利用紫外可见吸收光谱对智利生硝样品中的硝酸盐的测量与多元校准解读

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1、利用紫外可见吸收光谱对智利生硝样品中的硝酸盐的测量 与多元校准MANUEL BravoaL*, ALEJANDRO C. Olivier, BEATRIZ Oilcakes分析和环境化学实验室，化学医学研究所，瓦尔帕莱索天主教大学，P.O. 4059, 瓦尔帕莱索，智利SQM工业，阿尼巴尔平托3223，安托法加斯塔，智利 分析化学系，生化和制药学院，罗萨里奥化学研究所及罗萨里奥国立大学 （CONICET）, Suipacha531, Racario（2000）阿根廷。（2008 年 7 月 21 日 -2008 年 11 月 3 日）摘要:运用偏最小二乘法（PLS）的多元校正检测紫外可见光谱数

2、据的方法，已被应 用到对智利生硝样本硝酸盐含量的测定过程中，可检测处的硝酸钠浓度范围在1- 20%之间。采用多元的方法是必要的，因为样本中还包含光谱活跃有效波长区域（近301纳米）硝酸定量的未知干扰。建立一组15个校准样品的多变量模型， 选择使用肯纳德石法，以确定实际硝酸钠样品的硝酸盐含量，以此作为参考标 准。此方法建立的多元模式的数据优势是令人满意的（硝酸钠检测和定量限分别 达到0.04%和0.12%，预测硝酸钠含量的平均误差为0.3%）。然后，将偏最小 二乘法模型应用到一组独立的生硝样本，所得结果与一元紫外光谱法比较，并参 考确定的实际硝酸钠样品含量参考标准，该参考标准使用线性回归与参考浓

3、度 值，连同椭圆联合区域检验回归的斜率和截距的可信度。结果表明，与多变量模 型分析不同，单变量的方法不适合目前研究的样本。所以，本文所提出的分析方 法体现了对大量的生硝样品进行常规分析的可靠而便捷的替代作用。 关键词：硝酸盐的测定，紫外可见分光光度法;多元校正；偏最小二乘法 引言智利北部拥有世界上已知的最大的生硝沉积矿床，并且是世界上已投入商业利用 的天然硝酸盐的唯一来源。生硝是硝酸钠化肥生产所用的原料名称。在生产 过程中，生硝矿通过机械研磨并转移到大桶浸泡，提取出的硝酸盐进一步处理得 到硝酸钠或硝酸钾结晶。因此，运用快速准确的方法估量硝酸盐含量是评估原材 料质量和控制浸出过程的基础。有多种实

4、验方法来评估不同种类样品的氮含量，但凯氏定氮法仍然作为标准的参 考方法。尽管这种方法是非常精准的，但是非常耗时，凯氏定氮法的数据分析需 要规范的制造过程，这在工业应用方面是一个缺陷。目前已经提出了其他更快的 方法，例如，总氮杜马法，或者是将硝酸盐还原成氨，在碱性介质中加入德瓦达 合金（50%铝，45%铜和5%锌）与氨作用，利用标准酸滴定蒸馏德瓦达合金中 的氨测定硝酸盐的德瓦达法。德瓦达法是公认的参考方法，可应用于不同氮基 质，并且比凯氏定氮法需要更少的分析次数。然而，以上提出的这些方法每次使 用时，均需要耗费平均约5分钟的时间，应用在我们的项目里，需要每天为几百 个样品分析是行不通的。在此背景

5、下，生硝提取的紫外分光光度法测定硝酸盐作为一种更快速，更便捷的 替代法出现。硝酸根离子在水中具有两个不同的两个紫外吸收带：在220 nm处 的广泛和较强频带，和在301 nm的较弱频带。然而，在这两个光谱区域还有一 些其他无机阴离子的紫外吸收辐射光谱，因此采用单变量校准法时，检测出的硝 酸盐含量会偏高。吸收光谱数据的多元校正法正在越来越多地应用于分析复杂混合物。几种化学计 量学工具已在光谱数据的文献中有所报道，但最流行的是主成分回归（PCR）, 偏最小二乘回归（PLS）和最近推出的基于净分析信号（NAS ）的概念的混合线 性分析的变异（HLA）。所有这些技术都拥有全光谱信息的优势，他们允许快速

