土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1、 尿素分子的立体结构（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 水 生 耐 热 细 菌 Taq ( Thermus aquaticus )耐 高 温 的 Taq DNA聚 合 酶美 国 微 生 物 学 科 布 鲁 克（ T.Brock)1966年 发 现 耐 热 细 菌 培养基配方三 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 培养基配方二 KH2PO4 3g MgSO47H2O 3g NaNO3 2g 葡萄糖 10.0g 尿素 3.0g 琼脂 15.0g 培

2、养基配方一 KH2PO4 3g Na2HPO4 1.4g NaNO3 2g MgSO47H2O 3g 葡萄糖 10.0g 琼脂 15.0g （ 一 ） 筛 选 菌 株 尿 素 细 菌 的 分 离1.原 理 ： 根 据 某 种 微 生 物 的 特 殊 营 养 要 求 或 其 对 物 理 、 化 学 因 素 （ 营 养 、 温 度 、 pH等 ） 的 抗 性 而 设 计 的 。选 择 培 养 基 ： 在 微 生 物 学 中 ， 将 允 许 特 定 种 类 的 微 生 物 生 长 ， 同 时 抑 制 或 阻 止 其 他 种 类 微 生 物 生 长 的 培 养 基 。 2.功 能 ： 使 混 合 菌

3、群 中 的 目 的 菌 株 变 为 优 势 菌 ， 从 而 提 高 该 菌 的 筛 选 效 果 。3.方 法 ： 利 用 选 择 培 养 基 来 实 现 。 当 样 品 的 稀 释 度 足 够 高 时 ， 培 养 基 表 面 生长 的 一 个 菌 落 ， 来 源 于 样 品 稀 释 液 中 的 一个 活 菌 。 因 此 ， 恰 当 的 稀 释 度 是 成 功 地 统计 菌 落 数 目 的 关 键 。 为 了 保 证 结 果 准 确 ，通 常 将 几 个 稀 释 度下 的 菌 液 都 涂 布 在平 板 上 ， 培 养 后 再选 择 菌 落 数 在30 300的 平 板 进 行计 数 。 同 学

4、平 板 1 平 板 2 平 板 3 平 均 数 评 价甲 230 230乙 21 212 256 163结 论启 示 没 有 设 置 重 复 组 ， 因 此 结 果不 具 说 服 力 。1个 平 板 的 计 数 结 果 与 另 2个相 差 太 远 ， 说 明 在 操 作 过 程中 可 能 出 现 了 错 误 。不 能 简 单 地 将 3个 平 板 的 计 数 值 用 来 求 平 均 值 。在 设 计 实 验 时 ， 一 定 要 涂 布 至 少 3个 平 板 ， 作 为 重 复 组 ， 才 能增 强 实 验 的 说 服 力 与 准 确 性 。 在 分 析 实 验 结 果 时 ， 一 定 要 考

5、虑所 设 置 的 重 复 组 的 结 果 是 否 一 致 ， 结 果 不 一 致 ， 意 味 着 操 作 有 误 ，需 要 重 新 实 验 。 统 计 菌 落 数 目 测 定 微 生 物 数 量 的 方 法 ：1.稀 释 涂 布 平 板 法 （ 活 菌 计 数 法 ） ： 统 计 平 板 上 的 菌 落 数2.显 微 镜 直 接 计 数 ：3.滤 膜 法 ： 是 检 测 水 样 中 大 肠 细 菌 群 的 方 法 。 4.测 定 细 胞 重 量 法 ： 此 法 分 为 湿 重 法 和 干 重 法 5.测 定 细 胞 总 氮 量 或 总 碳 量利 用 血 球 计 数 板 ( 1.想 一 想 ，

