分 被 排 阻 ， Ve即 在Vo与 Vo+Vi Vg之 间 变 化

17、 （ 图 中 组 分 ）4、 有 时 Kav 1， 表 示 凝 胶 对 组 分 有 吸 附 作 用 （ 从 内 水 中洗 脱 出 来 的 含 量 下 降 ） ， 此 时 Ve Vo+Vi Vg。 例 如 一 些 芳香 族 化 合 物 如 苯 丙 氨 酸 ， 酪 氨 酸 和 色 氨 酸 等 在 Sephadex G-25中 的 洗 脱 体 积 远 超 出 理 论 计 算 的 最 大 值 10 膨 胀 度 在 一 定 溶 液 中 ， 单 位 重 量 的 基 质 充 分 溶胀 后 所 占 有 的 体 积 用 V 表 示 。 即 每 克 溶胀 基 质 所 具 有 的 床 体 积 。 V = Vt /

18、g 一 般 亲 水 性 基 质 的 膨 胀 度 比 疏 水 性 的 大 。 三 .凝 胶 层 析 的 特 点 （ 一 ） 优 点 1.凝 胶 是 一 种 不 带 电 荷 的 惰 性 载 体 。 其 结 构 稳 定 ,所 以 凝 胶 本 身 不 与 样 品 发 生 化 学 反 应 。 2.凝 胶 层 析 的 操 作 条 件 较 温 和 ,不 易 引 起 生 物 物 质 的 变 性 ,即 使 用 来 分 离 一 些 理 化 性 质 不 稳 定 的 物 质 也 很 少 被 破 坏 。 3.样 品 得 率 高 ,重 复 性 好 .如 果 按 比 例 扩 大 柱 的 体 积 和 高 度 ,可 进 行 大

19、 量 样 品 的 分 离 纯 化 。 （ 二 ） 缺 点1.要 求 样 品 和 洗 脱 液 的 粘 度 很 低 。2.凝 胶 颗 粒 网 络 孔 径 大 小 非 常 有 限 ,所 以 可 被 纯 化 的 物 质 的 分 子 量 范 围 受 到 限 制 。3.凝 胶 结 构 对 某 些 溶 质 分 子 具 有 吸 附 作 用 ,如 芳 香 族 化 合 物 与 脂 蛋 白 等 。 四 .凝 胶 的 结 构 与 性 能 1.葡 聚 糖 凝 胶 （ 商 品 名 为 Sephadex） 结 构 ： 葡 聚 糖 用 交 联 剂 1-氯 代 -2 ,3-环 丙 烷 使 葡 聚 糖之 间 通 过 醚 键 (C

20、-O-CH 2-CH -CH 2-O-)交 联 聚 合 而 成 的 三 维 空 间 网 状 结 构 。OH 1. 特 点 ： Sephadex 的 三 维 空 间 网 状 结 构 的 网 孔 大 小 取 决 于 交联 度 ,交 联 度 的 大 小 可 在 合 成 Sephadex 时 控 制 加 入交 联 剂 的 百 分 比 决 定 .交 联 剂 的 百 分 比 高 ,交 联 度 大 ,网 状 结 构 愈 紧 密 ,孔 隙 愈 小 ,吸 水 后 膨 胀 也 愈 小 ,机 械强 度 高 ,分 离 物 质 的 分 子 量 也 小 。 反 之 ,交 联 剂 的 百分 比 低 ,分 离 物 质 的 分

21、 子 量 大 。 G 类 Sephadex的 型 号表 示 每 克 干 凝 胶 吸 水 量 x10,如 G -50表 示 每 克 干 凝 胶吸 水 量 为 5ml。Sephadex的 化 学 性 质 稳 定 ,不 溶 于 水 、 盐 、 弱 酸 和 碱 , 耐 热 耐 碱 不 耐 酸 。 2 稳 定 性 葡 聚 糖 凝 胶 在 水 溶 液 、 盐 溶 液 、 碱 溶 液 、 弱酸 溶 液 和 有 机 溶 剂 中 是 稳 定 的 、 不 溶 解 的 ， 而 且很 少 产 生 化 学 降 解 。 在 中 性 条 件 下 ， 葡 聚 糖 凝 胶 悬 浮 液 可 置 高 温(120 )消 毒 0.5h

