发酵工程的研究状况和进展

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1、1 发 酵 工 程 的 研 究 状 况 和 进 展陈 坚江 南 大 学 2 发 酵 工 程 的 研 究 状 况 3生 物 质 原 料 化 学 品 精 细 化 学 品 大 宗 化 学 品 食 品 添 加 剂 生 物 塑 料 溶 剂 酚 类 粘 合 剂 脂 肪 酸 碳 黑 、 颜 料 燃 料 、 香 料 、 墨 水 洗 涤 剂生 物 能 源 生 物 酒 精 生 物 柴 油 甲 醇 氢 气 沼 气工 业 生 物 技 术 主 要 部 分 -发 酵 工 程 4 发 酵 ： 生 物反 应 过 程上 游加 工 过 程 加 工 过 程下 游成 本 经 济 学原 料 的 生 物具 有应 用 价 值 目 的 产

2、物大 规 模工 艺 开 发传 统 诱变 、 分子 生 物 学 、 组学 发 酵 工 程广 义 的 概 念 ： 生 物 学 (微 生 物 学 、生 物 化 学 )和 工 程 学 (化 学 工 程 ) 结 合 t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F q p / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 狭 义 的 发 酵 概 念 ： 微 生 物 培 养 和 代 谢 过 程 微 生 物 生 长底 物 消 耗产 物 生 成 5

3、获 得 应 用 价 值 的 微 生 物 反 应 器 及 过 程 放 大 发 酵 过 程 优 化 和 控 制 发 酵 工 程 研 究 发 酵 产 物 分 离 提 取 6 发 酵 工 程 的 关 键 问 题 和 工 程 意 义微 生 物 能 够 积 累 最 大 目 的 产 物 (产 量 )的 条 件 是 什 么 ？ 高 产 量 便 于 产 品 分离 提 取关 键 问 题 1 工 程 意 义 1相 关 ： 微 生 物 生 理 、 遗 传 特 性 和 营 养 、 环 境 因 素 7 底 物 最 多 被 微 生 物 转 化 为 产 物(转 化 率 )的 条 件 是 什 么 ？ 粮 食 原 料 为 底 物

4、 高 转 化 率 降 低 原 料 成 本关 键 问 题 2 工 程 意 义 2相 关 ： 微 生 物 代 谢 途 径 和 过 程 条 件发 酵 工 程 的 关 键 问 题 和 工 程 意 义 8 微 生 物 最 快 速 度 发 酵 生 产 目 的产 物 的 条 件 是 什 么 ？ 分 批 操 作 为 主 高 生 产 强 度 缩 短 生 产 周 期工 程 意 义 3关 键 问 题 3相 关 ： 微 生 物 反 应 动 力 学 和 系 统 优 化发 酵 工 程 的 关 键 问 题 和 工 程 意 义 9 条 件确 定 过 程优 化初 始条 件 过 程分 析 过 程强 化发 酵 优 化 的 研 究

5、思 想 ： 发 酵 是 一 个 过 程 10 基 于 细 胞 表 观 特 性 进 行 优 化0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基 于 细 胞 内 部 分 析 进 行 优 化高 产 量高 底物 转化 率 高 生产 强度优 化 策 略在 理 论 和 技 术 上 有 突 破 ,在 工 业 生 产 中 能 广 泛 应 用显

6、 著 提 高 发 酵 过 程 的 经 济 性 和 科 学 性研 究 方 法 11 1优 化 微 生 物 生 长 的 物 理 和 化 学 环 境保 证 微 生 物 生 长 处 于 最 适 条 件基 本 思 想 奠 定 基 础基 于 底 物 运 输 、 生 化 反 应 、 产 物 排 出确 定 不 同 环 境 条 件 对 微 生 物 生 长和 代 谢 产 物 分 布 的 影 响 Prod. Distribution 发 酵优 化 12 培 养 基 组 成 的 优 化 技 术 发 酵 环 境 条 件 的 优 化 技 术 确 定 培 养 基 组 分 的 最 小 用 量 ， 避 免 底 物 的 过 量

7、或 不 足 减 少 副 产 物 的 形 成 ， 使 底 物 转 化 率 明 显 提 高 对 关 键 物 质 的 浓 度 及 其 供 给 方 式 进 行 优 化 ， 使 目 标 产 物 产量 明 显 提 高 分 析 不 同 环 境 条 件 下 微 生 物 的 生 理 学目 的 内 容 13 2基 于 微 生 物 代 谢 特 性 的 分 阶 段 培 养 技 术控 制 环 境 条 件 在 最 适 合 细 胞 生 长 或 最 适合 产 物 合 成 的 水 平 。目的 分析 不 同 T、 pH、RPM、 DO发 酵 过 程 的 动 力 学 参 数 (，qp， qs)流 变 学 参 数 的 变 化 特 性