6、 测定往往没有事先分离混合成分，而且校准可以做到忽略所有元件的浓度，除分 析复杂样品中的利益。这使得这些方法在生硝中硝酸盐的测定上特别有吸引力， 其基质成分在分析中将会显示严重重叠的吸收光谱。一些多元的方法，从古典最 小二乘法（CLS）的和偏最小二乘法，已被用来评估污水处理厂的过滤和未过滤 的水样中的硝酸盐浓度，取得了令人满意的结果。在本文中，我们通过测定紫外-可见吸收光谱数据和PLS多元校正报告硝酸钠样 品硝酸盐的测定。后者的方法，预计将提供其他样品组分重叠严重的光谱与样品 中的硝酸盐定量预测模型，对比经典的单因素单一波长的紫外线校准。经过由化学计量学方法精心挑选的样品协助，多元的偏最小二乘

7、的方法被应用到 一套真正的生硝样本，同时预测的硝酸盐含量将与Devarda方法参考比较。应当 注意到，生硝样品分析中，硝酸盐含量在1和20%之间变化。而通常的单变量方 法采用两个独立的校准，一个用于低浓度范围和另一个用于较大的浓度范围，在 这两个相当广泛的浓度范围内，使用单一的校准测量，多元方法提供了良好的预 测结果。此外，每个样品的总分析时间不到1分钟，这表明该方法非常适合在常 规实验室的分析应用。实验 仪器 通过Unicam紫外可见分光光度计型号530 （德尔卡皮奥分析，智利圣地亚 哥），采用1.00厘米石英的单元格，获得紫外可见吸收光谱。对于所有的样品， 每隔1nm记录190到500nm

8、之间光谱数据（每频谱311数据点），以ASCII格 式保存并转移到计算机做后续操作。生硝样品中硝酸盐的测定参考程序改编自AOAC官方方法892.01肥料中对氮的 测定。这些分析通过格哈特蒸馏系统模型Vapodest6 （格哈特，德国）对12个样 品自动分析进行。氮浓度以硝酸钠百分比显示（ NaNO3）。试剂所有的实验都是用分析纯级试剂，购自默克公司S.A.（智利圣地亚哥）。硼酸和 氢氧化钠，均为O.lmol L-1，是为每天硝酸盐定量问题准备的解决方案。单因素紫外检测法单变量方法的标准，是由超纯水溶解硝酸钠。两个独立的校准例行进行，一个硝 酸盐浓度低，另一个硝酸盐浓度高。第一个校准使用三个一式

9、三份标准溶液从 0.20-1.00g L-1 范围内完成，结果如下：斜率=0.0910（8）,截距=-0.0023（5）, R2= 0.9994 （标准偏差为括号中的数字）。第二个校准使用五个一式三份标准溶液从 2.00-10.00g L-1 范围内进行，斜率=0.0845（4）,截距=0.0058（3）, R2=0.9997。偏最小二乘法校正和测试校正集由十五组生硝样本硝酸盐含量在1到20%之间组成（以NaN03表示）， 由Devarda方法作为先前评估。他们选择收集了从2006年9月-2007年2月期间 在智利的阿塔卡马沙漠中的SQM设施中的一套70份生硝样本。接地材料（100 微米），均

10、匀摆放在聚乙烯袋内直到分析使用。样本的选择依据肯纳德石法适用 于紫外光谱在250-350nm有关区域范围内（详细实施细则见下文）。化学计量学 的过程采用标准样品之间的距离作为标准。其余55个样本组成测试集，因此比 校准采用的不同。对于紫外可见光谱的测量，2.00 g的接地生硝样本与色谱纯水 50毫升放置在100 mL锥形瓶中。将泥浆机械动摇五分钟，并用滤纸42重力过滤 器过滤。过滤的解决方案是直接通过如下所述的紫外可见分光光度法分析。理论和软件PLS是一个众所周知的多元校正方法，并且它的详细实施细则是很容易做到的。 该方法涉及两个步骤：1）校准，从一套标准样品中建立光谱和参考组分浓度之 间的关

