实验一收集动物组织的活细胞-RH

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1、实验一 收集动物组织的活细胞并计数和测定成活率 问 题 如 何 知 道 每 升 血 液 中 红 细 胞 、 白 细 胞 、 血 小 板的 数 量 ？ 如 何 知 道 水 样 中 某 小 型 生 物 的 数 量 ？ 如 何 知 道 发 酵 液 中 啤 酒 酵 母 的 密 度 ？ 如 何 知 道 生 物 制 剂 生 产 罐 中 细 胞 的 密 度 ？ 实 验 目 的 学 习 机 械 分 离 法 获 得 动 物 组 织 的 活 细 胞 学 会 使 用 血 球 计 数 板 测 定 细 胞 悬 液 的 细 胞 密 度 掌 握 活 细 胞 和 死 细 胞 的 鉴 别 方 法 收 集 动 物 组 织 的 活

2、 细 胞 从 组 织 中 分 离 单 细 胞 的 方 法 有 多 种 ：对 于 较 为 柔 软 的 组 织 （ 如 肝 脏 、 脾 脏 ） ， 可 以 采用 机 械 研 磨 的 方 法 分 离 细 胞 ， 但 这 会 造 成 一 些 细胞 的 损 伤 而 降 低 细 胞 的 成 活 率 ；对 于 比 重 差 异 较 大 的 细 胞 ， 可 以 采 用 离 心 的 方 法来 分 离 ， 例 如 血 液 中 各 种 血 细 胞 的 分 离 ；对 于 股 骨 中 骨 髓 细 胞 的 分 离 ， 则 可 以 采 取 冲 洗 股骨 腔 的 方 法 获 得 。 实 验 材 料小 鼠小 鼠 的 抓 法 ：

3、从 鼠 笼 内 将 小 鼠 尾 部 抓 住 并 提 起 ， 放 在 磁 盘 上 或 报纸 上 。 小 鼠 的 处 死 ： 颈 椎 脱 位 法右 手 （ 左 手 ） 抓 住 鼠 尾 用 力 向 后 拉 ， 同 时 左 手（ 右 手 ） 拇 指 与 食 指 用 力 向 下 按 住 小 鼠 头 部 ， 在颅 骨 基 部 的 后 侧 与 颈 椎 两 侧 ， 施 加 压 力 ， 使 头 颅和 脑 一 起 与 脊 髓 分 离 。 当 脊 髓 与 脑 分 离 时 ， 伴 有大 量 的 肌 肉 活 动 。 经 研 究 证 明 ， 这 种 方 法 能 使 实验 动 物 对 痛 觉 不 再 敏 感 。 脾 脏 淋

4、 巴 细 胞 悬 液 的 制 备1.机 械 分 离 法 用 镊 子 将 脾 脏 置 于 尼 龙 布 上 ， 用 注 射 器 推 棒 轻 轻挤 压 组 织 ， 使 细 胞 分 散 。 将 尼 龙 布 置 于 玻 璃 漏 斗中 ， 用 D-Hanks 液 冲 洗 尼 龙 布 ， 收 集 细 胞 悬 液 于离 心 管 中 。 2.低 渗 溶 解 红 细 胞 （ 红 细 胞 溶 血 ） 0.87% NH4Cl 溶 液 股 骨 骨 髓 细 胞 悬 液 的 制 备冲 洗 骨 髓 腔 ： 用 剪 刀 剪 开 股 骨 的 一 端 ， 将 注 射 器 针 头 插 入 股 骨 开口 端 。 然 后 用 剪 刀 剪

5、 开 股 骨 的 另 一 端 ， 用 D-Hanks液 多 次 冲 洗 骨 髓 腔 ， 收 集 细 胞 悬 液 于 离 心 管 中 。 D-HANKS液 (无 钙 镁 离 子 的 HANKS液 ) 配 方NaCl 80.0克Na2HPO42H2O 0.6克 （ 如 为 12H2O， 则 需 1.2克 ）KCl 4.0克KH2PO4 0.6克双 蒸 水 1000毫 升 原 液 稀 释 10倍 即 为 使 用 液 - D-Hanks液 细 胞 计 数 和 细 胞 存 活 率利 用 单 细 胞 悬 液 进 行 实 验 研 究 时 ， 通 常 需 要 确 定 细胞 悬 液 的 细 胞 密 度 和 活

6、细 胞 的 数 量 ， 这 就 要 进 行 细胞 计 数 和 细 胞 存 活 率 的 测 定 。 细 胞 计 数 一 般 用 血 球 计 数 板 ， 细 胞 存 活 率 的 测 定一 般 采 用 染 色 法 。细 胞 密 度 ： 每 ml细 胞 悬 液 中 的 细 胞 数细 胞 成 活 率 ： 总 细 胞 中 活 细 胞 所 占 的 百 分 比 血 球 计 数 板 的 结 构 血 球 计 数 板 是 特 制 的 厚 载玻 片 ， 中 央 区 域 有 四 条 凹槽 而 形 成 三 个 平 台 ， 中 间平 台 较 宽 ， 它 又 被 一 短 横槽 分 隔 为 两 部 分 ， 每 一 部分 均 有