22、， 其 性 质 并 不 改 变 。 在 0.1mol/ L HCl溶 液 中 浸 泡 1-2h， 甚 至 在 0.02mol L HCl溶 液 中 浸 泡 6个 月 以 上 ， 对 分 离 效 果 无 明 显 的 影响 。 但 是 ， 当 暴 露 于 强 酸 或 氧 化 剂 溶 液 时 ， 则 容易 使 糖 苷 键 水 解 断 裂 ， 因 此 ， 要 避 免 与 其 接 触 。 3 吸 附 性 葡 聚 糖 凝 胶 系 弱 酸 性 物 质 、 这 是 由 于 其 每 克 干胶 含 10 20ug当 量 的 羧 基 基 团 所 致 。 该 基 团 能 与 分离 物 中 电 荷 基 团 (尤 其 是

23、 碱 性 蛋 白 质 )发 生 吸 附 作 用 。当 离 子 强 度 大 于 0.05时 ， 一 般 对 弱 碱 性 蛋 白 质 就 无吸 附 力 了 。 因 此 进 行 葡 聚 糖 凝 胶 层 析 时 ， 常 用 含 有NaCl的 缓 冲 液 作 洗 脱 液 。 2.琼 脂 糖 凝 胶 （ 商 品 名 为 Sepharose) 它 是 一 种 大 孔 凝 胶 ,其 工 作 范 围 的 下 限 几 乎 是 Sephadex的 上 限 ,可 分 离 MW40万 以 上 的 物质 ,因 此 可 用 来 分 离 核 酸 及 病 毒 。琼 脂 糖 凝 胶 不 带 电 荷 ,不 受 微 生 物 作 用

24、而 降 解 ,但 对 热 不 稳 定 ,易 受 pH 影 响 (只 在 pH 4.5-9.0范 围 内 稳 定 . 琼 脂 糖 凝 胶 的 机 械 强 度 和 筛 孔 的 稳 定 性 都 比葡 聚 糖 凝 胶 好 ， 分 离 范 围 大 。 用 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 柱层 析 时 ， 流 速 可 以 快 些 。 最 好 使 用 条 件 控 制 在 pH 4 9之 间 ， 温 度 040 ， 超 出 此 范 围 ,可 能 被 破 坏 。 琼 脂 糖 凝 胶 规 格 瑞 典 和 国 产 的 产 品 有 3种 规 格 ： Sepharose 2B、 4B、 6B分 别 表 示 琼 脂 糖 浓

25、度为 2%、 4%、 6%。 美 国 的 为 Bio G A， 有 6个 型 号 : 即 Bio-G 0.5M， 1.5M， 5M， 15M， 50M和150M。 阿 拉 伯 数 字 乘 以 106表 示 排 阻 限 度 。 3.聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶使 用 范 围 及 效 果 同 葡 聚 糖 凝 胶 相 似 ,但 化 学 性质 较 葡 聚 糖 稳 定 ,可 在 pH 2-11范 围 内 使 用 .聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 商 品 为 生 物 胶 P （ Bio-G el P） ， 由 美 国 Bio-Rod厂 生 产 ， 型 号 很多 ， 从 P-2至 P-300共 10种 ， P

26、 后 面 的 数 字 再乘 1000就 相 当 于 该 凝 胶 的 排 阻 限 度 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 结 构单 体 丙 烯 酰 胺 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 一 般 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 均 制 成 珠 状 颗 粒 ， 并以 干 凝 胶 形 式 出 售 ， 使 用 时 必 须 溶 胀 。 稳 定 性 ： 该 凝 胶 不 溶 于 水 和 普 通 有 机 溶 剂 ，能 忍 受 浓 的 盐 、 尿 素 和 胍 盐 等 溶 液 的 浸 泡 ； 在PH1-10或 短 时 间 超 过 此 pH范 围 的 溶 液 中 较 稳 定 ，要 避 免 长 期 与 强 酸 和 强 碱 接 触