11、系；2）预测，用校准结果来估计未知样品的主分浓度。在PLS-1版本 中，所有的模型参数将用每个分析物测定一次来优化。在模型训练步骤，用与使 用所谓的“逆”的模式校准数据相关的分解迭代算法校准数据。这里提供了一系列 的载荷（P,大小JxA,其中J是波长的数量，A是潜在的PLS的变量数），重 量负荷（W,大小JxA）回归系数被应用到一个新的样本（v,大小Ax1）。由 于未知样品的频谱xu （大小Jx1），后者预计将提供测试样品分数tu的载荷和重 量负荷的空间：tu=（PTW）-1PTxu（1）样本分数再乘以回归系数用以估计分析物的浓度y：y=vTtu在校准之前，它通常是评估潜在变数的最佳数量，以避

12、免过拟合，运用众所周知 的由Haaland描述的交叉验证方法(见下面)。根据国际化联的建议，对数字的优异度进行了评估。对于一个给定的分析物k的 灵敏度可用下式计算：SEN=l/|b| (3)其中|表示欧几里德范数，bk是PLS-1模型提供的回归系数的载体。选择性表 示由于光谱重叠，总信号的未丢失部分，并可以通过NAS的计算，在多元的情 况下定义：SEL=|未知样品的净分析信号|/|未知样品的总信号| (4)其中静分析信号通过正交于除了利益分析之外涵盖所有其它成分的空间的未知样 本的频谱来计算。最后，检测限(LOD)和定量(LOC)被评估为：LOD=3.3sO (5) LOC=10sO (6)

13、其中s0是低浓度或接近零的浓度下样品分析物的标准错误，并且有： sO=hsc2+h(s1/SEN)2+(s1/SEN)21/2 (7)其中h是样本充分利用，将未知样品相对于校准空间的一个参数,sc是校准浓度的 标准误差,s1是仪器的噪音电平,SEN是仪器的灵敏度。PLS-1算法被应用于使用MVC1工具箱的MATLAB25编写，因为这些例程允许 我们基于NAS理论去评价优异的数字。应当注意到，紫外可见光谱测定在一个相当广泛的光谱范围内，可以在见图1中 的a,在非常高和非常低的吸光度区域都是显而易见的。据了解，多变量模型可 能会受益于适当波长的选择，从而避开了噪音或高吸收的地区，以及严重重叠的 光

14、谱区。虽然在250至350 nm之间可以直观地确定一个有用的光谱区域，通过 MVC1提供的工具实现微调是可能的。在此工具箱实现一个移动的窗口战略，允 许我们通过一个给定的波长和光谱窗口，在一组光谱区域定义，执行留一逼近交 叉验证策略。进行一个对于最佳的交叉验证方差的全面查询，作为第一波长和视 窗宽度的函数。这使得对于一个合适的工作区域位置的校准结果是最优的。 MVC1工具箱在网上是免费提供的。使用内部嵌套了 MATLAB套路的肯纳德石算法。结果与讨论光谱硝酸根离子在水中呈现两个紫外吸收带：在220nm处广泛且非常强烈的吸收带和 在301nm处强度较弱的吸收带。图1a显示确定了硝酸盐信号的整套7

15、0份生硝样 本的光谱。从这个图的检测和放大窗口(图1b，250至350 nm之间)，可以很 明显看到，一些样品中存在一个强烈的波段重叠，归因于硝酸根离子和至少一个 最大吸收波长为294纳米附近的光谱干扰。根据我们对样品的了解，这个光谱干 扰对应显示含有硫或者碘的杂质。这些紫外吸收光谱（250-350 nm区域）的主成 分分析（PCA），解释了在这组样品中两个组件约94%的光谱变异。在图2a和 2b中分别提出了相应的PCA负荷和分数。可以看出，由图2b显示大部分样本沿 虚线分布在痕迹记录图中。对于这些特殊的样品，光谱干扰是最小的，单变量紫 外分光光度法提供硝酸盐含量，可与参考Devarda方法获

16、得的含量相媲美。20025Q300350400450500波长,血图1：紫外可见光谱校准样品在下列范围内设置的记录：（a）从190至500nm的 全光谱区（b）从250到350纳米的限制区域。然而，显示在这一区域外的某一组样品，其中一些从第一份电脑数据中呈现显著 的贡献。另一方面，首次装载PC值显示在294nm最多（图2b），对应波长的光 谱干扰如上所述。对于这些样本，单变量法获得的硝酸盐含量显著高于参考方 法。图2：（a）图表示前两个录入波长对比（实线，首次录入;虚线，第二次录 入），显示于波长为294nm处，（b）图表示第二次痕迹相比于第一次痕迹，由 250至350nm范围内一整套光谱的主