6、如 何 从 平 板 上 的 菌 落 数 推 测 出 每 克 样 品 中的 菌 落 数 ？答 ： 统 计 某 一 稀 释 度 下 平 板 上 的 菌 落 数 ， 最 好 能 统 计3个 平 板 ， 计 算 出 平 板 菌 落 数 的 平 均 值 ， 然 后 按 课 本 旁栏 的 公 式 进 行 计 算 。 在 做 本 课 题 的 实 验 时 ， A 同 学 从 对 应 106倍 稀 释 的 培 养 基 中筛 选 出 大 约 150个 菌 落 。 但 是 ， 其 他 同 学 在 同 样 的 稀 释 度 下 只 选择 出 大 约 50个 菌 落 。 其 他 同 学 认 为 A同 学 的 结 果 有

7、问 题 。 他 们 分 析 可 能 是 A同 学 的培 养 基 被 杂 菌 污 染 了 ， 或 者 培 养 基 中 混 入 了 其 他 含 氮 物 质 ， 因 而导 致 不 能 分 解 尿 素 的 细 菌 也 能 在 该 培 养 基 上 生 长 。 但 是 ， A同 学 确 信 自 己 的 实 验 操 作 准 确 无 误 ， 与 其 他 同 学 的结 果 之 所 以 不 相 同 ， 是 因 为 自 己 所 选 用 的 土 壤 样 品 不 同 。 但 是 ，A同 学 在 设 计 实 验 的 时 候 并 没 有 设 置 对 照 ， 因 而 此 时 也 拿 了 不 出令 人 信 服 的 证 据 。

8、你 能 通 过 设 置 对 照 ， 帮 助 A同 学 学 排 除 上 述 两 个 可 能 影 响 实验 结 果 的 因 素 吗 ？ 究 竟 是 哪 个 原 因 ， 可 以 通 过 实 验 来 证 明 。 实 验 方 案 有 两 种 。 是 可 以 由 其 他 同 学 用 与 A同 学 一 样 的 土 样 进 行实 验 ， 如 果 结 果 与 A同 学 一 致 ， 则 证 明 A无 误 ； 如 果 结 果 不 同 ，则 证 明 A同 学 存 在 操 作 失 误 或 培 养 基 的 配 制 有 问 题 。 是 将 A同 学 配 制 的 培 养 基 在 不 加 土 样 的 情 况下 进 行 培 养

9、， 作 为 空 白 对 照 ， 以 证 明 培 养 基 是 否 受 到 污 染 。通 过 这 个 事 例 可 以 看 出 ， 实 验 结 果 要 有 说 服 力 ， 对 照 的 设 置是 必 不 可 少 的 。 从 肥 沃 、 湿 润 的 土 壤 中 取 样 。 先 铲 去 表 层 土 左 右 ，再 取 样 ， 将 样 品 装 入 事 先 准 备 好 的 中 。 微 生 物 的 种 类 土 壤 稀 释 倍 数 目 标分 离 土 壤 中 所 有 细 菌 104、 105、 106 平 板 上 的 菌 落 数 应为 30 300个 ， 便 于准 确 计 数 。分 离 土 壤 中 的 放 线 菌 1

10、03、 104、 105分 离 土 壤 中 的 真 菌 102、 103、 104分 离 土 壤 中 的 尿 素 细 菌 10 4、 105、 106、 107 （ 二 ） 土 壤 稀 释二 、 实 验 设 计 2.为 什 么 分 离 不 同 的 微 生 物 要 采 用 不 同 的 稀 释 度 ？ 测 定 土壤 中 细 菌 的 总 量 和 测 定 土 壤 中 能 分 解 尿 素 的 细 菌 的 数 量 ， 选用 的 稀 释 范 围 相 同 吗 ？答 ： 这 是 因 为 土 壤 中 各 类 微 生 物 的 数 量 （ 单 位 ： 株 /kg） 是不 同 的 ， 例 如 在 干 旱 土 壤 中 的

11、 上 层 样 本 中 ： 好 氧 及 兼 性 厌 氧细 菌 数 约 为 2 185万 ， 放 线 菌 数 约 为 477万 ， 霉 菌 数 约 为 23.1万 。 因 此 ， 为 获 得 不 同 类 型 的 微 生 物 ， 就 需 要 按 不 同 的 稀 释度 进 行 分 离 ， 同 时 还 应 当 有 针 对 性 地 提 供 选 择 培 养 的 条 件 。 101 102 103 104 105 106 10710g土 壤 9ml无 菌 水 9ml 无 菌 水1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml0.1ml10410 4104 105105105 106106106 107107107稀

