抗菌肽与革兰氏阳性菌的互作及其机制

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1、抗菌肽与革兰氏阳性菌的互作及其机制魏媛;龚国利【摘要】Antimicrobial peptides ( AMP) have been used as a new type of antibacterial agent because of their stable physical and chemical properties, wide antibacterial spectrum, high-temperature resistance. Besides, possibilities of resistance that bacteria might develop toward AMP

2、 are much lower than other antibiotics. These characteristics make AMP become the ideal substitute for antibiotics, and thus make AMP having a broad appli-cation prospect. However, with the in-depth study of AMP, we found that some microbes can still produce re-sistance to AMP. At present, there is

3、no in-depth study on the mechanism of gram-positive spores s resistance toward AMP. In addition, little is known about the antibacterial mechanism of AMP to gram-positive bacteria. This review summarized researches on the target of AMP, its antibacterial mechanism against gram-positive and the antib

4、iotic resistance of gram-positive strains.% 抗菌 肽(AMP )因其具有理化性质稳定、抗菌谱广、耐高温以及不易使靶菌株产生耐药性 等特点,作为一种新型的抗菌剂被提出,有望成为饲料抗生素的理想替代品,具有广阔 的应用前景但是随着对AMP的深入研究，发现部分细菌能对AMP产生耐药性目 前，还没有对AMP对革兰氏阳性(G+)菌芽抱的抗性机制进行深入的研究.AMP对 G+菌的抑菌机制还知之甚少在本文中,我们对AMP对G+菌的作用靶点、抑菌机 制以及G+菌对AMP产生的耐药性等方面进行了综述.期刊名称】 动物营养学报年(卷),期】2017(029)008【总页

5、数】7页(P2636-2642) 【关键词】 抗菌肽;革兰氏阳性菌;枯草芽孢杆菌;金黄色葡萄球菌;抑菌机制;耐药性 机制【作 者】 魏媛;龚国利【作者单位】 陕西科技大学食品与生物工程学院,西安 710021;陕西科技大学食品 与生物工程学院,西安 710021;西安市微生物药物工程实验室,西安 710021【正文语种】 中 文【中图分类】 S811.3 目前，大多数抗生素是20世纪4060年代之间发现的1。近些年来，抗生素滥 用现象日益严重，越来越多的细菌发展成对传统抗生素耐药性菌株。抗菌肽(AMP) 是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽类物质，是机体先天性免疫的重要 组成部分2。AM

6、P因其稳定的理化性质、广谱的抗菌性以及对靶菌株不易产生耐 药性等特点，且具有与抗生素不同的靶点和作用机制，对抗生素耐药菌也有很好的 抑菌效果，有望成为抗生素的理想替代品，受到了广泛的关注。AMP按其结构可 分为a-螺旋、折叠、环链状和伸展性结构等3。尽管AMP在序列和结构上表 现出多样性，但是它们有共同的特性：阳离子性、疏水性以及两亲性4。当AMP 与靶微生物脂质膜表面相互接触时，可以造成膜损伤；也可以不引起膜损伤穿过靶 膜进入到细菌细胞内部发挥作用，例如，AMP可以进入细胞内部影响DNA、RNA或蛋白质的生物合成5-6。许多研究者利用脂质体为模型模拟细菌细胞膜，以确定AMP的作用机制。但人工

7、 脂质膜与细菌细胞膜在组成以及结构上都存在差异，且细胞生长的环境条件和试验 条件也不相同，所以这些模型并不能完全解释AMP与细菌细胞膜的相互作用模式 以及细菌对AMP产生的抗性的原因。随着对AMP研究的深入，发现越来越多的 细菌能对AMP产生抗药性。本文以枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)为革兰氏阳性 (G+)菌的模式生物，以由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和其抱子形成 的艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile )为病原菌，对AMP对G+菌的作用靶 点和抗性机制以及G+菌对AMP产生的抗药性进行阐述。1.1 AMP与G+菌细胞

8、壁的相互作用G+菌的细胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸组成。枯草芽抱杆菌的细胞壁结构是动态的， 在细胞膜细胞生长和分裂过程中不断进行合成和水解7。由于细胞壁中阴离子基 团(肽聚糖中的羧基和磷壁酸的羧基和磷酸基团)的存在，枯草芽抱杆菌细胞表面呈 阴离子性，因此阳离子型AMP首先与细菌通过静电引力相互作用。磷壁酸及其衍 生物在与阳离子AMP作用时起着重要的作用。例如，金黄色葡萄球菌中介导磷壁 酸D-丙氨酸酯添加的dlt操纵子的缺失导致AMP对细菌的抵抗效力降低8。1.1.1 AMP抑制G+菌细胞壁的合成AMP可以与细胞壁合成前体分子脂质口结合，从而使细胞壁的生物合成受到抑制。 细胞壁的生物合成过程如下：首