8、分 阶 段 控 制 策 略提出 分 阶 段 T、pH、 RPM、DO发 酵优 化 14利 用 分 阶 段 培 养 技 术 还 可 以 将 细 胞 生 长 期 和 产 物形 成 期 人 为 分 开 ， 从 而 实 现 优 化 发 酵 过 程 的 目 的 。T， pH, DO, RPM 15 3基 于 反 应 动 力 学 和 人 工 智 能 的 优 化 和 控 制 技 术建 立 动 力 学 模 型 ， 求 解 参数 并 评 价 其 适 用 性对 发 酵 进 程 和 产 量指 标 进 行 预 测 Model FormMonod Constant yield u = umax s/(K m + s)

9、Y x/s = Y0Substrate inhibition Constant yield u = u max s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0Substrate inhibition Variable yield u = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition InhibitionsConstants yields u = umax s/(Km + s + s2/Ki) u = umax

10、o (1 - P/P m )q p = alpha. u+ betaalpha, beta and Y p/s 以 数 学 模 型 为 基 础 的 优 化优 化 发 酵 过 程发 酵优 化 16 以 生 理 模 型 为 基 础 的 优 化采 用 人 工 神 经 网 络 、 专 家 系统 、 模 糊 逻 辑 控 制 技 术对 发 酵 过 程进 行 在 线 状态 预 测 和 模式 识 别 自 适 应 最 优化 控 制 系 统的 开 发 、 计算 机 模 拟 和实 际 应 用 17 4参 考 已 知 的 生 化 反 应 计 量 关 系 、代 谢 途 径 、 生 理 、 特 征 ， 构 建 、合 成

11、不 同 产 物 的 代 谢 网 络 。利 用 代 谢 通 量 分 析 方 法 ， 计 算 得出 胞 内 各 条 代 谢 途 径 的 通 量 变 化 。发 酵优 化 18 分 析 不 同 发 酵 产 品 合 成 途 径 中 主 要 代 谢 节 点 的 性 质 ，结 合 发 酵 过 程 中 胞 内 能 量 代 谢 情 况 ， 提 出 一 系 列 发 酵优 化 策 略 。 19长 期 胁 迫 可 遗 传 性 的 应答 （ 遗 传 变 异 ）短 期 胁 迫 不 可 遗 传 性 的应 答 （ 生 理 性 的 )Pyruvate NAD+NADH ADPATPethanolAnaerobic Aerobi

12、cMitochondrionATP环 境 压 力 或 胁 迫饥 饿 、 高 温 、 高 压 、 机 械 剪 切 、 冷 冻 、 强 酸 、 强 碱 、高 渗 透 压 （ 高 盐 ） 、 活 性 氧 、 有 毒 化 学 物 质 等 等细 胞 结 构 、 基 因 转 录 和 蛋 白 表 达 的 临 时 改 变 ， 酶 原 的激 活 以 及 代 谢 途 径 的 临 时 调 整 等 5基 于 环 境 胁 迫 条 件 下 微 生 物 生 理 应 答 的 过 程优 化 技 术发 酵优 化 20 研 究 一 些 重 要 的 工 业 微 生 物 的 抗 胁 迫 因 子 及 其 抗 胁 迫机 制 ， 考 察 环

13、 境 胁 迫 条 件 下 特 定 微 生 物 蛋 白 转 录 和 代谢 途 径 变 化 ， 采 用 不 同 环 境 胁 迫 手 段 或 措 施 对 微 生 物的 生 长 或 代 谢 进 行 调 控 ， 促 进 微 生 物 生 长 或 大 量 合 成目 的 产 物 。 学 术 思 想 21 学 术 思 想6基 于 微 生 物 代 谢 的 辅 因 子 调 控 的 过 程 优 化 技 术Cofactors Metal ionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ ATP/ADP/AMP CoA/Acetyl-CoAVitamins 发 酵优 化研 究 辅 因 子 形 式 及 其 浓 度 在 物

14、质 代 谢 和 信 号 传 递 途 径 中 控 制 代 谢流 方 向 和 流 量 分 配 的 作 用 机 制 、 物 质 流 和 辅 因 子 流 的 变 化 规 律 ，对 微 生 物 的 生 长 或 代 谢 进 行 调 控 ， 促 进 微 生 物 合 成 目 的 产 物 的 代谢 流 的 最 大 化 和 快 速 化 。 22蛋白质组学 组学Discovery-driven转录组学代谢组学通量组学DNA芯片技术二维电泳/质谱技术多维色谱/质谱技术同位素-核磁共振技术计算生物学 基因组模型化技术实验生物科学Hypothesis-driven分子遗传学分子微生物学蛋白质工程结构生物学代谢工程重组DN