17、成分分析获得。图（b）中虚线表示样本中 具有低干扰物影响的地区。PLS分析样本的选取当样品中含有其他的紫外线响应组分时，需要运用多变量模型预测分析物的浓 度，试样中可以发现的变异的所有可能来源，在校准设置中必须纳入。因此需要 一个在校准空间或多或少均匀分布的选择样品的程序。在只有真正的样品可用的 情况下，目前讨论的分析问题实验设计是不可能的。当许多样品和其相应的光谱 可用时，可以建立有代表性的集合覆盖校准信号空间。几种方法可用于选择有代 表性的校准样品。最简单的方法是随机选择，但由于将丢失一些变异的来源，因 此它的可能性是开放的。肯纳德和斯通提出了一个循序的方法均匀覆盖试验区。 该程序包括下一

18、个样品被列入校准的选择方法，最先选择的那个将会是最原始的 数据。距离通常是在信号空间的欧几里德距离。作为起始点，可以选择任何两个 彼此相距最远的对象或者最接近平均值的一组（我们采用第一种方法）。然后将 每个剩余的样品按这个距离与每个已经选择和确定是最小的样品测量比较。从后 者中选中距离最大的一个添加到集合。先后应用上述计划填满校准空间。肯纳德 和斯通称他们的程序为均匀的映射算法。样本从所提供的70份生硝标本中按如下过程选择出：对于一份给定数量的校准 样品，在250-350nm有关区域内建立偏最小二乘法模型，并对其余样品进行预 测。根均方误差（RMSE）用于计算校准样品的数值增量。图3显示了 R

19、MSE误 差如何随着由肯纳德斯通法选定的样本数变化而变化。可以看出，15个样本对其 余55个样本提供了相当不错的预测结果。此外，经证实约一半有光谱干扰的样 品被列入校正集，其余的留在测试集做预测。5 1均方根误差硝酸钠0.2W 15202530校准样品的数量图3：根均方误差作为样本数的函数测试集，运用肯纳德斯通算法的偏最小二乘 法选择。单因素紫外分析在干扰存在的情况下很难去关联硝酸盐浓度在单一波长下的吸光度值（即在 301nm处），因为这些复杂的样品将得检测出偏高的硝酸盐浓度值。为求与如下 所述的多元方法比较，55个测试样本集进行单因素的紫外线法分析，结果与那些 提供的Devarda方法比较。

20、图4a显示了在测试样品中的预测与参考硝酸盐含量的 比较，异常值清晰直观的检测并标出，相应的样品含有上述讨论的干扰。JIII51015Devarda / % NaNO3图4预测与参考硝酸盐浓度样品的测试集图，由如下方法获得：（a）单因素紫 外线法，（b ）偏最小二乘多元法。当浓度范围较宽时，有一个便捷的方式去比较两种不同的方法做出的预测，就是 对值应用线性回归分析的方法，该线性回归方法是根据参考方法提供的测试而发 现的。对于所获得的结果的统计研究的建议测试就是所谓的椭圆置信区间（EJCR）的回归直线的斜率和截距。如果椭圆包括理论上的预期值（1,0），这 表明建议的方法在精度上符合要求。在301n

21、m处的单因素紫外检测法相比于参考 Devarda方法具体的结果是：斜率=11，截距=18。这清楚地表明，因为在定义 的斜率和截距较大的不确定性，单变量的方法不适合分析目前的问题。在这些条 件下，EJCR是不恰当的。偏最小二乘法的结果为了建立一个多元硝酸盐定量校正模型，使用校准样品的完整光谱信息记录，首 先执行偏最小二乘再加上留一出交叉验证，以估计潜在变数的最佳数量。这是通 过计算比率 F（A） = PRESS（A 1的概率低于75%。对于完 整的光谱数据（190-500n m），在上述标准的基础上估计出了五大因素。进行偏最小二乘校准和预测之前,记录校准样品的紫外-可见吸收光谱的光谱区域 仅限于

