注射用重组人白介素2(i)

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1、注射用重组人白介素-2(I）Zhusheyong Chongzu Ren Baijiesu2 （I）Recombinant Human Interleukin-2 (I） for Injection本品系由高效表达人白细胞介素2 （125Ser）简称人白介素-2(125Ser)基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。2 制造2。1工程菌菌种2.1。1名称及来源重组人白介素-2（125Ser)工程菌株系由带有人白介素-2(125Ser)基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株，

2、其中人白介素-2基因序列中原125位编码半胱氨酸的序列被突变为编码丝氨酸的序列。2。1.2 种子批的建立应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程的规定。2.1.3 菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1 划种LB琼脂平板应呈典型的大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2。1。3。2 染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌.2。1。3.3 对抗生素的抗性应与原始菌种相符。2。1。3.4 电镜检查（工作种子批可免做）应为典型的大肠杆菌形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1。3。5 生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。2。1.3.6 人白介素-2表达量在摇床中培养，

3、应不低于原始菌种的表达量。2.1.3.7 质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1。3。8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做)目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2 原液2.2。1 种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。2。2。2 发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基.2.2。3 种子液接种及发酵培养在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵,应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录 G）。2.2.4 发酵液处理用

4、适宜的方法收集处理菌体。2.2.5 初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化,使其纯度达到规定的要求.2。2.6 高度纯化经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化,使其达到3.1项要求，即为人白介素-2（I）原液。加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜的温度，并规定其有效期.2。2.7原液检定按3.1项进行。2。3 半成品2.3.1 配制与除菌2.3.1。1 稀释液配制按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。2。3。1.2 稀释与除菌将检定合格的含稳定剂的人白介素-2原液用2。3。1.1项稀释液稀释至所需浓度.除菌过滤后即为半成品，于2-8保存。2。3。2 半成品检定按3。2项进行.2

5、。4 成品2。4。1 分批应符合 “生物制品分批规程”规定。2.4。2 分装及冻干应符合 “生物制品分装和冻干规程”规定。2。4。3 规格应为经批准的规格。2.4.4 包装应符合 “生物制品包装规程”规定.3 检定3。1原液检定3.1。1 生物学活性依法测定（附录D）.3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录 B第二法)。3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比,每1mg蛋白质应不低于1。0107IU。3。1。4 纯度3。1.4.1 电泳法依法测定（附录 C）。用非还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15，加样量应不低于10g（考马斯亮蓝R250染色法）或5g（银染法）。经扫描仪

6、扫描，纯度应不低于95.0。3。1.4。2 高效液相色谱法依法测定（ B）。色谱柱以适合分离分子质量为560kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0。1mol/L磷酸盐0。1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0及适宜的表面活性剂；上样量应不低于20g ，于波长280nm处检测，以人白介素2色谱峰计算理论板数,应不低于1500。按面积归一化法计算，人白介素-2主峰面积应不低于总面积的95。0。3。1.5 分子量依法测定（附录 C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1。0g,分子质量应为15。5kD1。655kD。3。1。6外源性DNA残留量每1支应不高于

7、10ng(附录 B).3。1.7宿主菌蛋白残留量应不高于总蛋白质的0.10%（附录 C)。3.1。8 残余抗生素活性依法测定（附录 A），不应含有残余氨苄西林或者其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%进行测定。3.1.9 细菌内毒素检查每300万IU应小于10EU（附录 E凝胶限量试验）。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025再进行测定。3。1。10 等电点主区带应为6.57。5， 供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录 D）。3。1.11 紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100g/ml500g/ml，在光路1cm、波长2

8、30nm360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为2773nm（附录 A）。3。1.12 肽图 （至少每半年测定一次)依法测定（附录 E)，应与对照品图形一致。3。1。13 N末端氨基酸序列(至少每年测定一次）用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列为：(Met）AlaProThrSer-SerSerThrLysLysThr-GlnLeu-GlnLeu-Glu3。2 半成品检定3。2.1细菌内毒素检查每300万IU应小于10EU(附录 E 凝胶限量试验）300万IU/支以上规格的，每支应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025再进行测定。3.2.2 无菌检查依法检查（附

9、录 A),应符合规定。3。3 成品检定除水分、装量差异测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余项目的检定。3.3。1 鉴别试验按免疫印迹法(附录 A)或免疫斑点法（附录 B）测定,应为阳性。3。3.2。 物理检查3。3.2。1 外观应为白色或微黄色疏松体,加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。3。3.2。2 可见异物依法检查（附录 B),应符合规定。3.3。2.3 装量差异按附录A中装量差异项进行，应符合规定。3。3。3 化学检定3。3.3.1 水分应不高于3.0（附录 D）。3。3。3.2 pH值应为6。57。5（附录 A)。如不含SDS，则应为3.57。0。3.3。3.3渗透

10、压摩尔浓度依法测定（附录V H），应符合批准的要求。3.3.4 生物学活性应为标示量的80150%（附录 D）。3.3。5残余抗生素活性依法测定（附录 A)，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性.3.3.6无菌检查依法检查(附录 A），应符合规定。3.3.7细菌内毒素检查每1支应小于10EU（附录 E 凝胶限量试验）.如制品中含SDS，应将SDS浓度稀释至0.0025再进行测定。3.3.8 异常毒性检查依法检查（附录 F小鼠试验法），应符合规定.3。3.9乙腈残留量如工艺中采用乙腈，则按气相色谱法（附录 C）进行。色谱柱采用石英毛细管柱,柱温45，汽化室温度150,检测器温度300,载气为氮气，流速为每分钟4。0ml，用水稀释乙腈标准溶液，使其浓度为0。0004%，分别吸取1.0ml上述标准溶液及供试品溶液顶空进样400l，通过比较标准溶液和供试品溶液的峰面积,判定供试品溶液乙腈含量。乙腈残留量应不高于0。0004。3.3.10 SDS含量（待定）4 保存、运输及有效期于28避光保存和运输，自生产分装之日起,按批准的有效期执行。5 使用说明应符合 “生物制品包装规程”规定和批准的内容。文中如有不足，请您指教！5 / 5