15、A技术蛋白质结晶及晶体衍射技术酶的定向进化技术高通量筛选技术微生物生理学反向代谢工程技术细 胞 功 能 认 识和 优 化生 物 学 知 识 和 技 术 23 工 程 学 方 法 和 规 律工 业 生物过 程 细 胞 群 体 效 应生 化 、 生 理 特 性 分 析物 质 和 能 量 传 递 模 型 过 程 放 大 原 理 和 策 略 发 酵 优 化 系 统 全 局 优 化 与 集 成过 程 优 化细 胞 群 体 效 应 调控 的 直 接 放 大生 物 /化 学 方 法级 联 的 系 统 优 化多 产 物 联 产 目 标的 全 局 调 控发 现和 认识创 新技 术和 方法集 成优 化 细 胞群

16、体单 元过 程 系 统优 化反 应 /分 离 单 元 耦合 集 成生 物 /化 学 级 联 方法多 目 标 联 产 方 法耦 合 技 术基 于 生 理 特 性 的 直接 放 大过 程 集 成 24 发 酵 工 程 研 究 举 例 25 举 例 1： 丙 酮 酸 发 酵 GlucosePyruvate AlanineAcetaldehyde Ethanol CitrateOAA -KGAcCoAPyruvateOAA PDH(B1, NA)PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) B1： 硫 胺 素NA： 烟 酸Bio： 生 物 素B6： 吡 哆 醛GlucosePyruvate如 何

17、 得 到 丙 酮 酸 高 产 量 发 酵 ？ -菌 株 选 育 和 培 养 条 件 优 化X X XX选 育 自 身 不 能 合 成 维 生 素 的 酵 母 (维 生 素 缺 陷 型 )控 制 培 养 基 中 维 生 素 浓 度Li Y ， Chen J ， Lun S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55:680-685, 57:471-479.Li Y, Chen J, Liang D, Lun S-Y. J. Biotechnol. 2000, 81:27-34 26 t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t

18、 / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F q p / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 动 力 学 分 析高 溶 氧 下 ， 丙 酮 酸 转化 率 较 高 ， 但 生 产 强度 (葡 萄 糖 消 耗 速 度 )较低低 溶 氧 下 ， 葡 萄 糖 消耗 速 度 加 快 ， 然 而 丙酮 酸 产 率 却 明 显 下 降 代 谢 网 络 分 析 Pyr Et14.7PEP74.65.5OAA AcCoA7.9DO=10%Pyr Et2.4PEP94.66.1OAA AcCoA 8.7 DO=85%

19、PEP到 Pyr的 通 量 增 加了 20%， 丙 酮 酸 进 一步 代 谢 的 通 量 下 降 了63.3%高 溶 氧 下 转 化 率高 的 原 因如 何 提 高 丙 酮 酸 发 酵 的 转 化 率 和 生 产 强 度 ？ -分 阶 段 溶 氧 控 制辅 因 子 分 析 NADH ATP39.0 NADH ATP20.7总 ATP下 降 31.4%, NADH下 降 18.6%生 产 强 度(葡 萄 糖 消 耗 速 度 ) 59低 溶 氧 生 产 强 度 高的 原 因 DO=10%DO=85%Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology,

20、2006, 126(2):173-185 Li-Ming Liu, *Jian Chen. FEMS Yeast Research, 2006, 6:11171129 27高 产 量 (89.4 g/L)高 产 率 (0.636 g/g)高 生 产 强 度 (1.95 g/(Lh) 确 定 分 阶 段 供 氧 模 式 :发酵 0-16 h控 制 kLa为 450 h-1，16 h后 将 kLa降 低 至 200 h-1 碳 平 衡 分 析 前 16 h较 高 溶 氧 有 利 于 碳流 合 成 细 胞 ；采 用 单 一 高 或 低 供 氧 模 式 ， 不 能 同 时 达 到 高 转 化 率 和

21、高 生 产 强 度 ！16 h后 耗 氧 速 率 恒 定 ， 碳流 转 向 合 成 丙 酮 酸结 果 0 16h 16 32h 32 48h after 48h kL a / h-1 450 300 200 450 300 200 450 300 200 450 300 200 Glucose 1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cell growth2 47 30 27 17 13 16 13 13 11 3 10 11 Pyruvate 44 41 32 80 60 55 83 70 57 82 78 41 Ethanol 2

22、 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Residual carbon 7 27 39 3 27 29 5 17 32 14 12 48 如 何 提 高 丙 酮 酸 发 酵 的 转 化 率 和 生 产 强 度 ?-分 阶 段 溶 氧 控 制分 阶 段 溶 氧 控 制 ！ 如 何 分 阶 段 ？ Liming Liu,*Jian Chen. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4):825-832 Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2):173-185 2

