微生物实验指导书

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1、微生物实验指导书实验一普通光学显微镜的使用维护一、实验目的：1、掌握显微镜的构造原理及性能。2、纯熟掌握显微镜的操作方法3、初步了解血球计数板的使用方法。二、实验原理：1、显微镜的实验原理：普通光学显微镜运用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这重要有如下二方面的因素： 增长照明亮度 增长显微镜的分辨率。2、血球计数板

2、的构造原理：血球计数板是一块特制的厚的载玻片，其上由四条竖槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短的横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格为计数室。123III计数室的刻度有两种规格即1625或2516的。现在常用2516的，即计数室（一个大方格）提成25个中方格，每个中方格由分为16个小方格。左上右上中心左下右下三、材料与仪器：1、仪器：显微镜 、载玻片、盖玻片、牙签、血球计数板2、材料：擦镜纸、元葱四、实验环节：（一）显微镜练习：1、制片：用牙签挑少许元葱表皮放在载玻片上，然后加盖盖玻片。2、观测：低倍镜 高倍镜（二）血球计数板的练习：先用低倍

3、镜查找中方格，再用高倍镜查找小方格，按照左上、左下、右上、右下、中心格练习。实验二 革兰氏染色法一、目的规定了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反映是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创建的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观测到细菌的形态并且还可将所有细菌区分为两大类：染色反映呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表达；染色反映呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表达。细菌对于革兰氏染色的不同反映，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而导致的。革兰氏阳性细菌的细胞壁重要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用

4、乙醇解决时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性减少，使结晶紫-碘复合物被保存在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇解决时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增长，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。三、器材大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌；革兰氏染色液、载玻片、盖玻片、接种环、显微镜、擦镜纸等。四、操作环节1涂片：将培养1416小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定期通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

5、2染色（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染 用番红液染12分钟，水洗。（5）镜检 干燥后，置油镜观测。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反映为准，过于密集的细菌，经常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色限度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解

6、了，都常呈阴性反映。五、报告：大肠杆菌为_、枯草芽孢杆菌为_、金黄葡萄球菌为_实验三 霉菌形态的观测一、目的规定：1、学习观测霉菌的方法。2、掌握几种常用霉菌的形态特性。3、学会霉菌制片技术。4、了解霉菌的形态构造及菌落特性。二、基本原理：霉菌是具有分枝的菌丝体，菌丝体及孢子的形态是辨认不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝较粗大，一般在低倍镜下即可观测到，观测霉菌常用的方法有：1、直接制片观测法：将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，用此染液制成的霉菌制片的特点是细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，防止孢子飞散。必要时，可用树胶封固，制成永久标本长期保存。2、载玻片

7、培养观测法：用无菌操作将培养基薄层置于载玻片上，接种欲观测物，然后盖上盖玻片，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿着玻片横向生长，培养一定期间后，直接将载玻片放在显微镜下观测，这种方法可以保持霉菌的自然生长状态，这便于观测不同发育期的培养物。三、实验材料：1、 菌种：根霉、毛霉、曲霉、青霉培养物。米曲霉、毛霉平皿菌落2、 以载玻片培养法制成的上述霉菌标本3、 乳酸石炭酸棉蓝溶液4、 显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、镊子四、实验方法及环节：1、曲霉形态的观测 曲霉的营养菌丝体是由具有横隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色。分生孢子梗是从足细胞生出，并略垂直于足细胞的长轴。分生孢子梗大都无横膈