9、先在细胞质中通过一系列的反应形成尿苷二磷酸- N-乙酰胞壁酸五肽(UDP-MurNAc-pentapeptide);然后对 UDP-MurNAc- pentapeptide进行进一步的固定与跨膜的C552P结合形成脂质I,再与尿苷二 磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc )结合形成脂质口，之后脂质口被转运至细 胞膜外;最后在膜周质空间中完成肽聚糖的组装形成细胞壁9。G+菌中肽间桥形成后，脂质口被转运到膜的外侧，并纳入肽聚糖链。乳酸链球菌 素、菌丝霉素可以与脂质口结合，从而防止其并入肽聚糖链9。不同的是，菌丝 霉素并未造成膜损伤和膜电位改变，而乳酸链球菌素疏水部分插入双层界面会引起 脂

10、质口的离域9-10。人类P-防御素3(hBD3)能干扰细胞壁的生物合成而不造成 膜损伤，通过诱导细胞壁的病变引起充满细胞质的突起的形成，抑制蛋白质参与脂 质口的形成，并抑制其与脂质口通过静电相互作用的相互结合，使UDP- MurNAc-pentapeptide在细胞质中积累11。人类a-防御素1(HNP1)也可以与 脂质口结合从而抑制细胞壁生物合成12。1.1.2 AMP破坏G+菌的细胞壁AMP 也可以通过触发细菌自溶而间接作用于细胞壁，这个过程中细胞释放自溶素， 切割肽聚糖，从而破坏细胞。脂磷壁酸(LTA )位于隔膜，能调节自溶酶并能在AMP作用时释放自溶酶3。硫醚抗生素、多肽抗原(Pep5

11、)、乳酸链球菌素和旧世 界猴白细胞的AMP0-防御素能造成菌体自溶3。总之，AMP能够抑制细菌生长 并杀死细菌，但首先必须穿过细胞壁才能发挥作用。1.2 AMP与G+菌细胞膜的相互作用细胞膜是AMP的主要靶点。目前提出了多种AMP与膜的作用模型。例如，筒板 模型：肽积聚在膜的表面上，当达到一个阈值后，肽插入到膜中 4；环形孔模型： 肽和脂排孔形成无序的环形孔模型；此外还有地毯模型、去垢剂模型等。然而，这 些模型基础上的脂质囊泡的研究，并不能完全解释 AMP 与细菌膜之间的相互作用。AMP 与细胞膜相互作用引起膜损伤从而形成跨膜电位并造成重要分子的损失 13。 膜损伤扰乱细胞的稳态，导致细胞萎缩

12、或体积增加14。由于膜损伤导致细胞孔隙 或通道中荧光染料(如碘化丙啶)的形成，所以透射电镜下可以观察到起泡现象(当 细胞骨架脱离细胞膜造成膜膨胀形成膜突起)和异常隔膜的形成。绵羊骨髓抗菌肽 (SMAP-29)作用于金黄色葡萄球菌时，起泡现象频繁发生在细胞分裂期。但是， 上述研究只能说明肽能引起膜损伤而不能证明膜是AMP初始且唯一靶点，也不能 说明肽是否穿过膜进入细胞质及其是否影响细菌其他的生理功能，如DNA和 RNA的合成。AMP LL-37对枯草芽抱杆菌单细胞膜活性的影响的研究结果表明，低浓度的肽能 与膜相互作用引起的膜损伤是可修复；高浓度的肽，当超过阈值后将导致严重的不 可逆的膜损伤，导致

13、细胞萎缩或异常的隔膜形成15。因此，可以通过致死到亚致 死的浓度范围来确定肽的作用模式。在上述研究中，用显微镜观察若丹明染料标记 的LL-37(Rh-LL-37)对枯草芽抱杆的作用模式。Rh-LL-37作用于靶细胞可分为3 个阶段。第1阶段，Rh-LL-37与外膜、脂多糖和O-抗原层快速结合。外膜表面 肽浓度超过外膜结合肽的阈值后肽能够穿过外膜，而不造成严重的局部膜损伤。一 旦Rh-LL-37进入胞质，大肠杆菌立即停止生长，这被称为第2个阶段。Rh-LL- 37进入隔膜的周质，与固定的肽聚糖结合后穿过细胞质膜。第3阶段是细胞质膜 的通透性增加的过程，这个过程在细胞间隔发生。Rh-LL-37、天