23、8 PC (Bio)OAA Glucose AcetateAcCoAPDH bypassPyruvate Acetaldehyde EthanolPDC (B1)PyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA-KG 10 g/L59g/L A GlucosePyruvate Acetaldehyde EthanolPDC (B1)PC (Bio)OAA PyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA-KG AcetateAcCoAPDH bypass14 g/L53 g/L B辅 因 子 调 控打 开 丙 酮 酸 脱 氢 酶 系(PDH)途 径 打 开 丙

24、酮 酸 羧 化 酶(PC)途 径 29 L Liu, Y Li, Z Shi, G Du, *J Chen. Metabolic Engineering, 2007, 9(1):21-29 GlucosePyruvate Acetaldehyde EthanolPDC (B1)PC (Bio) OAA PyruvatePDH (B1)AcCoA CitrateOAA-KG AcetateAcCoAPDH bypass21 g/L 48g/L C GlucosePyruvate Acetaldehyde EthanolPDC (B1)PC (Bio) OAA PyruvatePDH (B1)Ac

25、CoA CitrateOAA-KG AcetateAcCoAPDH bypass44 g/L 22 g/LCaCO3 D 同 时 打 开添 加 Ca2+离 子 ， PC活 性 受 Ca2+所 激 活 30 举 例 2： 维 生 素 C发 酵 微 生 物 的 功 能 优 化 与 调 控我 国 是 世 界 最 大 的 维 生 素 C生 产 国 和 出 口 国 ， 2008年 生 产85000吨 ， 产 值 40亿 ， 占 世 界 市 场 90 小 菌 (氧 化 葡 萄 糖杆 菌 G. oxydans ) 大 菌 (巨 大 芽 孢 杆菌 B. megaterium )关 键 科 学 问 题 ： 维

26、生 素 C发 酵 微 生 物 的 功 能 关 系Glu Vc现 况 ： 维 生 素 C两 步 发 酵 工 艺小 菌 单 独 培 养 生 长 、 产 酸 困 难大 菌 本 身 不 产 酸 ， 促 进 小 菌 生 长 和 产 酸 团 队 承 担 的 国 家 863重点 项 目 和 国 家 支 撑 项 目与 南 开 大 学 功 能 基 因 组学 中 心 、 国 内 最 大 Vc生产 企 业 合 作实 现 组 学 技 术 解 决 发 酵工 业 长 期 问 题 的 典 型 31 基 因 组 测 序 步 骤 鸟 枪 法 测 序提 取 基 因组 DNA打 断 基 因组 DNA 基 因 文库 构 建 大 规

27、模测 序 罗 氏 GSFLX高 通 量 基 因 组 测 序 衔 接 子连 接 单 链 DNA与磁 珠 结 合 油 滴 中PCR反 应 序 列 拼 接测 序反 应 填 补 缺 口基 因 组 注 释代 谢 途 径 分 析 小 菌 测 序大 菌 测 序代 谢 途 径 分 析代 谢 途 径 分 析 从 代 谢途 径 角度 解 析两 菌 关系 32 氧 化 葡 萄 糖 酸 杆 菌 中 心 代 谢 途 径 分 析 缺 失 编 码 琥 珀 酸 盐 脱 氢 酶 的 基 因 ，柠 檬 酸 循 环 不 完 全无 编 码 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 合 成 酶， 不 能 通 过 糖 异 生 生 产 C6G.ox

28、ydans基 因 组 含 编 码 氧 化 戊 糖 磷 酸途 径 和 D途 径 的 全 部 酶 基 因缺 失 编 码 磷 酸果 糖 激 酶 的 基因 ， 糖 酵 解 途径 不 完 全 33 蛋 白 质 组 学 小 菌 单 独 发 酵 时胞 内 蛋 白 表 达大 菌 存 在 时 小 菌胞 内 蛋 白 表 达 功 能 蛋 白 确 定， 研 究 大 菌 影响 小 菌 产 酸 的机 制 K. Vulgar B. megaterium 34 发 酵优 化 提 高 糖 酸 转 化 率提 高 VC产 量提 高 生 产 强 度基 因测 序功 能蛋 白产 物解 析 3-磷酸 甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循环大菌特定的

29、代谢途径L-山 梨 酮 2-酮 基 -L-古 龙酸L-山 梨 糖 2-酮基-L-古龙酸生产途径Vc 目 标 1： 确 定 微 生 物 之 间 的 功 能 关 系 ， 提 高 效 能目 标 2： 构 建 Vc一 步 发 酵 菌 株 ， 实 现 重 大 创 新举 例 2： 维 生 素 C发 酵 微 生 物 的 功 能 优 化 与 调 控 35 棉 织 物 化 学 前 处 理 工 艺Singeing Desizing Scouring Bleaching退 浆 淀 粉 、 PVA 精 练角 质 、 果 胶 漂 白 H 2O2化 学 品 /高 温 化 学 品 /高 温 化 学 品 /高 温四 种 酶