8、，常在顶部膨大成为顶囊，顶囊表面产生小梗，放射生出，分生孢子自小梗顶端相继形成，最后成为不可分枝的链。由顶囊小梗以及分生孢子链构成分生孢子穗，形如菊花，具有各种不同的颜色。 用肉眼观测曲霉的斜面或平皿上的生长情况。 用低倍镜观测长于培养皿上的曲霉的分生孢子形状。 制片（或用悬滴培养片）用针挑取菌落边沿的嫩菌丝，小心放在载玻片上，观测菌丝有无横膈及分生孢子着生等细微结构。2、毛霉形态的观测： 毛霉的菌丝体大多为单细胞，在培养基上或培养基内，能广泛的蔓延，无假根和匍匐丝。菌丝体直接生出孢子梗，一般单生，分枝或较少不分枝，分枝顶端都产生孢子囊梗，孢子囊球形，椭圆形。大多数种类子囊成熟后，其壁易消失或

9、破裂，但留有残迹，囊内部有囊轴。 用肉眼观测毛霉在斜面或平皿中的生长情况。 将插片培养的血盖片一面擦干净另一面向上放在载玻片上在低倍镜下观测孢子囊大小形态、色泽、孢子囊梗的粗细。 将血盖片翻过来压在载玻片上，在高倍镜下观测毛霉的细微结构，观测孢子囊梗、囊轴、孢子囊、孢子及厚垣孢子的形态。3、菌落形态的观测：用肉眼或低倍镜观测霉菌形态。压滴法观测：取一大头针挑出一完整菌体放于洁净载玻片上，用高倍镜观测，并绘图。实验四 悬滴培养（曲霉菌孢子发芽率测定）一、目的规定：1、了解悬滴培养的概念。2、掌握曲霉菌孢子发芽率的测定方法。二、基本原理：曲霉菌用于酿造发酵的菌株较多，重要运用它在生产繁殖过程中分泌

10、的蛋白酶，淀粉酶等作用发酵原料中的蛋白质、淀粉等成分生成发酵产品的有效成分及中间成分。曲霉菌的繁殖方式重要是无性孢子繁殖。繁殖生长的过程：分生孢子碰到适宜的条件（温度、水分、养分）即开始吸水，体积膨胀（约是原体积12倍）继而开始发芽产生菌丝。菌丝生长到一定限度即会产生足细胞，足细胞上会产生分生孢子梗，在梗的顶端产生顶囊。顶囊又生出小梗，在小梗上会生出一串串的分生孢子，完毕一个生长周期。曲霉菌孢子发芽率的测定是将成熟休眠的曲霉菌的分生孢子，接种到培养基上控制一定温度（300C）培养45小时，在显微镜下观测发芽孢子和未发芽总孢子数的比例。在发酵生产用菌的培养过程中具有很重要的意义。三、仪器材料：

11、显微镜、培养箱、培养皿、凹玻片、培养基（米汁）、米曲霉种曲（固体粉末）、无菌稀释液四、操作环节：1、将培养基放在搪瓷缸的水浴中于电炉上加热熔解（每四个小组做一份）。2、取米曲霉种少许（约达拇指盖大小）放入盛有50ml无菌水的三角瓶内（内有4-5粒玻璃珠）充足振荡，使其孢子散成个体悬浮液。（全班做一份）。3、用吸管吸取1ml孢子悬浮液，放入盛有9ml无菌水的试管内，充足振荡晃匀做10倍梯度稀释。（每四个小组做一份） 4、取一片血盖片擦干净，另取一支1ml吸管，取一滴试管内的孢子稀释液放在血盖片上，另取一只玻璃棒蘸取一滴加热融化的培养基快速与血盖片上的孢子稀释液混合均匀，并使其涂布面积的直径控制在

12、10mm以内，在10秒内完毕。 5、待血盖片上的培养基涂布层冷却凝固后，取一凹玻片，将血盖片上的涂布层扣在凹玻片上的凹窝内。然后将凹玻片放在显微镜下用高倍镜观测。在每个视野内应有10个左右的孢子，若不符合规定应重新按第四条操作至符合规定。（每人做一份） 6、在培养皿内加入2ml左右的水，将制备好的培养基涂片放在培养皿内的小导管上，不要使涂片与水面接触。（每组2个人的涂片放在一个培养皿内分别作好标记）盖好盖，放在300C培养箱内培养45小时，取出放在显微镜下观测一个视野内发芽孢子和未发芽孢子数，查看34个视野，总数进行计算。 7、计算： 发芽率%=34个视野发芽孢子总数/3-4个视野和未发芽孢子