27、 ， 如 果 与 其 接 触并 在 高 温 条 件 下 ， 酚 胺 基 将 迅 速 发 生 分 解 。 物 理 化 学 性 质 吸 附 性 ： 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 对 芳 香 族 的 、 酸 性和 碱 性 的 化 合 物 稍 有 吸 附 现 象 ， 如 使 用 离 子 强 度略 高 的 洗 脱 液 操 作 ， 此 弊 病 可 以 克 服 。 不 为 微 生 物 利 用 ， 易 保 存 。 4、 Sephacryl Sephacryl是 由 烯 丙 烷 基 葡 聚 糖 与 甲 撑 双 丙烯 酰 胺 共 价 交 联 制 成 的 ， 此 凝 胶 属 硬 性 凝 胶 ，它 具 有 一 定 大

28、小 的 筛 孔 和 少 量 的 羧 基 基 团 。 Sephacryl吸 水 时 ， 其 珠 状 颗 粒 直 径 为 25-75um， 通 常 是 用 于 水 相 系 统 中 。 若 在 有 机 相 系统 使 用 时 ， 其 孔 径 大 小 略 有 变 化 。 化 学 性 质 稳 定 ： 它 在 所 有 的 溶 剂 中 不 溶 解 ， 化 学 降 解 也 很少 ； 它 可 在 pH2 11范 围 内 使 用 ， 当 pH低 时 ， 葡聚 糖 链 发 生 少 许 水 解 作 用 ； 在 0.2mol/LNaOH溶 液中 (室 温 )处 理 100h， 对 其 低 流 速 和 多 孔 性 没 有

29、明显 影 响 ;用 去 污 剂 (如 SDS)、 6mo1 L盐 酸 胍 和8mol/L尿 素 溶 液 可 作 为 洗 脱 剂 ， 高 温 (120 )消毒 (pH7.0时 )处 理 后 ， 层 析 性 质 没 有 明 显 变 化 。 S-100/200/300/400/500;HR200/300/400/500 5、 Superdex Superdex是 由 高 交 联 度 多 孔 琼 脂 糖 与 葡 聚 糖共 价 结 合 而 成 的 。 该 凝 胶 具 有 良 好 的 分 子 筛 特 性 和 物 理 、 化 学稳 定 性 。 在 用 其 分 离 样 品 过 程 中 ， 溶 液 的 酸 碱

30、度可 在 pH3-12范 围 内 变 化 ， 溶 液 中 加 入 去 污 剂 (如 1 SDS)和 (或 )解 离 剂 (如 8mol/L尿 素 、 6mol L盐酸 胍 )时 ， 也 不 会 影 响 分 离 效 果 。 适 合 作 大 规 模 生 产 凝 胶 层 析 的 填 料 。 缺 点 ： 对 蛋 白 质 有 吸 附 能 力 。 6.凝 胶 的 选 择 选 择 何 种 凝 胶 以 及 它 的 型 号 ,这 需 要 根据 实 验 条 件 ,溶 质 的 分 子 量 的 大 小 和 分 离 工作 的 目 的 而 定 ,每 种 型 号 凝 胶 都 有 一 定 分 离溶 质 分 子 量 的 范 围

31、 ,选 择 的 型 号 凝 胶 要 能 满足 实 验 要 求 。 六 .其 它 条 件 选 择 1.柱 的 选 择 层 析 的 长 度 （ L） 与 直 径 （ D） 之 比 （ L/D）对 层 析 分 辨 率 有 影 响 ,一 般 对 用 于 组 别 分 离 的 层 析柱 其 L/D为 15 18： 1,层 析 柱 的 体 积 一 般 大 于 样 品体 积 的 4 10倍 ,这 类 常 用 于 脱 盐 .对 于 分 级 分 离 可采 用 L/D 40： 1,甚 至 100： 1,层 析 柱 体 积 一 般 大 于样 品 体 积 的 25倍 。 柱 短 而 粗 ,则 易 使 样 品 稀 释 ,