30、发 酵与 应 用 的 系统 控 制 优 化 效 果 ：提 高 质 量 节 省 能 源 减 少 排 放国 内 外 ： 加酶 处 理 工 艺 本 课 题 ：全 生 物 处理 工 艺 效 益 ：发 酵 产 值 5亿节 能 能 耗 15亿环 境 效 益 30亿 举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术退 浆 淀 粉 、 精 练角 质 、 果 胶 漂 白淀 粉 酶 /PVA酶 角 质 酶 /果 胶 酶 过 氧 化 氢 酶棉 织 物 生 物 前 处 理 工 艺 36 高 产 菌 株 选 育 产 酶 微 生 物 筛 选菌 株 鉴 定 和 遗 传 改 造分 子 克 隆 和 工

31、程 菌 构 建发 酵 过 程 研 究酶 的 分 离 与 纯 化培 养 基 和 条 件 确 定发 酵 过 程 优 化 策 略过 程 放 大 和 工 业 化分 段 控 制流 加 发 酵低 成 本放 大 技 术 分 离 与 纯 化 方 法酶 的 基 本 性 质工 业 化 提 取 技 术诱 导 胁 迫举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 37 酶 制 剂 应 用 酶 应 用 特 性 和 作 用 机 理复 合 酶 和 酶 组 分 复 配过 程 模 拟 和 最 佳 条 件应 用 效 果 评 价应 用 效 果 比 较 研 究经 济 学 评 价环 境 效 益 分 析举 例

32、3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 38 野 生 菌 筛 选 与 发 酵提 取 高 纯 度 天 然 蛋 白电 泳主 要 斑 点 N端 测 序或 肽 指 纹 术 分 析N端 序 列 /肽 段 分子 量 数 据 库 查 询 获 得 基 因 N端 测 序设 计 核 苷 酸 探 针 杂 交获 得 基 因 生 物 数 据 库 查 询同 源 序 列保 守 序 列 分 析设 计 引 物 扩 增相 关 序 列 片 断获 得 基 因若 出 发 菌 基 因 组 序 列 为已 知 若 出 发 菌 基 因 组 序 列未 知Thermobifida fusca 角 质 酶 角 质 酶 高

33、产 菌 的 构 建 细 菌 来 源 角 质 酶 编 码 基 因 目 前 在 国内 外 未 有 报 道 酶 制 剂 基 因 鉴 定 流 程 举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 39Purification step Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification fold Yield (%)Crude enzyme 234.9 12294 52.34 1 100 (NH4)2SO4 fractionation 46.4 5205.2 112.18 2.14

34、 42.34Phenyl HPSepharose FF 4.75 1521.24 320.26 6.12 12.37DEAE Sepharose FF 2.86 1140.91 398.60 7.61 9.28 Table I Summary of purification of wild-type cutinase from T. fusca天 然 嗜 热 子 囊 菌 角 质 酶 的 纯 化通 过 硫 酸 铵 沉 淀 、 疏 水 色 谱 、 阴 离 子 交 换 色 谱 从 嗜 热 子 囊 菌 发 酵 液 中 分 离 纯 化 得 到 电 泳纯 天 然 角 质 酶角 质 酶 高 产 菌 的 构

35、建举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 40 肽 指 纹 图 谱 鉴 定 角 质 酶 基 因 对 电 泳 纯 天 然 角 质 酶 进 行 肽 指 纹 图 谱 分 析 ， 通 过 数 据 库 比 对 ， 得 到 角 质 酶 的 编 码 基 因(Tfu_0883) 角 质 酶 高 产 菌 的 构 建举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 41 Tfu 0883/pET-20b(+)4558 bpbla (Ap) sequence CutinaseHis tag T7 promoter ColE1 pBR322 origin f1

36、 origin T7 terminator pelB sequence BamHI (199) NcoI (1063) Tfu_0883的 克 隆 、 表 达 和 纯 化 通 过 基 因 工 程 手 段 使 角 质 酶 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 表 达 ， 工 程 菌 发 酵 液 酶 活 达 180 U/mL， 是 野 生 菌 产 酶 的 9.4倍 。 Cutin hydrolysis products F.solani cutinase hydrolysis Aera (%) T. fusca cutinase (Tfu_0882) hydrolysis Aera (%) T.