13、总数100% （培养时间 h）五、注意事项： 1、用培养基涂片时一定要趁热快速与菌液混合均匀涂布成光洁平整的培养层，否则会形成凹凸不平的培养面影响观测。 2、培养基涂片层扣在凹窝上以后血盖片千万不能再在载玻片上移动，否则会导致培养基涂片层断裂影响观测。 3、镜检时一定选取有代表性的3-4个视野观测技术，每个视野孢子数最多不能超过20个否则会出现漏计或重计。 4、发芽率的高低与培养时间有关，在计算发芽率时一定注明培养时间。IV 课后小结：1、这次实验很成功，大多数同学培养的出芽率都很正常。2、这次实验从其几个班的整体分析，培养时间是很关键的，4-5小时。近5小时最佳。实验五 酵母细胞计数测定一、

14、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法合用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观测。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半

15、边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又提成25个小方格；另一种是一个计数区提成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又提成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中

16、微生物细胞的数量。已知：1mm3体积=10 mm10 mm10 mm= 1000mm3所以：1mm3体积应具有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4106个小方格，即系数K=4106 。因此：每ml菌悬液中具有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）系数（K）菌液稀释倍数（d）三、实验器材 1活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。2器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。四、实验方法 1菌悬液制备：稀释10倍。2取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计

17、数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边沿摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液运用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，导致计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产气愤泡）。4静置半晌，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观测并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观测时应减弱光照的强度。5计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。假如是25个大方格组成的计数区，除数上述四个

18、大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6对于出芽的酵母菌，芽体达成母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品反复计数23次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。7测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验作业： 将实验结果填入下表中：次 数12中方格左上格左下格右上格右下格中心格左上格左下格右上格右下格中心格细胞

19、数每小格细胞平均数（N）系数（K）4106菌液稀释倍数10每ml菌悬液中所含细胞数平均值实验六 酵母出芽率死亡率测定一、 目的规定：1、 进一步掌握血球计数板的应用。2、学会出芽率、死亡率的测定。二、 实验材料及仪器：1、 菌液（分装在烧杯中+小滴管）2、显微镜、血球计数板3、吕氏美兰（甲基蓝）三、 样品稀释：用10倍稀释法达每小格内有45个菌体为宜。四、 操作环节：1、 制片：摇匀 滴加菌样：多则吸去，少则滴加。2、 计数：对位于双格线上的菌体若大部分在内格线上）（1） 采用只计两边法：计上不计下，计左不计右。（2） 芽体小于菌体12时为细胞芽体，大于菌体12时为细胞。（3） 计不同深度的细

20、胞。3、 死亡率的测定：蓝者为死细胞（代谢停止，无还原能力）无色为活细胞（还原能力强 蓝色 无色）注意：（1）光线暗为好（2）聚光下降（3）位置对准（4）焦距很小：从侧面看几乎檫着，用细调丝下降载物台。五、实验报告：酵母出芽率次数123出芽率中格序号123451234512345平均值细胞数芽体数细胞数ml芽体数ml出芽率酵母死亡率123456平均值死亡率活细胞死细胞实验七霉菌形态的观测一、 目的规定：掌握工业生产中几种常用霉菌的形态特性，学习观测霉菌的方法。二、 实验材料：1、平皿菌落2、显微镜、大头针、载玻片等三、 实验方法及环节：1、 菌落形态的观测：用肉眼或低倍镜观测霉菌形态。2、 压

