HIV检测及临床意义

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1、HIVHIV检测及临床意义检测及临床意义HIV的发现的发现Montagnie(LAS)1983.Science 220:868-871Gallo(HTLV)1983.Science220:865-86Levy(ARV)1984.Science225:840-8421986 1986 国际病毒分类委员会国际病毒分类委员会：HIV HIV-2 1986 西非西非中国每年新发现的中国每年新发现的HIV/AIDS病例数（病例数（19852002）HIV感染可通过两种途径检测感染可通过两种途径检测1.1.直接检测病毒或其组成部分直接检测病毒或其组成部分2.2.检测人体检测人体HIV免疫反应免疫反应HIV

2、特异性抗体特异性抗体从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-31-3个个月，有一小部分月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应感染者出现延迟反应HIVHIV感染后抗原和抗体的变化感染后抗原和抗体的变化及其与疾病关系及其与疾病关系HIVHIV感染人体后出现一过性病毒血症，感染人体后出现一过性病毒血症，6-86-8周后血清周后血清抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的5-85-8年无症状年无症状带毒期里带毒期里HIVHIV抗体一直存在，但病毒难查到。进入抗体一直存在，但病毒难查到。进入AIDSAIDS期后血浆中病毒再次出现。期后血

3、浆中病毒再次出现。故诊断故诊断HIVHIV感染多数时间用抗体检测诊断，极早期感染多数时间用抗体检测诊断，极早期（窗口期）用抗原检测。（窗口期）用抗原检测。HIV抗体诊断抗体诊断 目前临床上实际应用的是测定特异目前临床上实际应用的是测定特异性性HIV抗体，包括抗体，包括初筛初筛和和确认确认实验。实验。一、检测试剂一、检测试剂筛查试剂必须是筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监混合型、经国家药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。量优良、在有效期内的试剂。目前常用的筛查试剂有目前常用的筛查试剂有酶联免疫酶联免疫、颗粒

4、凝集颗粒凝集和和其它其它快速诊断试剂快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。应采用酶联免疫试剂。自采自供血的单位必须进行自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在尚抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查。血液筛查。2、确认试剂必须确认试剂必须经国家药品监督经国家药品监督管理局注册批准。确认试剂包括免疫管理局注册批准。确认试剂包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验试剂。目前以免

5、疫印迹试剂最为试验试剂。目前以免疫印迹试剂最为常用。常用。1.ELISA方法：方法：目前目前最常用的初筛实验最常用的初筛实验，自，自19851985年首次年首次检测检测HIV-1抗体的试剂盒供市以来，已从抗体的试剂盒供市以来，已从第一代的全病毒抗原间接法发展到第四第一代的全病毒抗原间接法发展到第四代的以重组的多肽抗原及抗代的以重组的多肽抗原及抗P24P24抗体包被抗体包被的双夹心法，使窗口期缩短了的双夹心法，使窗口期缩短了2-32-3周。周。四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetection ofconjugate第一代第一代病毒裂解液病毒裂解液HIV-1IgG

6、抗体抗体HIV-1-IgG抗体抗体第二代第二代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG 抗体抗体HIV-1/-2 IgG抗体抗体第三代第三代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG 抗体抗体HIV-1/-2/-O病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代第四代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24 AbIgM/IgG 抗体抗体HIV-1/-2/-Op24 抗原抗原病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti

7、-p24 抗体抗体Closing the window4th gen3rd gen=1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit10001000）提示感染发生的可）提示感染发生的可能性非常大。能性非常大。使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析与判断。分析与判断。2、窗口期辅助诊断在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒毒RNARNA

8、测定具有特殊的意义。测定具有特殊的意义。目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的多个样品混合后的RNARNA检测以降低窗口期传播的残余危检测以降低窗口期传播的残余危险度。险度。3、病程监控由于由于HIVHIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDSAIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断发病时的症状区别，

9、病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与一个刚发生的症状是否与HIVHIV感染有关。感染有关。4、指导治疗方案及疗效测定并非在任何情况下感染者都应该并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如病毒载量达到一定水平后（如35000-5000035000-50000拷贝拷贝/毫升）才具毫升）才具有良好的效果。有良好的效果。只有通过治疗后病毒水平的检测只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治才能确定

10、治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低疗后病毒水平降低50%50%才被认为才被认为临床有效。临床有效。通过监测病毒滴度反映疗效通过监测病毒滴度反映疗效5、预测疾病进程、预测疾病进程HIVHIV疾病进程与病毒载量疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察的关系十分密切，观察感染者病毒感染者病毒RNARNA水平可大水平可大致预测其发病的可能。致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量如右图所示，病毒载量与与6 6年发病率的关系为：年发病率的关系为：5003000030000时则为时则为80%80%。定性检测定性检测HIVHIV核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于HI

11、VHIV感染的辅助诊断。通常使用感染的辅助诊断。通常使用PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR技术，技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见的毒株，也可使用复合引物。的毒株，也可使用复合引物。定量检测定量检测定量检测常用于监测定量检测常用于监测HIVHIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的前常用的HIV RNAHIV RNA定量测定方法有逆转录定量测定方法有逆转录PCRPCR实验（实验（RT-PCRRT-PCR）、

12、核）、核酸序列扩增实验（酸序列扩增实验（NASBANASBA）、分支）、分支DNADNA杂交实验（杂交实验（bDNAbDNA）等，这几）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为种进口试剂盒的最低检测限为20-5020-50拷贝拷贝/毫升毫升按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样品量。品量。测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除最低检测限的结果不能排除HIVHIV感染。感染。应附上仪器打印的数据。应附上仪器打印的数据。RocheBa