37、 fusca cutinase (Tfu_0883) hydrolysis Aera (%) P. sp. Lipase hydrolysis Aera (%) Hexadecanoic acid 15.94 2.62 9.27 2.07 10.96 2.89 24.893.71 9-Hexadecenoic acid 0.13 0.02 0.06 0.02 0.09 0.03 0.770.12 Octadecanoic acid 14.99 1.71 9.24 3.01 8.77 2.69 21.614.09 9-Octadecenoic acid 1.74 0.61 0.98 0.36 1

38、.16 0.79 1.390.67 9,12-Octadecadienoic acid 1.08 0.23 1.32 0.37 1.06 0.23 1.330.54 16- Hydroxyhexadecanoic acid 1.65 0.31 5.66 1.14 4.74 0.54 N.D. 10， 16- dihydroxyhexadecanoic acid 10.18 1.12 8.29 2.35 9.15 0.97 N.D. 18-hydroxyoctadeca-9-enoic acid 1.90 0.34 1.03 0.32 1.52 0.12 N.D. 18-hydroxyoctad

39、eca-9,12-dienoic acid 1.98 0.98 9.19 2.25 10.91 1.07 N.D. 9, 10, 18-trihydroxyoctadecanoic acid 1.95 0.42 0.99 0.17 1.78 0.35 N.D. 重 组 Tfu0883具 有 角 质 酶 活 性 pET-20b(+), pelB as signal peptide, C-terminal His-tag E. coli BL21(DE3)Rossetta Ammonia sulfate precipitation, Ni-column 角 质 酶 高 产 菌 的 构 建举 例 3

40、： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 42 调 控 PGL发 酵 过 程 中 底 物 甘 油的 浓 度 和 诱 导 物 甲 醇 的 浓 度 ，实 现 PGL的 高 产 量 和 高 生 产 强度 图 2-3 甲 醇 和 菌 体 浓 度 的 比 值 对 PGL产 量 、生 产 强 度 和 单 位 细 胞 生 产 PGL的 能 力 的 影 响 PGL/100 PGL productivity PGL production per cell 1000 前 期 研 究 结 果 举 例 ：甲 醇 和 菌 体 浓 度 比 值 的 影 响 底 物 流 加 研 究 目 标流 加 策 略

41、甲 醇 流 加 ： 控 制 甲 醇 流 速 ， 将甲 醇 和 菌 体 浓 度 比 值 维 持 在0.165 g/g左 右 甘 油 流 加 ： 细 胞 快 速 生 长 ， 达高 密 度 ；重 组 P. pastoris高 密 度 发 酵 生 产 PGL的 底 物 流 加 策 略 和 温 度 诱 导举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 43 菌 体 生 长 阶 段 的 甘 油 流 加 策 略 0 10 20 30 40 50 60 700204060 80100 0200400600 8001000DO (%) 时 间 (h) 搅拌速率 (r/min) B0 1

42、0 20 30 40 50 60 70020406080100120140160 020406080100DCW, 甘油 (g/L) 时 间 (h) 流加速率 (mL/h) A 细 胞 干 重 在 63 h 达到 122 g/L细 胞 干 重 在 33 h达到 140 g/L 0 5 10 15 20 25 30 3502040 6080100 02004006008001000DO (%) 时 间 (h) 搅拌速 率 (r/min) B0 5 10 15 20 25 30 35020406080100120140160 020406080100120DCW, 甘油 (g/L) 时 间 (h)

43、 流加速率 (mL/h) A 重 组 P. pastoris高 密 度 发 酵 生 产 PGL的 底 物 流 加 策 略 和 温 度 诱 导举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 44 诱 导 阶 段 的 甲 醇 流 加 策 略 0 24 48 72 96 1200100200 300400500 0102030 40506070DCW, 甲醇 (g/L), PGL (U/mL) 时 间 (h) DO (%), F (mL/h), q s (g/g DC W/h)图 2-6 甲 醇 流 加 控 制 下 的 发 酵 过 程 曲 线 DCW PGL Methano

44、l Feeding rate - - - qs 1000 DO (1) 诱 导 前 期 (08 h)以 2 ml/h的 速 度 逐 步 提 高 甲 醇 流 加 速 度 ， 使 培 养 液 中 甲 醇 浓 度 接 近 20 g/L；(2) 诱 导 中 期 (890 h)将 甲 醇 流 加 速 度 控 制 在 9.7 mL/h以 维 持 体 系 中 甲 醇 浓 度 为 20 g/L； (3) 诱 导 后 期 (90 h以 后 )， DO上 升 ， 将 流 速 维 持 在 2 mL/h。成 功 将 甲 醇 与 菌 体 浓 度 比 例 控 制0.1630.171 g/g。 发 酵 结 束 时 PGL酶

45、 活 达 到 430 U/mL， 生 产 强 度 达 到4.34 U/mL/h。 重 组 P. pastoris高 密 度 发 酵 生 产 PGL的 底 物 流 加 策 略 和 温 度 诱 导举 例 3： 染 整 关 键 酶 制 剂 的 发 酵 与 应 用 技 术 45 举 例 4： 透 明 质 酸 发 酵 过 程 优 化 与 控 制透 明 质 酸 三 级 结 构 优 良 理 化 性 质 ： 粘 弹 性 高 保 湿 性 生 物 相 容 性 食 品 添 加 剂 关 节 炎 治 疗化 妆 美 容高 粘 度 和 低 溶 氧 传 递 速 率 是 HA发 酵 过 程 的 重 要 瓶 颈乳 酸 对 细 胞