21、滴法观测：取一大头针挑出一完整菌体放于洁净载玻片上，用高倍镜观测，并绘图。实验八、 培养基制备一、目的规定1、明确培养基的配制原理。2、通过对米曲汁培养基和细菌培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和环节二、基本原理米曲汁培养基和牛肉膏蛋白胨培养基是两种应用最广泛和最普通的霉菌及细菌培养基，米曲汁培养基为微生物生长提供大量的碳源和能源等。细菌培养基具有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源氮源，而NaCI提供无机盐。在配制培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下960C时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在400C时凝固，

22、通常不被微生物分解运用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。此外细菌培养基，要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。三、器材大米，牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，；1mol/L NaOH, 1mol/L HCI；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平牛角匙，高压灭菌锅，铝锅、pH试纸（pH5.5-9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，纱布等。四、操作环节1米曲汁培养基（8人一组，每人5支-6支）（1）大米300g淘洗干净加入（1：4）的水2.5斤熬煮成米粒松散的粥（2）加入大米重量15%的麸曲40g搅拌均匀。（3）加入50单位/g的糖化

23、酶约1g搅拌均匀。（4）放置于60-610C培养2-3h。（5）过滤局限性时用蔗糖调整（滤液（7-7.5B0t）。（滤液波美度太高时加水调节：VH2O=B0e/7.5B0e，假如滤液波美度达不到所需值，应加热浓缩。）（6）向滤液中加入2%琼脂加热熔解（米曲汁量）（7）分装试管，塞棉塞、捆扎。（8）灭菌。（9）摆斜面。（10）培养基检查: 500g50单位/g 5万 =1.5g(大米重量) (糖化酶活力) 将培养基在300C的条件下培养2-3天，观测是否染杂菌。2、细菌培养基制备：（2人一组，每人做5支，配制100ml）(1) 蛋白胨1g, 牛肉膏0.3g(3%的牛肉膏溶液10ml) NaCI

24、0.5g 琼脂2g 水 100ml(注:牛肉膏事先配成3%溶液待用)(2) 用10%Na2CO3条pH至7.2-7.4(或用NaOH) (3) 加入琼脂加热搅拌溶解.(4) 分装试管，塞棉塞、捆扎。(5) 灭菌。（6）摆斜面。(7)培养基检查:50ml水+蛋白胨1g+10ml牛肉膏+0.5gNaCI+40ml水+2g琼脂 3.淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基,培养放线菌) 可溶性淀粉 20g 2gKNO3 1g 0.1gK2HPO4 0.5g 0.05gNaCI 0.5g 0.05gMgSO4 0.5g 0.05gFeSO4 0.01g 0.001g琼脂 20g 2g水 1000ml 100ml

25、pH 7.2-7.4 7.2-7.4（注意：分五组，7人一组，每人4支）配制时，先用少量水，将淀粉调成糊状，在火上加热边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml（或100ml）。1.05Kg/Cm2,121.30C灭菌20分钟。五、实验报告 六、总结：1这次实验学生试管培养基制备数：每人5-6支。其中：细菌2支，酵母菌2支，霉菌2支，淀粉培养基1支用途：练习接种：细菌2支，酵母菌2支，霉菌1支，淀粉培养基1支。考试：细菌1支，酵母菌或霉菌1支。2 实验注意事项：（1）配料要准确、严格。（2）琼脂量指米霉菌汁（滤液）量的2%（不能过少）。（3）消毒压力一定要达成0.1帕30min.

26、(4) 等斜面凉透后再捆扎收藏备用. (5)检查pH的时间.实验九微生物的接种一、 实验目的规定：1、 掌握无菌操作的基本环节。2、在规定的时间内完毕一定数量的接种任务。二、 实验材料：1、 菌种：细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌酵母菌：面包酵母霉菌：米曲霉、黑曲霉2、 基质：细菌基质 糖液3、 接种工具：接种环、酒精灯、接种箱等4、 其它三、 实验原理：接种中始终保持无菌操作，所用器具必须灭菌，接种前后接种针要灭菌，在火焰周边接种，棉塞也要灭菌。四、 操作：1、 接种前准备：查接种工具，贴标签：菌名、姓名、日期（代数）2、接种方法：（1）拿试管（2）点酒精灯（3）接种针灭菌（4）接种