12、 释 涂 布 平 板 法 组 别 培 养 基 类 型 是 否 涂布 接 种 目 的实 验 组 以 尿 素 为 唯 一 氮 源的 选 择 性 培 养 基 是对 照 组 牛 肉 膏 蛋 白 胨培 养 基 是 分 离 尿 素 细 菌用 以 判 断 选 择 性 培 养基 是 否 具 有 选 择 性对 设 计 实 验 的 训 练 稀 释 倍 数 培 养 基 103 104 105 106选择培养基 平 板 1 242 210 202 102平 板 2 250 240 86 98平 板 3 310 250 198 120平 均 数牛 肉 膏 蛋 白 胨培 养 基 平 板 4（ 对 照 ）培 养 基 的 种

13、 类 情 况162 106 例次 不 同 浓 度 的 平 均 菌 落 数 两 稀 释 度菌 数 之 比 菌 落 总 数个 /g或 个 /ml 报 告 方 式个 /g或 个 /ml101 102 1031 1365 164 20 - 16400 16000或 1.6 1042 2760 296 46 1.6 38000 38000或 3.3 1043 2890 271 60 2.2 27100 27000或 2.7 1044 不 可 计 4650 513 - 513000 510000或 5.1 1055 27 11 5 - 270 270或 2.7 1026 不 可 计 305 12 - 30

14、500 31000或 3.1 104菌 落 计 数 方 法1.首 先 选 取 平 均 菌 落 数 在 30 300之 间 的 平 皿 ， 作 为 菌 落 总 数 测 定 的 范 围 。当 只 有 一 个 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 符 合 此 范 围 时 ， 即 以 该 平 皿 菌 落 数 乘 其 稀释 倍 数 （ 见 表 中 例 ） 。 2.若 有 两 个 稀 释 度 ， 其 平 均 菌 落 数 均 在 30 300个 之 间 ， 则 应 求 出 两 者 菌 落 总 数 之 比 值 来 决 定 。 若 其 比 值 小 于 或 等 于 2应 报 告 其 平 均 数 ， 若 大 于 2则

15、 报 告 其 中 较 小 的 菌 落 数 (见 表 中 例 2及 例 3)。 例 ： 46（ 103） 和 296 （ 102） 均 在 30 300之 间 ，则 ： 46 103 296 102 1.6， 应 取 二 者 的 平 均 值 。46 103 296 1020.1(ml)( ) 2=3.775 105 3. 若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 大 于 300个 ， 则 应 按 稀 释度 最 高 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 报 告 之 (见 表 中 例 4)。4. 若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 少 于 30个 ， 则 应 按

16、稀 释度 最 低 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 报 告 之 (见 表 中 例 5)。5.若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 不 在 30 300个 之 间 ， 其中 一 个 稀 释 度 大 于 300个 ， 而 相 邻 的 另 一 稀 释 度 小 于 30个时 ， 则 以 接 近 30或 300的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 报 告 之(见 表 中 例 6)。 （ 三 ） 微 生 物 的 培 养 与 观 察微 生 物的 种 类 培 养 温 度 培 养 时 间 观 察 时 间细 菌 30 37 1 2d 每 隔 24h统 计 一 次 菌 落数 ，

17、 选 取 菌 落 数 目 稳 定时 的 记 录 作 为 结 果 。 仔 细 观 察 并 记 录 菌 落的 （ 形 状 、 大 小 、 隆 起和 颜 色 等 方 面 ） 特 征 。霉 菌 25 28 3 4d放 线 菌 25 28 5 7d （ 圆 形 ， 假 根 状 ， 不 规 则 状 ）（ 光 滑 ， 皱 缩 ， 颗 粒 状 ， 龟 裂 状 ， 同 心 圆 状 ）（ 扩 展 ， 台 状 ， 凹 面 ， 凸 面 ， 乳 头 状 ）（ 整 齐 ， 波 状 ， 裂 叶 状 ， 锯 齿 状 ）（ 无 光 泽 ， 金 属 光 泽 ， 闪 光 ）（ 油 脂 状 ， 膜 状 ， 粘 脆 ） 1、 取 土