46、 生 长 和 HA合 成 有 着 较 强 的 抑 制 作 用细 胞 生 长 和 HA合 成 之 间 存 在 对 碳 源 和 关 键 辅 因 子 的 竞 争HA发酵 存 在问 题 46 透 明 质 酸 发 酵 过 程 的 混 合 与 传 质 特 性 优 化 研 究问 题 ( ) 高 粘 度 和 低 溶 氧 传 递 速 率 是 HA发 酵 过 程 的 重 要 瓶 颈溶 氧水 平表 观黏 度 有 效 搅拌 区 域体 积 溶 氧 传递 系 数 0 nK 3 2 221.36c ofD P N DD r 3 50.001o pP N N D r (%) 100 ca fTV T 有 效 搅 拌 区 域

47、模 型 0 5 10 15 200200400 600 Culture time (h) Agi tati on spe ed (rpm ) 0 5 10 15 200 100 200 300 400 500 Culture time (h) Bro th v isco sity (m Pas ) 0 5 10 15 200 20 40 60 Culture time (h) K La (h- 1 ) 0 5 10 15 200 30 60 90 120 Culture time (h) DO lev el ( %) (a) (b) (c) (d)有 效 搅 拌 区 域 控 制 模 型 的 混

48、 合 与 传 质 动 力 学 (Va=1） 剪 切 力 对 菌 体 形 态 影 响理 想 HA发 酵 模 式 ： 低 剪 切 、 高 传 质 、 高 溶 氧 47 降 解 透 明 质 酸 提 高 发 酵 过 程 的 混 合 及 传 质 效 率问 题 ( ) 高 粘 度 和 低 溶 氧 传 递 速 率 是 HA发 酵 过 程 的 重 要 瓶 颈酶 法 降 解 HA提 高 混合 与 传 质 效 率 氧 化 还 原 降 解 HA提 高 混 合 与 传 质 效 率 FT-IR分 析 结 果过 氧 化 氢 /抗 坏 血 酸 氧 化 还 原 降 解 HA 氧 化 还 原降 解 HA没有 破 坏 其基 本

49、结 构单 元 0 5 10 15 20051015 Culture time (h)Cell concentration (g/L) 0 5 10 15 20020406080 Culture time (h)Sucrose concentration (g/L)0 5 10 15 2002468 Culture time (h)HA concentration (g/L) 0 5 10 15 200204060 Culture time (h)Lactic acid concentration (g/L)(a) (b)(c) (d)HA氧 化 还 原 降 解 对 HA发 酵 的 影 响添 加

50、 H2O2/抗 坏 血 酸 对 流 体 力 学 影 响 48 Transglutaminase (TGase, Protein glutamine -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 )举 例 5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通 过 N-(-谷 酰 胺 ) 赖 氨 酸 键 交 联 蛋 白 质 催 化 蛋 白 质 中 Gln的 -羧 酰 胺 基 与 伯 胺 间 发生 转 移 反 应 蛋 白 质 脱 酰 胺 作 用 通 过 形 成 脂 键 共 价 连 接

51、蛋 白 质 和 脂 肪 酸 的 长链 -羟 基 目 前 唯 一 商 业 化 并 大 规 模 生 产 的 可 在 蛋 白 质间 形 成 共 价 交 联 的 酶 制 剂 49 Activation Mechanism of TransglutaminasePre-Pro-TGaseSecreted from cells folding Pro-TGase Inhibitor (TAPI)Inhibition Protease-inhibitor complexsactivationSerine Protease MetalloProteaseTGase Pro-region (AAs)+ Dong

52、xu Zhang, Jing Wu, Miao Wang, Guocheng Du, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008 (in press). DIO:10.1021/jf8008519 Dongxu Zhang, Miao Wang, Guocheng Du, Qingxin Zhao, Jing Wu, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, 56 (9): 34033408.TAPI: surfactant protein

53、 举 例 5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 50 根 据 该 TGase活 化 模 型 ： 在 发 酵 过 程 的 产 酶 初 期 :*添 加 10 mg/mL的 CTAB， 使 发 酵 过 程 酶 活 提 高 21.8 %；*添 加 1000 U/mL的 胰 蛋 白 酶 ， 使 发 酵 过 程 酶 活 提 高 31.2 %。举 例 5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 51 Tr

54、ansglutaminase Fermentation G lucose G 6P F6P G A P G 3P P E P P yr O A A R 5P H is S er C ys Trp P he Tyr A la Val L eu A sp G ly Lys T hr M et A sn Ile A cC oA C it A K G G lu P ro A rg G ln A m ino acids for other proteins A m ino acids for T G ase H is C ys S er G ly Trp P he Tyr A la Val L eu A