7、 一 个 方 格 网 。 v每 一 方 格 网 可 分 为九 个 大 方 格 。 v四 角 4个 大 方 格 分别 被 分 为 16个 中 方格 。v中 央 大 方 格 分 为 25个 中 方 格 ， 每 个 中方 格 又 可 分 为 16个小 方 格 。 中 央 大 方格 共 含 有 400个 小方 格 。 血 球 计 数 板 的 原 理 白 细 胞 计 数 法 采 用 四 角 4个 大 方 格 的 区 域 ， 适 用 于细 胞 较 大 数 量 较 少 的 样 品 红 细 胞 计 数 法 采 用 中 央 大方 格 的 区 域 血 球 计 数 板 的 原 理 计 数 室 大 方 格 边 长 为

8、 1mm， 面 积 为 1mm2， 中 间 平 台 与盖 玻 片 之 间 的 距 离 （ 高 ） 为 0.1mm， 所 以 每 个 大 方 格的 固 定 容 积 为 0.1mm3。 血 球 计 数 板 的 计 数 公 式 1每 个 大 方 格 的 总 体 积 为 0.1mm3 1 ml =1000 mm3, 0.1 mm3 = 10- 4 ml 每 角 大 方 格 的 细 胞 数 10000 = 细 胞 数 /ml 4角 大 方 格 中 细 胞 总 数细 胞 密 度 = 104 4 稀 释 倍 数 = 细 胞 数 /ml悬 液 计 数 规 则v位 于 格 线 上 细 胞 只计 上 边 线 和

9、左 边 线上 的 ， 即 “ 数 上不 数 下 ， 数 左 不 数右 ”v由 两 个 以 上 细 胞 组成 的 细 胞 团 ， 应 按单 个 细 胞 计 算 。 注 意 事 项v向 血 球 计 数 板 加 样 前 ，须 将 细 胞 悬 液 充 分 摇匀 ；v加 样 过 程 中 ， 应 避 免将 细 胞 悬 液 滴 在 盖 玻片 （ 血 盖 片 ） 上 ， 避免 有 气 泡 产 生 ；v细 胞 悬 液 密 度 过 大 时 ，应 适 当 稀 释 后 再 计数 。 细 胞 密 度 的 结 果 记 录左 上角 左 下角 右 上角 右 下角 细 胞总 数 稀 释倍 数 细 胞密 度脾 脏淋 巴细 胞骨

10、髓细 胞在 10的 低 倍 镜 下 计 数 ， 细 胞 为 透 亮 的 小 圆 点 。 细 胞 成 活 率 的 测 定 利 用 染 色 法 ， 判 断 细 胞 的 死 活 ； 活 细 胞 的 细 胞 膜 具 有 选 择 通 透 性 ， 不 能 被 台 盼 蓝 染 色 ， 呈 无 色 透 明 状 ； 死 细 胞 的 细 胞 膜 通 透 性 增 大 ， 被 染 成 蓝 色 ； 细 胞 总 数 死 细 胞 数 细 胞 存 活 率 = 100% 细 胞 总 数在载玻片上操作 注 意 事 项应 在 短 时 间 内 完 成 细 胞 存 活 率 的 测 定 ， 否 则 活 细胞 会 被 染 料 毒 死 而

11、着 色 ， 影 响 实 验 结 果 的 准 确 性 ；应 在 几 个 视 野 下 计 算 死 活 细 胞 的 数 量 ， 避 免 人 为因 素 的 干 扰 ；可 以 在 40倍 的 高 倍 镜 下 ， 计 算 视 野 中 的 细 胞 总数 和 其 中 的 死 细 胞 数 。 细 胞 成 活 率 的 结 果 记 录 视 野1 视 野2 视 野3 视 野4 细 胞总 数 死 细胞 总数 细 胞成 活率脾 脏淋 巴细 胞骨 髓细 胞 血 球 计 数 板 的 计 数 公 式 2 中 央 大 方 格 的 总 体 积 为 0.1mm3 中 央 大 方 格 的 细 胞 数 1000 = 细 胞 数 /ml

12、5个 中 方 格 中 细 胞 总 数细 胞 密 度 = 25 104 5 稀 释 倍 数 = 细 胞 数 /ml悬 液 v每 一 方 格 网 可 分 为九 个 大 方 格 。 v中 央 大 方 格 分 为 25个 中 方 格 ， 每 个 中方 格 又 可 分 为 16个小 方 格 。 中 央 大 方格 共 含 有 400个 小方 格 。 实 验 报 告实 验 过 程 中 将 原 始 数 据 记 录 在 实 验 讲 义 中 ；在 实 验 报 告 纸 上 进 行 实 验 数 据 的 计 算 和 结 果 分 析 ；回 答 问 题 ；阅 读 文 献 资 料 。 成 绩每 次 实 验 报 告 均 打 分

13、 并 累 计 为 平 时 成 绩 ；如 发 现 实 验 报 告 和 作 业 的 抄 袭 ， 抄 袭 者 和 被 抄 袭者 的 成 绩 均 记 为 0分 。 显 微 镜 的 组 成 部 分目镜观察筒物镜转换台物镜标本夹载物台 X,Y轴旋纽电源开关光强调节纽光源聚光镜升降旋钮光阑调节器 调节瞳间距调节屈光度所需物镜、聚焦5、4、1、放入样品转换聚光镜 10X 物镜2、3、40X 物镜观察6、 明 场 观 察 观 察 步 骤 思 考本 次 实 验 要 解 决 什 么 问 题 ？采 用 什 么 方 法 来 解 决 这 些 问 题 ？还 能 用 其 他 什 么 方 法 来 解 决 这 些 问 题 吗 ？应 用 这 些 方 法 还 能 解 决 什 么 问 题 ？