32、柱 长 而 窄 ,则 柱 的 管 壁效 应 较 大 ,会 造 成 拖 尾 现 象 。 2.样 品 的 选 择 ： 量 适 当 , 粘 度 小 。 3.洗 脱 液 的 选 择 ： 每 种 样 品 分 离 所 用 的 缓 冲 洗 脱 液 应 根 据 使 样品 稳 定 的 原 则 使 用 。 七 .应 用 1.分 离 纯 化 2.脱 盐 3.测 分 子 量 4.高 分 子 溶 液 的 浓 缩 凝 胶 层 析 法 分 离 蛋 白 质 操 作 1. 装 柱 ： 在 层 析 柱 的 底 部 出 口 套 上 乳 胶 塑 料管 ， 向 层 析 柱 内 加 蒸 馏 水 赶 走 在 层 析 柱 的死 体 积 和

33、接 口 处 的 气 泡 ， 在 蒸 馏 水 高 度 约占 体 积 的 1/3时 ， 关 闭 下 端 出 口 ， 自 顶 部 缓缓 加 入 已 处 理 好 的 Sephadex G -50悬 液 ， 待底 部 凝 胶 沉 积 12cm时 ， 再 打 开 出 口 ， 凝 胶加 至 凝 胶 沉 积 离 层 析 柱 口 约 3cm即 可 。 装 柱 注 意 点 ： 不 得 有 气 泡 和 分 层 ； 凝 胶 表 面 应 平 整 ； 柱 床 体 积 稳 定 ； 不 能 让 凝 胶 表 面 露 出 水 面 。 凝 胶 柱 的 鉴 定 新 装 的 吸 附 柱 用 适 当 的 缓 冲 液 平 衡 后 ， 将

34、带色 的 蓝 色 葡 聚 糖 -2000、 或 者 红 色 葡 聚 糖 、 细 胞 色素 C、 血 红 蛋 白 等 物 质 配 成 2mg/ml的 溶 液 过 柱 ， 观察 色 带 是 否 均 匀 下 降 ， 如 均 匀 下 降 ， 则 表 明 柱 中凝 胶 是 均 匀 的 ， 或 者 说 柱 中 没 裂 缝 和 气 泡 ， 是 可以 使 用 的 ， 否 则 就 须 重 新 装 柱 。 2. 加 样 ： 取 样 品 液 5滴 即 为 上 柱 样 品 。 将 出口 打 开 ， 使 表 面 的 蒸 馏 水 流 出 ， 直 至 恰 好与 表 面 相 平 （ 不 可 使 床 面 干 掉 ） ， 关 紧

35、 出口 ， 用 滴 管 将 上 述 样 品 缓 缓 地 加 到 床 表 面 ，注 意 尽 量 不 要 使 平 整 的 床 表 面 搅 动 ， 然 后打 开 出 口 ， 让 样 品 进 入 床 内 ， 直 至 床 面 恰好 露 出 ， 用 上 法 不 断 加 蒸 馏 水 洗 涤 ， 立 即用 试 管 收 集 ， 待 红 色 流 尽 ， 换 试 管 收 集 。 加 样 量 与 层 析 柱 床 体 积 及 检 测 方 法 的 灵 敏 度 有 关 。 床 体积 越 小 、 方 法 灵 敏 度 越 高 时 ， 加 样 量 越 少 层 析 的 目 的 在 于 分 析 时 ， 加 样 量 占 床 体 积 的

36、 1 2 ， 作制 备 、 脱 盐 用 时 ， 占 20 30 一 般 来 说 ， 加 样 量 越 少 ， 分 辨 率 越 高 。 具 体 加 样 体 积 由分 配 系 数 (K av)或 洗 脱 体 积 (Ve)来 决 定加 样 量 VeA、 VeB： 组 分 A、 B的 洗 脱 体 积 KavA、 KavB： 组 分 A、 B的 分 配 系 数 Vs： A、 B两 组 分 的 洗 脱 体 积 之 差 （ 又 称 为 分 离 体 积 ）Vs= VeA VeB 当 样 品 体 积 Vp Vs时 ， 理 论 上 的 洗 脱 图 形 是 两 种 物 质 恰好 分 开 (图 中 )。 但 由 于 样