13、yer(前前Chiron)Organon技术技术RT-PCRbDNANuclisens HIV-1 QT结果结果比较比较约2xbDNA 2.0 2.0版结果约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche 基本相同与Roche 基本相同优点优点通过了 FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了 FDA认证 可使用多种组织，如生殖道分泌液 对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点缺点1.操作容易污染2.测定范围较小（相对于NASBA）3.少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液4.早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B

14、亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进5.对O亚型检测能力较差对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche 基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。实验内、外误差相对较大。检测检测范围范

15、围标准版(Amplicor 1.0 及 1.5)400-750,000 c/mL 超敏版(Ultra-Direct 1.0 and 1.5):50-75,000 c/mLbDNA 3.0版:100-500,000 c/mLNuclisens HIV-1 QT:40-10,000,000 c/mL(取决于样品量)各种各种HIV定量检测方法的比较定量检测方法的比较关于不同关于不同HIVHIV定量检测方法的选择定量检测方法的选择目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世不同定量方法结果之间还无法直接比较同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测艾滋病免疫指标的检测艾滋病免疫指标的检测v随

16、着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的随着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙光。光。v艾滋病临床治疗中各种艾滋病临床治疗中各种免疫指标免疫指标(CD4+、CD8+T细胞细胞等等)对于确定感染状态、预测对于确定感染状态、预测发病、评价药物疗效及新药开发具有重要发病、评价药物疗效及新药开发具有重要的作用。的作用。CD4T淋巴细胞淋巴细胞：（流式细胞术）（流式细胞术）CD4T细胞是细胞是HIV的主要靶细胞的主要靶细胞,感染后感染后随着病程进展，随着病程进展，CD4T细胞不断下降细胞不断下降 500/500/mm3 3有临床诊断意义有临

17、床诊断意义 200/200/mm3 3AIDSCDC病程进展，病程进展，AIDS诊断和疗效观察的指标诊断和疗效观察的指标HIVHIV感感染染几几周周内内，出出现现类类流流感感症症状状，也也称称为为血血清清阳阳转转期期，CD4CD4细细胞胞的的数数量量降降低低。随随之之出出现现的的免免疫疫应应答答可可以以控控制制急急性性症症状状，恢恢复复CD4CD4细细胞胞的的数数量量，但但并并不不能能清清除除病病毒毒。随随着着CD4CD4细细胞胞不不断断下下降降，当当降降至至500/ul500/ul左左右右时时，开开始始出出现现机机会会性性感感染染或或其其它它疾疾病病，进进入入症症状状期期。当当CD4CD4低

18、低于于200/ul200/ul时时，即即进进入入艾艾滋病期。滋病期。CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T淋巴细胞小于淋巴细胞小于淋巴细胞小于淋巴细胞小于350/ul350/ul350/ul350/ul（结合病毒载量，确定治疗时机）（结合病毒载量，确定治疗时机）（结合病毒载量，确定治疗时机）（结合病毒载量，确定治疗时机）有有有有效效效效治疗治疗治疗治疗8 8 8 8周后周后周后周后CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T淋巴淋巴淋巴淋巴细胞数量增加细胞数量增加细胞数量增加细胞数量增加50/ul50/ul50/ul50/ulHAARTHAART无效无效无效无效CD4+TCD4+TCD4+TCD

19、4+T细胞数量下降细胞数量下降细胞数量下降细胞数量下降CD4+TCD4+T淋淋巴巴细细胞胞介介导导的的免免疫疫功能逐渐丧失功能逐渐丧失CTLCTL丧丧失失必必要要的的体体内内环环境境，功能下降功能下降HIVHIVHIVHIV感染感染感染感染病毒变异和耐药性的测定 随着随着HAARTHAART治疗的广泛开展，病毒变异和耐药治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株正在不断出现，甚至对一个药物的耐药可引株正在不断出现，甚至对一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药。起多种药物的交叉耐药。因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的测试方法，包括测试方法，包括基因型基因型HI

20、VHIV耐药测试耐药测试和和表型表型HIVHIV耐药测试耐药测试。表型HIV耐药性测试方法能能直直接接测测出出HIV-1HIV-1对对药药物物的的敏敏感感度度，并并能能揭揭示示事事先先存存在在或或交交叉叉的的耐耐药药情情况况，有有利利于于指指导导HIV-1HIV-1感感染者有效地用药。染者有效地用药。目目前前市市面面上上供供应应试试剂剂盒盒已已有有2 2种种，即即AVAV（Vicro Vicro AntivirogramAntivirogram）和和PSPS（Virologic Virologic PhenoSensePhenoSense），两两者者方方法法均均应应用用从从生生长长于于载载体体

21、中中的的HIV-1HIV-1而而获获得得的的重重组组病病毒毒和和病病人人标标本本中中蛋蛋白白酶酶与与逆逆转转录录酶酶序序列列，分分析析与与野野病病毒毒之之间间IC50IC50值值相相差差倍倍数数，一一般般达达551010倍以上为阳性。倍以上为阳性。这这种种方方法法的的最最大大优优点点是是可可以以获获得得各各种种药药物物耐耐药药量量度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。基因型HIV耐药性测试方法当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药明确的突变

22、。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药物的治疗效果。物的治疗效果。检查从病人血液标本中分离到的检查从病人血液标本中分离到的HIVHIV基因物质，应用核酸基因物质，应用核酸序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况，往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况，优点简单快速，费用低。优点简单快速，费用低。缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐药的程度。药的程度。结束结束