18、用 的 小 铁 铲 的 盛 土 样 的 信 封 在 使 用 前 都 需 要 灭 菌 。2、 应 在 火 焰 旁 称 取 土 壤 。 在 火 焰 附 近 将 称 好 的 土 样 倒 入 锥形 瓶 中 ， 塞 好 棉 塞 。3、 在 稀 释 土 壤 溶 液 的 过 程 中 ， 每 一 步 都 要 在 火 焰 旁 操 作 。注 明 培 养 基 种 类 、 培 养 日 期 、 平 板 培 养 样 品 的 稀 释 度 等 。 1.培 养 物 中 是 否 有 杂 菌 污 染 以 及 选 择 培 养 基 是 否 筛 选 出 菌 落 ：对 照 的 培 养 皿 在 培 养 过 程 中 没 有 菌 落 生 长 ，

19、 说 明 培 养 基 没 有被 杂 菌 污 染 。 牛 肉 膏 培 养 基 的 菌 落 数 目 明 显 大 于 选 择 培 养 基的 数 目 ， 说 明 选 择 培 养 基 已 筛 选 出 一 些 菌 落 。2.样 品 的 稀 释 操 作 是 否 成 功 ：如 果 得 到 了 2个 或 2个 以 上 菌 落 数 目 在 30 300的 平 板 ， 则 说 明稀 释 操 作 比 较 成 功 ， 并 能 够 进 行 菌 落 的 计 数 。3.重 复 组 的 结 果 是 否 一 致 ：如 果 学 生 选 取 的 是 同 一 种 土 样 ， 统 计 的 结 果 应 该 接 近 。 如 果结 果 相 差

20、 太 远 ， 需 要 分 析 产 生 差 异 的 原 因 。 （一）空气中微生物总数的检测（二）水中细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数 土 壤 中 分 解 尿 素 的 细 菌 的 分 离 与 计 数 w 培 养 基 的 配 制 ： 最 好 用 蒸 馏 水w 培 养 基 的 灭 菌 : 可 先 灭 菌 再 倒 平 板w 取 土 样 ： 可 事 先 采 取 措 施 使 土 壤 中 的 尿 素 细 菌 富 集 一 些 。检 测 ： 酚 酞 的 灵 敏 度 不 如 酚 红 ， 因 此 建 议 最 好 使 用 酚 红 ， 否 则 效 果 不 明 显 。 培

21、 养 基 类 型 日 期 平 板 细 菌 数 （ 土 壤 稀 释 度 ）选 择 性 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨培 养 基（ 涂 布 接 种 ） （ 未 涂 布 接 种 ）第 一 天第 二 天 2.反 刍 动 物 ， 如 牛 和 山 羊 ， 具 有 特 殊 的 器 官 瘤 胃 。 在瘤 胃 中 生 活 着 多 种 微 生 物 ， 其 中 许 多 微 生 物 能 以 尿 素 作 唯 一氮 源 。 请 你 设 计 一 个 实 验 ， 从 瘤 胃 中 分 离 出 能 够 分 解 尿 素 的微 生 物 。提 示 ： 反 刍 动 物 的 瘤 胃 中 含 有 大 量 的 微 生 物 ， 其 中 也 包 括分 解 尿 素 的 微 生 物 。 由 于 瘤 胃 中 的 微 生 物 多 为 厌 氧 菌 ， 接 触空 气 后 会 死 亡 ， 因 此 分 离 其 中 能 分 解 尿 素 的 微 生 物 除 了 需 要准 备 选 择 培 养 基 外 ， 还 应 参 照 厌 氧 菌 的 培 养 方 法 进 行 实 验 设计 。