55、 sp A sn M et T hr Lys Ile G ln A rg P ro G lu Determine of culture medium by Analysis of amino acid metabolism using mass balances Amino acid metabolic anylysis of Streptomyces Mobaraense Guoliang Yan, Guocheng Du, Yin Li, Jian Chen, Jianjing Zhong. Process Biochemistry. 2005, 40:963-968. M. Y. Zhe

56、ng, Guocheng Du, J. Chen. Enzyme and Microbial Technology， 2002， 31(4):477-481 . Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation. DO1 DO2 DO2DO1pH1 pH2 举 例 5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 52 举 例 6： 益 生 菌 干 预 食 品 中 生 物 毒 素 的 机 理 与 过 程 控

57、 制某 些 益 生 菌 可 以 吸 附 毒 素 ， 形 成 菌 体 -毒 素 复 合 体 ， 当 微 生 物 形 成复 合 体 后 ， 较 易 与 毒 素 一 起 排 出 体 外 ， 减 少 毒 素 在 肠 道 的 吸 收 ， 从 而 降 低 毒 素 的 危 害 。 食 品 污 染有 微 囊 藻毒 素 (MC) 具 有 强 烈 的肝 毒 性 和 肿瘤 促 进 作 用 菌 体 毒 素复 合 体 排 出生 物 毒 素 广 泛 存 在 于 污 染 的 主 产 粮 食 作 物 、 动 植 物 性 食 品 和 生 活饮 用 水 中 。 研 究 背 景 53 吸 附 动 力 学 模 型 细 胞 结 构 吸

58、 附 结 合 位 点益 生 菌 对 生 物 毒 素 的 吸 附 过 程 模 型 解 析 及 作 用 机 制 评 价代 谢 指 纹 代 谢 网 络 2D电 泳 生 物 芯 片益 生 菌 干 预 生 物 毒 素 的 代 谢 过 程 解 析 及 调 控 TIM 绩 效 评 价 动 物 实 验 高 危 人 群 实 验益 生 菌 干 预 生 物 毒 素 的 绩 效 关 系 评 价 益 生 菌 的 表 面 分 子 结 构 及 其 毒 素 吸 附 与 转 化 功 能 分 子 改 造表 面 分 子 毒 素 吸 附 作 用 解 析 毒 素 转 化 代 谢 解 析 表 面 修 饰 及 分 子 改 造举 例 6：

59、益生 菌 干 预 食品 中 生 物 毒素 的 机 理 与过 程 控 制研 究 方 法 54总 体 目 标 ： 系 统 控 制 与 优 化 发 酵酶 转 化 分离提取一 级 加 工 主 产 物副 产 物. 分离浓缩 发 酵酶 转 化 分离提取 产 物 1产 物 2.二 级 加 工有 机 废 物 (废 水 )厌 氧 酸 化 好 氧 发 酵产 物 1 产 物 2三 级 加 工原料 两 级 发 酵 资 源 化 过 程 技 术 举 例 7： 多 级 生 物 转 化 实 现 多 产 品 联 产 55HO OHOH Cl ClOH OCH CH2H2CClHO OHOHO OHO HO HOH OHO OH

60、OH O HO OHO OHO OHOH OO HO OHO OOHO OHO OHO OHPPT OHOH OO OHOH2C HO OR1OHR2O OR1OH mono-, di- and tri-tert-butyl ethers as oxygenate fuels HO O OHOH nPolyglycerolsMonoglycerideDiacylglycerol Glycerol carbonate1, 2-Propanediol1, 3-Propanediol Glycerol Acrolein Acrylic acidDichloropropanol Eichlorohyd

61、rinHydroxypyruvic acid Oxaic acidTartronic acid Mesoxalic acidGlyceraldehydeGlyceric acidDihydroxyacetone Oxidation Dehydration OxidationChloridationEtherificationEtherificationEsterificationEsterificationReductionReductionOxidation 甘 油二 羟 基 丙 酮1,3-丙 二 醇 1,3-丙 二 醇二 羟 基 丙 酮副 产 物 ：甘 油 分 离 浓 缩 二 级 生物 转

62、 化主 产 物 ：生 物 柴 油 。 。 。多 产 物 联 产一 级 生物 转 化举 例 6： 多 级 生 物 转 化 实 现 多 产 品 联 产 56初 始 微 生 物 群 落 富 集有 机 成 分 的 合 理 组 合生 态 因 子 的 调 控种 群 或 群 落 选 择 性 抑制 剂适 宜 的 预 处 理 技 术有 机 废 物 利 用 有 机 酸 菌 种 构 建代 谢 途 径 分 析发 酵 过 程 优 化环 境 条 件 控 制纯 培 养 发 酵 技 术混 合 培 养 发 酵 技 术 厌 氧 酸 化 好 氧 发 酵 生 化 产 品举 例 6： 多 级 生 物 转 化 实 现 多 产 品 联 产 57