37、 品 流 过 柱 时 的 扩 散 作 用 ， 其 体积 会 逐 渐 增 大 ， 致 使 其 洗 脱 体 积 远 比 原 来 大加 样 量 （ Vp） 的 确 定 图 、 中 A、 B两 种 物 质 有 一 定 程 度 的 交 叉 ， 这 表 明二 者 只 是 部 分 分 开 。 因 此 ， 当 Vp等 于 或 大 于 Vs时 ， A、 B两 种物 质 就 不 能 完 全 分 开 (图 中 ) 当 Vp Vs时 ， A、 B两 种 物 质 就 能 分 开 (图 中 ) 根 据 Ve = Vo + Kav（ Vi +Vg） 又 Vs = VeA VeB = （ KavA KavB ） （ Vi +

38、Vg） A、 B两 种 物 质 能 分 开 的 最 低 限 ： Vp Vs最 大 Vs时 的 必 要 条 件 ： KavA KavB 最 大 ， 为 1 0 1 Vi +Vg最 大 ， 一 般 为 Vt/2则 ： 最 大 理 论 加 样 量 Vp Vs Vt/2 最 大 理 论 加 样 量 的 计 算 粘 度 对 柱 层 析 的 影 响 样 品 与 洗 脱 液 的 黏 度 相 当 为 宜 流 速 对 洗 脱 曲 线 的 影 响 3. 洗 脱 4、 凝 胶 柱 的 再 生 及 保 存 （ 1） 、 再 生 仅 使 用 过 一 次 的 凝 胶 柱 ， 通 常 进 行 更 新 平 衡 后 即 可再

39、次 使 用 ； 但 使 用 过 多 次 后 ， 由 于 凝 胶 床 体 积 变 小 、 流动 速 度 降 低 或 污 染 杂 质 过 多 等 原 因 ， 致 使 其 正 常 性 能 受到 影 响 。 在 此 情 况 下 ， 如 欲 重 复 使 用 ， 就 须 进 行 再 生 处理 。 方 法 是 ： 先 用 水 反 复 进 行 逆 向 冲 洗 ， 再 用 缓 冲 液 进行 平 衡 ， 平 衡 毕 ， 即 可 重 复 使 用 ； 另 一 种 方 法 是 ， 把 凝胶 倒 出 ， 用 低 浓 度 的 酸 或 碱 按 其 预 处 理 方 法 进 行 ， 处 理后 重 新 装 柱 即 可 再 行 使

40、用 。 （ 2） 保 存 方 法 ： 湿 法 ： 洗 净 的 凝 胶 悬 浮 于 蒸 馏 水 和 缓 冲 液 中 ， 应 加 入 适量 的 防 腐 剂 如 氯 仿 、 0.05 NaN3或 20 乙 醇 等 ， 不 然 微 生 物将 生 长 。 干 法 ： 用 浓 度 逐 步 升 高 的 乙 醇 洗 净 凝 胶 ， 使 其 脱 水 收 缩 ，再 抽 干 乙 醇 ， 用 60-80 的 暖 风 吹 干 ， 在 室 温 下 保 存 。 半 缩 法 ： 是 过 度 法 ， 用 60%-70%的 乙 醇 使 凝 胶 部 分 脱 水 ，然 后 封 口 ， 4 保 存 。 凝 胶 过 滤 层 析 经 常

41、遇 见 的 问 题 1 流 速 慢（ 1） 有 气 泡 、 出 水 管 阻 塞（ 2） 硅 胶 层 堵 塞（ 3） 柱 压 太 紧 （ 操 作 压 过 大 、 长 期 使 用 、 接 头 漏 气 ） 2 柱 内 产 生 气 泡 （ 1） 上 水 口 不 流 或 皮 管 破 裂 ， 洗 脱 液 外 流（ 2） 接 口 漏 气 ， 如 上 水 口 螺 丝 拧 的 不 紧 3 条 带 扭 曲 （ 1） 胶 面 不 平（ 2） 样 品 或 洗 脱 液 中 有 颗 粒（ 3） 装 柱 不 均 匀4 分 辩 率 不 高 （ 1） 装 柱 不 均 匀 （ 2） 样 品 量 过 大（ 3） 流 速 太 快（