22、上述移动窗口的战略建议。10nm最低频谱窗口和5个最大因素被应用于 进行对最佳校准条件的搜索。结果表明，硝酸盐分析合适的工作区域是从251到 310纳米（见图5）,该区域交叉验证的结果得出需要3个偏最小二乘因素的结 论（见表1）。鉴于已知的硝酸根离子的光谱特性（图1）,表明选定的光谱区 域是合理的，并且与一套完整的样品的主成分分析相近（见上文）。同样，组件 件数量的减少（从五个到三个）源自于受限制区域的选择，该区域内有贡献的组 件数目比那些在全谱宽区域的回应要少。图5：最佳的校准光谱范围内的偏最小二乘的全面搜索结果：（a）作为第一波长 的函数和窗口宽度，在每个检测的光谱窗口内最佳PRESS值的

23、三维图，（b）相 应的等高线图。最佳的结果显示在图（b）中。在上面讨论的光谱区域使用三个潜变量，校准偏最小二乘并应用于一套测试样 品。预测浓度与参考方法获得的值相比，显示在图4b中。评估该方法的预测能 力，根均方误差（RMSE）和预测相对误差（REP%），分别估算得0.35%和 3.7%NaNO3, R2值接近1 （表1）。这提供了合理的偏最小二乘预测的统计指 标。应当注意到，表1中引用的均方根误差进行的Devarda方法的不确定性，这 种不确定性传递到偏最小二乘法的预测值。由于参考技术显示了约0.2%NaNO3 的平均误差（表示绝对硝酸盐含量），偏最小二乘均方根误差值可以纠正为： RMSEP

24、LS,corrected=RMSEPLS2RMSEDevarda21/2 （8）方程（8）提供了一个对0.3%NaNO3偏最小二乘法校正的平均误差，可与参考方 法相媲美。进一步深入了解偏最小二乘法与参考Devarda方法的区别，通过线性回归预测获 得的硝酸盐含量与参考方法确定的含量比较。线性拟合量：斜率=1.020.05，截 距=0.090.4。不仅是单个的置信区域包含理想值（分别为1和0）,椭圆的置 信区间也包括了理论上的预期值（1,0），这表明所提出的方法在精度上可与 Devarda方法相媲美（图6）。表1：偏最小二乘法交叉验证和预测结果取得的优异的数据。因素交叉验证法江PRESS偏瑕小一

25、一乘沌FP142J.741001 80.999020 641 495Q.76003询1.4230.733040 4210.550 61预测b偏聂小二乘法REP%3.7卅0.9856校正RMSE七0 3优异的魏据偏毎小二乘法灵敏度0.077AU(%NaNO分析灵散度76(%NaNO3-选择性0.90检餾限0.04%NaNO定量限0.12%NaNO1a黑体字为最佳值。光谱数据被限制在251-310 nm区域。b RMSE =根均方误差，REP% =预测相对误差（基于硝酸盐浓度的平均校准） c根据的Devarda方法的不确定性纠正（见文）。斜率图6：从偏最小二乘法估计出的椭圆置信区间对应的线性回归分

26、析预测与参考 值。十字标志为理论（1,0）点。最后，对方法的选择很有用的偏最小二乘法的多元数据的优点，在表1中经 MVCI工具箱估计出。可以看出，他们在工作范围内确定硝酸盐中硝酸盐含量是 适用的，因为检测限和定量限远远低于测试研究生硝样本的最低浓度（1.7% NaNO3）。结论一套智利生硝样本的紫外可见光谱的多元校正允许人们开发出一种快速，可靠和 准确的方法在存在干扰的情况下测定硝酸盐的浓度。尽管这种方法相当简单和快 捷，但它得到的结果却可与参考Devarda方法相媲美，因此非常适合对大量的样 品的常规分析。相比之下，单因素的方法已被证明是不合适的，因为在其波谱的 工作波长下有活跃干扰物的存在。鸣谢感谢SMQ提供资金支持，感谢罗萨里奥国立大学A.olivieri, CONICET （国家科 学和技术研究委员会，项目号PIP5303）和ANPCyT （国家科学和技术推广机 构，项目号PICT04-25825）的财政支持。