14、蚕素A易与间隔细胞结合，此外，天蚕素A更易作用于新极点16。 隔膜、新极点以及新形成的细胞中富含阴离子磷脂(如双磷脂酰甘油)17。这种隔 膜中富含双磷脂酰甘油的区域使DNA复制机制得到补充，是细胞分裂蛋白质的关 键18。因此，肽与双磷脂酰甘油的结合可以引起蛋白质局部解离，严重影响细胞 稳态。通过荧光显微镜观察AMP的作用方式，结果表明达托霉素的亚致死浓度能引起枯 草芽抱杆菌膜结构弯曲19。细胞分裂蛋白DivIVA能识别负膜曲率，并与这些膜 结合，引起细胞壁的变形及间隔的形成，造成其结构稳定性降低，导致膜被挤出形 成泡，最终可能导致细胞膜和细胞壁的破裂19。除此之外，还可能造成膜结定位 蛋白的离

15、域从而影响细胞的正常功能19。膜结合蛋白的离域是改变膜电位的结果 MP196能引起的膜结合蛋白的离域，如：乙酰葡萄糖胺移位酶(MurG)参与脂质口 的生物合成20。MP196与膜的相互作用并未造成膜损伤或离子的损失，通过从 细胞膜分离细胞色素C作用于呼吸链，使呼吸链活性降低，从而造成ATP及大分 子的生物合成减少20。因此，膜结合蛋白在AMP的抗菌模式中起着重要作用。1.3 AMP与胞内靶点的相互作用AMP可以破坏细胞膜也可以不引起膜损伤穿透质膜后在胞内累积，与细胞内富集 的阴离子分子(DNA、RNA或蛋白质)结合，从而影响细胞的正常功能。例如，凝 血酶诱导的来自兔子血小板杀菌蛋白(tPMPs

16、)，使膜通透性减小，抑制DNA和 RNA合成，从而间接的抑制蛋白质合成。AMP可以使膜通透性降低，通过与 DNA双链结合，阻止它解链，抑制DNA复制和翻译21。合成肽SP1-1在天然 a-螺旋型AMP的基础上，能够穿过金黄色葡萄球菌细胞膜进入到细胞质与反6 因子丝氨酸蛋白激酶相互作用22。1.4 AMP对G+菌抱子活性的影响AMP对抱子有抗菌性，但只作用于萌发后的抱子，即当皮层已经退化，2,6-二羧 酸吡啶(DPA)被释放，抱子核心与水结合。皮层的退化是由于抱子核的再水化，代 谢活性降低使其丧失抵抗外界环境保护抱子的能力23。抱子一旦失去DPA就会 变得非常不稳定而失去抗性。目前为止，只对由枯

17、草芽抱杆菌产生的枯草菌素和乳酸乳球菌产生的乳酸链球菌素 进行了抱子活性研究。乳酸链球菌素和枯草菌素只作用于萌发后抱子内膜，内层膜 的破坏能防止代谢反应的发生和芽抱外被的脱落，从而防止副产物的产生24。抱 子对外界环境非常敏感，一旦外界存在适宜萌发的环境，抱子便开始萌发。由于 AMP的存在，萌发受体被激活，DPA被释放，抱子核心水含量升高，抱子失去其 休眠特性并失去抗性。研究表明，乳酸链球菌素对炭疽杆菌的芽抱生长的抑制依赖 于脂质口与营养细胞的结合24。随着对AMP的深入研究发现少数细菌对AMP产生耐药性现象，但G+菌对AMP 产生抗性比较罕见，这里我们用非敏感G+菌为例解释他们对AMP产生的抗

18、性。G+菌对AMP的抗性主要通过表型的改变，包括细胞壁的增厚、膜流动性的改变、 磷脂成分的改变、表面净电荷的改变、蛋白酶的释放以及将肽和氨基酸降解到环境 中降低低渗透压的压力等。2.1 增厚细胞壁-些G+菌通过增厚细胞壁来降低AMP的抗菌活性。AMP作用于金黄色葡萄球 菌、粪肠球菌会使其细胞壁增厚25-26。增厚的细胞壁外肽聚糖层结构的交联性 降低，起着阻止AMP通过膜的分子筛的作用27。金黄色葡萄球菌细胞壁类肽聚 糖层非酰胺化胞壁肽的成分增加使AMP与细胞壁的亲和力增加，从而降低AMP 的抗菌活性27。非敏感的金黄色葡萄球菌中细胞壁的增厚并非-直存在，也可能 只是暂时的。例如：万古霉素可以引

