实验五 考马斯亮蓝G

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1、实验五 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、实验目的1、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理与方法2、熟练分光光度计的使用和操作方法二、实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸 收在 595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G

2、-250结合，在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速， 其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测 定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。三、实验器材1、实验仪器分析天平、722型分光光度计、5mL移液管、研钵、量筒2、实验材料和试剂1）绿豆芽2）标准蛋白质原液:称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL,即为1mg/mL 的标准蛋白质原液。3）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL 95%乙醇中，加 入85% （m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温

3、下可放置一个 月。四、实验步骤1、标准曲线绘制取6 支试管，按下表加入各试剂。012345100 yg/ml牛血清白蛋白溶液/ ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ ml1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液/ ml5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定， 记录 A595。以各管相应标准蛋白质含量（聘）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、绿豆芽蛋白质样品的制备取两根新鲜绿豆芽的下胚轴，称量并记录重量后，放入研钵中，研成匀浆，用5ml蒸 馏水份三次，把研钵冲洗干净，将全部液体转入试管中待用。

4、3、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL ,再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置 5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测a595从标准曲线上查得蛋白质含量。五、实验结果样品蛋白质含量（yg/g鲜重）=查的蛋白质含量（卩g/g） X提取液总体积（ml） / 样 品鲜重（g）x测定所取提取液体积（ml）六、注意事项（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时 间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附 量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。