42、4） 柱 不 垂 直 或 柱 不 合 适（ 5） 长 菌 （ 6） 柱 下 口 软 管 太 长（ 7） 胶 不 适 当 原 理 ： 盐 类 小 分 子 物 质 进 入 凝 胶 筛 孔 ， 而 大 分 子 物 质 则 被排 阻 在 外 （ 分 子 筛 原 理 ）优 点 ： 与 透 析 相 比 ， 速 度 快 ， 不 会 引 起 大 分 子 物 质 变 性材 料 ： 细 颗 粒 葡 聚 糖 凝 胶 G-25 二 、 脱 盐 和 浓 缩 原 理 ： K av = b lgM + c 或 lgM = a dK av (M为 分 子 质 量 ，常 数 a、 b、 c、 d均 大 于 0) 先 做 标 准

43、 曲 线 ， 再 在 相 同 条 件 下 测 样 品 K av 也 可 用 以 下 4个 指 标 代 替 Ve Vo： 分 离 体 积 Ve/Vo： 相 对 保 留 体 积 （ 另 R Vo/Ve） Ve/Vt： 简 化 的 洗 脱 体 积 ， 受 柱 的 填 充 情 况 的 影 响 较 小 Ve： 洗 脱 体 积 lgM = a bVe 特 点 ： 简 便 实 用 ， 所 需 样 品 量 较 少 三 、 测 定 分 子 质 量 pH68的 范 围 内 ， 曲 线 线 性 才 比 较 好 ； 而 在 极 端 pH时 ， 由于 变 性 等 原 因 易 偏 高 一 般 适 用 于 球 状 pro的

44、 分 子 量 测 定 ， 而 纤 维 状 pro不 合 适 糖 蛋 白 中 若 糖 的 比 例 5 时 ， 测 定 结 果 偏 大 不 受 变 性 剂 如 尿 素 和 盐 酸 胍 的 影 响 有 些 酶 类 不 适 用 。 如 淀 粉 酶 ， 能 与 葡 聚 糖 凝 胶 形 成 络 合物 ， 这 种 络 合 物 与 酶 -底 物 络 合 物 相 似 ， 因 此 在 凝 胶 层 析 时有 异 常 反 应用 凝 胶 过 滤 法 测 定 分 子 量 的 局 限 性 2003年 中 科 院 考 研 题n 今 有 a、 b、 c、 d四 种 蛋 白 质 ， 其 分 子 体 积 由 大到 小 的 顺 序

45、是 abcd， 在 凝 胶 过 滤 柱 层 析 中 ，最 先 洗 脱 出 来 的 蛋 白 质 一 般 应 该 是 （ ）n A、 an B、 bn C、 c n D、 d 2000年 中 科 院 考 研 题2003年 上 海 师 范 大 学 考 研 题n 指 出 从 分 子 排 阻 层 析 柱 上 洗 脱 下 来 下 列 蛋 白 质时 的 洗 脱 顺 序 ， 为 什 么 ？ 分 离 蛋 白 质 的 范 围 是5,000-400,000。n 肌 红 蛋 白 （ 马 心 肌 ） 16900n 过 氧 化 氢 酶 （ 马 肝 ） 247500n 细 胞 色 素 c（ 牛 心 肌 ） 13370n 肌

46、 球 蛋 白 （ 鳕 鱼 肌 ） 524800 n 糜 蛋 白 酶 原 （ 牛 胰 ） 23240n 血 清 清 蛋 白 （ 人 ） 68500 1 在 凝 胶 层 析 柱 中 分 离 某 有 效 成 分 时 ， 洗 脱 体 积 为140ml， 其 外 水 体 积 和 总 体 积 分 别 为 60ml和 200ml， 求 分配 系 数 是 多 少 ?思 考 题 解 ： Ve= Vo+ Kav （ Vt Vo ） 140= 60 + Kav （ 200 60） Kav=0.57 解 ： 最 大 理 论 加 样 量 Vp=Vs=Vt/2 =3.14 (5.0/2)2 60/2 =589ml思 考 题2 在 5.0cm 60cm的 凝 胶 柱 中 脱 盐 时 ， 就 理 论 值 而 言 ， 最 多 加 样 体 积 是 多 少 毫 升 ?