27、（5）试管口灭菌、棉塞灭菌（6）重塞棉塞（7）接种针灭菌3、注意事项：（1）勿划破基质表面（2）菌体勿沾到管壁上（3）菌体勿烫死实验十、空气中微生物的检查一、目的规定1、通过实验了解一定环境中微生物的分布状况。2、学习并掌握空气中微生物检查的基本方法。3、学会沉降平板法测定空气中微生物含量的方法。 二、基本原理:空气中具有多种微生物，当落到适宜的环境条件下如：营养、酸碱度、氧等，再在适宜的温度条件下进行培养，就会良好生长。 三、实验仪器 粗天平、 培养皿、 150ml三角瓶、 烧杯、 吸耳球、10ml吸管、 高压灭菌锅四、操作环节（一）、平板配方（每组配70ml）蛋白胨1% 牛肉膏0.3% N

28、aCl0.5% 琼脂1.5% 葡萄糖0.1% PH7-7.2（二）、培养基配制、灭菌、制平板：1、配制：用100ml烧杯在天平上称取牛肉膏0.2g,然后再用纸片分别称取蛋白胨0.7g, NaCl 0.35g放入烧杯中，再吸取1%葡萄糖7ml，加入少量水（约30ml）溶解后用1M NaOH调PH至7.0-7.2，然后倒入100ml量筒中加水至70ml用漏斗倒入150ml三角瓶中再加入1-1.5g琼脂，塞入棉塞用纸包好灭菌。2、器皿准备：每组将直径90mm的培养皿6个刷洗干净分2包用纸包好待灭菌。每组分别将一支10ml吸管和一个吸耳球用纸包好待灭菌。 3、灭菌：将上述培养基和器皿放入高压灭菌锅内控

29、制蒸汽压力0.1MPa至0.12MPa灭菌15min，缓慢排气冷却。4、制平板：当灭菌器压力回零后，打开盖趁热取出放入接种箱内，在无菌条件下，先将三角瓶内培养基晃匀趁热用10ml吸管吸取10ml培养基放入培养皿内晃平后放入水平位置冷却凝固。（三）、使空气中的微生物自然落入培养皿的培养基上，将冷却凝固后的平板培养基包好带入被检测场合，将平皿（5个）均匀摆在被测场合的离地面高0.8m以上的平面上（防止将地面的尘土吸起落入皿内）将平皿打开，估计空气中菌的浓度多少，使平板培养基暴露在空气中待一定期间（6-60min）然后将培养皿盖好。培养1-2天。 该次安排各组被测场合及暴露时间如下：1-2组 检测接

30、种箱内空气 60分钟3-4组 检测接种箱内空气 30分钟5-6组 微生物实验室内空气 5分钟7-8组 教室内空气 5分钟9-10组 卫生间空气 5分钟11-12组 实习厂空气 1分钟注意：（每组6个平板培养基，其中5个做实验，1个做无菌空白对照）（四）培养： 将培养皿包好倒扣在350C培养箱内培养3天观测记录平皿内的菌落数，取5个平皿的平均值计称。（五）、计称：1、 计称5个平皿的平均菌落数 平皿平均数=（皿1+皿2+皿5）/52、计称100cm2培养基暴露10分钟时的菌落数 100cm2培养基10分钟菌落数=平皿平均数/r2t10100 平皿平均数-5个平皿平均菌落数 r-平皿半径（cm）