19、起金黄色葡萄球菌细胞壁的增厚，但当从培养 基中除去万古霉素时，细胞壁的厚度降低，在培养基中重新加入万古霉素时细胞壁 重新变厚28。2.2 改变膜流动性G+菌也能通过改变膜流动性对AMP做出抗性29。达托霉素作用于金黄色葡萄 球菌时，细胞膜中类胡萝卜素含量降低从而使膜的流动性降低30。达托霉素作用 于屎肠球菌时，细胞膜中不饱和脂肪酸(如环丙烷脂肪酸)增加从而使膜的流动性降 低29。2.3 改变表面净电荷一些G+菌可以通过磷壁酸的D-丙氨酰化改变其表面净电荷，如：格氏链球菌、 艰难梭状芽抱杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽抱杆菌等31-32。磷壁酸的D-丙氨 酰化可以降低由 dlt 操纵子调控的阴离子电

20、荷。有报道表明，在艰难梭状芽孢杆菌、 肺炎链球菌和蜡样芽胞杆菌中 dlt 操纵子缺失会引起阳离子 AMP 敏感性增加32。 膜的磷脂组合物改变也可以引起膜表面的净电荷的改变。达托霉素作用于屎肠球菌 时，赖氨酰基、丙氨酰基和含有磷脂的精氨酰基增加，磷脂酰甘油(PG)浓度减少， 导致细胞膜表面电荷降低29。细菌素Mundticin KS作用于屎肠球菌和达托霉素 作用于金黄色葡萄球菌时获得类似的结果33。删除参与膜组件的多种基因也可改 变枯草芽孢杆菌的细胞膜成分。研究表明，缺失 MprF 的突变体比野生型对乳酸 链球菌素更敏感，缺失 UgtP 的突变体对细菌素 Sublancin 敏感。敲除 Mpr

21、F 可 阻止lysyl-PG和PG的合成，使膜上双磷脂酰甘油(CL)和PG浓度增加。除了降低 膜的净负电荷，氨酰化磷脂酰甘油(如lysyl-PG)还可增强细胞膜的稳定性34。UgtP 参与糖脂合成，糖脂是 LTA 的前体，缺失 UgtP 的突变体导致枯草菌素的敏 感性增加。金黄色葡萄球菌的缺失突变体菌株对防御素和 protegrin-1 敏感。只有 MprF 操 纵子局部点突变引起具有增益表型的金黄色葡萄球菌菌株中 lysyl-PG 合成增加25。具有 MprF 增益功能表型的金黄色葡萄球菌对三羟甲基丙烷邻苯二甲酸单酯 (tMPPs)和HNP1的敏感性降低26。MprF存在于各种细菌基因组中，

22、表型改变 是金黄色葡萄球菌抵抗 AMP 的一个总体战略35。然而，通过减少细菌膜净负电 荷产生对AMP的抗性是受限的。通过增加AMP的浓度，AMP敏感性降低的细 菌仍然可以被杀死。2.4 蛋白酶介导-些G+菌可以释放能直接降解AMP的蛋白酶。例如，绿脓假单胞菌、粪肠球菌、 奇异变形杆菌、酿脓链球菌等可以产生能裂解 AMP 的蛋白酶。金黄色葡萄球菌可 以产生能降解LL-37并使其失去活性的溶金菌素(aureolysin)，还可以产生能与 a-防御素高度亲和的葡激酶，发挥对防御素抗性作用。铜绿假单胞菌、粪肠球菌、 和化脓性链球菌产生能与a-防御素结合的硫酸皮肤素，使防御素失去活性。化脓 性链球菌还

23、可产生半胱氨酸蛋白酶SpeB，可以与细胞膜表面结合并降解与细胞膜 相互作用的 LL-37。2.5 枯草芽孢杆菌细胞膜对 AMP 的抗药性枯草芽孢杆菌通过表型改变产生对 AMP 的抗性主要是由信号转导调控系统调控， 可以诱导细胞修复损伤并在胞外被膜改变和反应异常时保护细胞36。枯草芽孢杆 菌应激反应由外周作用(ECF)。-因子和双组分系统(TCS)调控36-37。这2个都是 信号系统，包括膜传感器激酶和反应调节器36。调节器在不引起细胞壁应力的条 件下保持不活动状态，但一旦检测到壁应力，调节器被激活并诱导靶基因的表达。在LL-37亚致死浓度作用下，枯草芽抱杆菌激活由ECF 6因子调节控制的Sig