31、t-平皿培养基暴露在空气中的时间（按分钟计算） 10-按10分钟计为单位100-求100cm2培养基上的菌落数3、求1M3空气中的活菌数每立方米空气中活菌数=100cm2培养基上的菌落数/20100020-100cm2培养基暴露10分钟（在空气中）相称于接受20升空气中的活菌数。1000-将1升空气中的活菌数按称成1M3空气的活菌数。实验十一、 微生物的分离技术（分离产蛋白酶的米曲霉）一、目的规定学会在无菌操作下进行纯种分离的操作方法。二、基本原理为了获取某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件规定不同，而供应它适宜的培养条件，或加入某种克制剂导致只利于此菌生长，而克制其

32、它菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。三、实验仪器1、三角瓶250ml 1个2、试管 4个 3、1ml吸管5支4、培养皿4个5、10ml吸管 1支 6、吸耳球 1个7、代分离菌种少许8、分离培养基四、操作环节1稀释分离前的准备工作：将三角瓶、试管、吸管、培养皿用水刷洗干净。在三角瓶中装入50ml蒸馏水，放入5-6粒玻璃珠用棉塞塞好，用牛皮纸包扎。每支试管装入ml蒸馏水用棉塞塞好编号后用牛皮纸捆扎在一起。将培养皿用纸包在一起。有吸管的上端塞入长2cm左右的棉花、棉塞不得外露也不得过松过紧，分别用纸条

33、包好。吸耳球用纸包好。将上述物品放入高压消毒器内，压力0.1MPa灭菌20分钟后取出放入接种箱内冷却备用。将分离培养基放入搪瓷缸中倒入少量水放在电炉上加热煮沸至培养基所有熔解为止，连同搪瓷缸取下备用。 2菌样的稀释分离：取被分离的菌样约0.005克左右（三角瓶菌种象大米粒2-3块）放入冷却后的三角瓶内的水中塞好棉塞后用力振摇5分钟以上使菌种孢子个个分离后放入接种箱内。用75%乙醇棉球对手进行消毒后再在接种箱内对试管外表面进行消毒。在接种箱内，按无菌操作规定用1ml吸管吸取三角瓶内菌液1ml放入1号试管内塞好棉塞后晃匀，并将用过的吸管放在1号试管中，依次类推做至4号试管。此时菌样已稀释50万倍，

34、规定在三号或4号试管内每ml稀释液中含孢子在5-15个之间为宜。分别从3号、4号试管中吸取1ml稀释液放入2个培养皿中。将煮沸熔解后的培养基冷却至450C左右（不能用温度计以感觉不烫手为宜）用75%乙醇棉球消毒后在接种箱内用10ml吸管吸取 15ml培养基放在4个培养皿内，每放完一个培养皿后迅速用手晃动平皿，使培养基在位未凝固前与菌液混合均匀。然后放在水平面台上待凝固后取出用纸包好扣于300C培养箱内培养2-3天观测结果。 五、注意事项： 1、被分离菌种的使用量一定要控制对的，规定三角瓶中每ml稀释液中含孢子数在5-10万个为宜，大于此数会导致分离失败。 2、向平皿中加入的培养基一定将温度控制

35、在45-500C之间，并且规定加入时要迅速否则会引起凝固，无法吸取或培养基在平皿内提前凝固与稀释菌液混合不匀，凝固面不平的现象。 3、皿内培养基在凝固时一定放在水平面上，否则会导致培养基厚薄不均影响分离结果。 4、平皿一定要倒置放在培养箱内培养可防止杂菌和冷凝水进入。 六、实验报告：分离培养基配制附后分离培养基制备：1、 配方： 酪蛋白0.4% KH2PO4 0.04% MgSO4 0.01% 琼脂 2% PH自然2、 操作：（每小组配100ml，分装6支试管，每支15ml）按上述配方称取酪蛋白0.4g放入100ml烧杯中加入0.1MNaOH溶液5ml放在电炉上小火加热熔解后，加入10ml0.

36、4%KH2PO4（相称于干剂0.028g），10ml0.1%MgSO4(相称于干剂0.007g)混匀后加入75ml蒸馏水再加入2g琼脂加热搅拌溶解。分装试管，加棉塞灭菌。 （KH2PO4 , MgSO4 事先配成0.4%，0.1% 溶液） 实验十二、 大肠菌群的测定一、 实验目的 ：1、了解大肠菌群在食品卫生检查中的意义 2、学习并掌握大肠菌群的检查方法 二、实验原理： 大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌重要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病

37、菌污染的也许性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似（themostprobablenumber-简称MPN）表达。三、材料 3.1样品 :乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 3.2菌种 :大肠埃希氏菌（Escherichiacoli） 产气肠杆菌（Enterobacteriaaerogenes） 3.3培养基及试剂 :单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液。 3.4其它 :恒温箱、 药物天平、培养皿、载玻片等 四、流程：大肠菌群检查程序如： 检样 稀释 乳糖胆盐发酵管 36 1 ,242h 不产

38、气 产气 大肠菌群阴性 伊红美蓝琼脂平板 36 1 ,1824 h 报告 革兰氏染色 乳糖发酵管 36 1 ,242h 革兰氏阳性革兰氏阴性 产气 不产气 无芽胞杆菌 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性大肠菌群阴性 报 告 报 告 报 告 五、 操作环节：1、 检样稀释1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充足振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最佳用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度解决1min,做成1:10的均匀稀释液。1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入

39、具有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。1.4 根据食品卫生标准规定或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。2、 乳糖发酵实验:将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置361 温箱内,培养242h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。3、 分离培养: 将产气的发酵管分别转种在伊红美

40、蓝琼脂平板上,置361 温箱内,培养18-24h,然后取出,观测菌落形态,并做革兰氏染色和证实实验。4 、证实实验:在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 361温箱内培养242h,观测产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。5 、 报告: 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。6、 粪大肠菌群(faecal coliform)6.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内,置44.50.2水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养242

41、h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。6.2 结果报告: 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。实验十三、食品中细菌总数的测定 一、实验目的： 1、学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理。 2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。 二、实验原理： 菌落总数是指食品通过解决，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数重要作为判别食品被污染限度的标

42、志，也可以应用这一方法观测细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表达样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验材料： 3.1食品检样 3.2培养基 :营养琼脂培养基，无菌生理盐水 3.3其它 ;无菌培养皿，无菌移液管，无菌不锈钢勺。 四、流程：检样 做成几个适当倍数的稀释液 选择23个适当倍数的稀释液各以1ml分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂 菌落计数报告五、操作环节： 1、取样、稀释和培养 1.1以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置

43、适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充足振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最佳置灭菌均质器中以800010000r/min的速度解决1min，制成1:10的均匀稀释液。 1.2用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁渐渐注入具有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。 1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。 1.4根据标准规定或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

44、1.5稀释液移入平皿后，将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2、菌落计数方法 作平皿菌落计数时，可用肉眼观测，必要时用放大镜检查，以防漏掉。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。假如不能立即计数，应将平板放置于04，但不要超过24h。 3、菌落计数报告方法 3.1平皿菌落数的选择 选取菌落数在30300之间

45、的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。 3.2稀释度的选择 3.2.1应选取平均菌落数在30300之间的稀释度报告： 稀释度选择及菌落数报告方式 例 次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数(个/g或ml)报告方式(个/g或ml)10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.61042多不可计295461.63775038000或3.81043多不可计271

46、602.22710027000或2.71044多不可计多不可计313-3130031000或3.1104527115-270270或2.71026000-110107多不可计30512-3050031000或3.1104.3.2.2若有二个稀释度均在30300之间时，应以两者比值决定，比值2取平均数，比值2则其较小数字（表1中例2和3）。 3.2.3若所有稀释度均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1中例4）。 3.2.4若所有稀释度均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之（表1中例5）。 3.2.5若所有稀释度均无菌落生长，则应按300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1中例7）。 3.4菌落计数报告方法 菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表达。 4、结果 1将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。 2对样品菌落总数作出是否符合卫生规定的结论。