24、M 和SigW38。SigM由细胞壁抗生素、酸性pH、热、乙醇、超氧化物歧化酶和细 胞壁应力等激活，参与激活多种基因、细胞壁的生物合成、细胞分裂、细胞形成、 DNA损伤反应和脱毒酶等39-40。SigW也是由细胞壁活性抗生素(如万古霉素、 protegrin-1)或碱性冲击诱导。SigW调控细胞膜脂肪酸成分，从而改变膜的流动 性37。Protegrin-1激活枯草芽抱杆菌的SigM和SigX因子38。SigX参与调 节膜整体净电荷，调控dlt ABCDE和pssA-ybfM-psd40。dlt操纵子控制LTA 和PssA/PSD的D-丙氨酰化，促进磷脂酰乙醇胺(PE)的合成。除了激活ECF 6

25、因 子，双组分系统也被激活。LL-37激活YxdJK TCS和LiaRS(YvqCE)TCS双组分系 统38。枯草芽抱杆菌双组分系统的激活与肽有关。例如：protegrin-1能激活 LiaRS(YvqCE)TCS 而不激活 YxdJK TCS 系统38。在细胞壁的抗生素反应系统中， LiaRC TCS和ECF 6因子保护细胞膜的完整并防止其破坏36。枯草芽抱杆菌有3种TCS/ABC转运模式：BceRS-BceAB、YxdJK-yxdLM和 YvcPQ-yvcRS系统。参与BceRS-BceAB系统的ABC转运蛋白从细胞膜去除杆菌 肽，研究表明去除的杆菌肽由磷脂双分子层直接转运到细胞外环境中4

26、1。 BceRS-BceAB系统由细胞壁合成抑制肽(如菌丝霉素、mersacidin和ctagardine 等)诱导42。YxdJK-yxdLM系统由LL-37激活38。当脂质口与硫醚抗生素(如 乳酸链球菌素、gallidermin)结合时YvcPQ-yvcRS系统被激活42。与细胞壁合 成和杆菌肽抗性有关的bcrC(ywoA)基因、细胞壁应力引诱的青霉素结合蛋白 (PBPE)以及dltB操纵子都与LL-37抗性有关38。枯草芽抱杆菌可以通过减少细 胞表面的净负电荷维持膜稳态和除去胞表面的AMP对AMP产生抗药性。2.6 金黄色葡萄球菌细胞膜对 AMP 的抗药性为了了解其他G+菌对AMP的反应

27、是否类似于枯草芽抱杆菌，对葡萄球菌属的抗 药性进行研究。类似于枯草芽孢杆菌，阳离子肽激活表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球 菌双组分调控系统（Aps系统）38。Aps系统调节与阳离子AMP（如防御素、LL- 37）抗性的有关基因位点。Aps系统由3个部分组成：ApsS、ApsR和ApsX。Aps 系统通过外输泵调控 dlt、mprF、vraFG 和 ABC 转运蛋白，外输泵对药物的 夕卜排作用是细菌抗药性机制之一43-44。除了将Aps系统作为监管体系，ApsS 细胞外的传感环具有高密度的负电荷结合肽，可直接使 AMP 无活性43。 尽管与抗生素相比，部分微生物可以对 AMP 产生耐药性，但是由于 A

28、MP 具有作 用靶点较多、杀菌较快的作用机制，因此大多数细菌在产生抗药性之前就被 AMP 杀死，仅有一小部分细菌能对 AMP 产生耐药性。但同时为避免细菌对 AMP 产生 广泛的耐药性，必须警惕 AMP 的耐药性菌的出现45。目前，在畜牧业中，为了增强动物抵御疾病的能力，通常会在饲料中添加适量的抗 生素添加剂，但是这些抗生素添加剂容易在动物体内残留，从而间接在人体内残留， 危害人类健康。AMP具有与抗生素饲料添加剂相同的性能且不会造成体内残留， 完全符合畜产品安全生产的需要，极具有作为新一代饲料添加剂的潜质。但真正的 把 AMP 应用于畜牧业仍具有许多挑战，如：天然 AMP 含量低且不宜分离纯

29、化； 与抗生素相比杀伤能力较弱；潜在的毒性、溶血性以及 AMP 的耐药性等问题都不 容忽视。更好地了解各种 AMP 的抑菌机制将为高效抗菌药物的研发提供帮助。一些 AMP 在预临床研究中具有较好的疗效，副作用较低，而且也有一些 AMP 已成功应用到 农业和食品工业中，具有良好的应用前景。 AMP 作为最有潜力的抗生素替代药品， 在医药卫生、畜牧养殖、食品加工以及农业等领域拥有广阔的应用前景。但同时为 避免重蹈抗生素的覆辙，防止细菌对其产生广泛的耐药性，必须警惕 AMP 耐药性菌的出现，对AMP应当采取合理的应用方式。*通信作者:龚国利，教授，硕士生导师，E-mail:150*【相关文献】1 L

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