靶向聚合物胶束用于小分子药物的脑内递送

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1、靶向聚合物胶束用于小分子药物的脑内递送脑部以及神经系统的重大疾病(如脑肿瘤、中枢神经系统感染和神经退行性 疾病等)的发病率和死亡率逐年呈上升趋势。但由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)的存在,98%以上的小分子药物和100%的大分子药物难以入脑，使 得脑部疾病的治疗成为急需人类攻克的重大难题。目前,临床上对于脑部感染或脑肿瘤的治疗药物,通常是小分子药物,但药物 在临床使用过程中面临很多严峻的考验：(1)药物自身性质的影响,很多抗感染或 抗肿瘤的药物是难溶性小分子药物,这为临床给药,尤其是静脉给药带来困难；(2) 药物在病灶部位的蓄积能力差,药物随血液循环全身分布,不

2、仅造成病灶部位难 以达到治疗浓度,发挥药效,而且因药物在其他器官的蓄积而造成严重的毒副作 用；(3)产生耐药性,无论是造成感染的病原体还是引发肿瘤的肿瘤细胞,在进行 连续多次给药后,易产生耐药性而使治疗无效。针对上述问题,为提高脑部重大疾 病的药物治疗效果,本课题通过药剂学、高分子学和生物学手段的交叉应用,采用 目前广泛研究的纳米载体聚合物胶束,对难溶性小分子药物的脑内递送进行系 统性地研究。首先,这是由于聚合物胶束用于脑靶向递送小分子药物显示出更大的优势： (1)通过将疏水性药物包载于内核,大大增加其溶解度：(2)胶束自身较小的粒径 (十几纳米)优势,更加易于透过BBB； (3)可进行表面靶

3、向功能性分子的修饰(4) 胶束将药物包载于内核中，可以避开P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)对药物分 子的识别,进而减少药物外排作用,降低耐药性。然而,传统的靶向聚合物胶束在 具有上述优势的同时,在实际运用中,仍存在很多缺陷：(1)目前靶向分子的选取 多采用多肽、单抗等,多采用受体介导的靶向策略,而使其靶向能力提高程度有限；(2)结构稳定性差,聚合物材料的选取多为传统两亲性嵌段聚合物,因存在临界胶 束浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)的问题，在血液大量稀释情况下， 胶束易散开进而发生药物泄露。二者共同作用导致的结果是,靶向递送药物的

4、效率大大降低。因此,为改进上 述问题,本课题创新性地设计得到一种靶向智能型聚合物胶束,其优势体现于：(1) 利用转运体介导策略,开发高效靶向分子。本课题设计得到一种高亲和力的靶向分子,氧化型抗坏血酸(dehydroascorbic acid, DHA),可特异性识别BBB以及肿瘤细胞表面高表达的葡 萄糖转运体 lfacicitativeglucose transporterl,GLUTl)。将其修饰于聚合物 胶束表面,可实现脑组织与肿瘤组织的双重靶向；(2)开发一种安全性以及生物相 容性高的聚氨基酸类高分子材料,利用其侧链的活性基团,采用细胞微环境敏感 的交联剂与其发生交联反应,得到细胞微环境

5、触发药物释放的智能型聚合物胶束 因此,在二者共同作用下,本课题设计的靶向智能型聚合物胶束具有的特点 是：(1)血液循环中高度稳定,避免药物泄露,减少药物被酶降解；(2)脑组织或脑 胶质瘤的靶向,实现靶部位甚至靶细胞的药物递送,进而大大提高聚合物胶束的 靶向效率。第I部分多肽修饰的传统脑靶向聚合物胶束本文第I部分(第一、二 章)的研究，采用美国FDA认证的脂质类材料PEG-PE作为载体材料，制备传统的聚 合物胶束。利用BBB上高表达低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP)的特性，在胶束表面修饰LRP受体的

6、配 体,Angiopep-2,实现受体介导的脑靶向聚合物胶束的跨BBB转运。本文第一章主 要以Angiopep-2作为脑靶向头基，以疏水性的抗真菌药物两性霉素B(amphotericin B, AmB)作为模型药物,PEG-PE作为载体材料，构建载AmB的脑 靶向聚合物胶束给药系统,Angiopep-PEG-PE/AmB.采用薄膜水化法制备 PEG-PE/AmB聚合物胶束，并通过星点设计-效应面优化法进行处方优化，得到最 优的载药聚合物胶束制备工艺。表征结果显示,优化后的处方包封率和载药量分别为83%和12%,粒径稳定控 制在10-15nm。分别于体外单层脑毛细血管内皮细胞(brain cap

7、illary endothelial cells, BCECs)和体内考察Angiopep-2修饰的聚合物胶束的性质， 结果证实,Angiopep-2修饰后,可显著提高聚合物胶束在BCECs 上的摄取效率,而 且体内促进AmB向脑内积累，显著提高脑靶向性。另外，该将AmB包载进入胶束内核后，可显著降低AmB细胞毒性和在外周组织 的蓄积，因此可以提高静脉用药的安全性。本章研究对Angiopep-PEG-PE/AmB潜 在的脑转运机制进行深入探讨，结果表明,Angiopep-PEG-PE聚合物胶束保留了 Angiopep-2的配体-受体结合性质，通过受体介导的跨细胞转运过程跨越BBB。而且,Ang

8、iopep-PEG-PE可以保护药物分子避开P-gp的识别，从而克服P-gp 对药物的外排作用，延长药物在脑内的滞留时间。经脑切片共聚焦实验证 实,Angiopep-2的修饰不仅可促进聚合物胶束跨越BBB,并能够进一步被脑实质 细胞摄取。本文第二章主要将构建好的Angiopep-PEG-PE/AmB聚合物胶束，用于CNS感 染的治疗。在本章的第一节详细介绍了免疫缺陷的CNS感染小鼠模型建立方法, 并对其进行病理学表征,证实模型建立成功。在模型鼠上，以市售AmB制剂作为对照，分别采用Angiopep-PEG-PE/AmB和PEG-PE/AmB聚合物胶束进行治疗，实验结果显示,Angiopep-2

9、修饰后能够有效增 加聚合物胶束在模型小鼠脑内的分布,进而能够有效降低模型鼠脑内菌量,控制 真菌向脑实质区域侵蚀，延长小鼠存活时间，降低AmB肾毒性。考虑到AmB引起的 肾毒性具有剂量依赖性,Angiopep-PEG-PE/AmB聚合物胶束表现出的最大的优势 是，以较低的剂量能够实现同等或更高的治疗效果。因此，该脑靶向聚合物胶束给药系统对AmB的脑内递送具有潜在的临床应用 价值。第II部分小分子修饰的细胞微环境响应的智能型聚合物胶束在前期对传统 聚合物胶束的研究以及通过大量文献查阅与整理的基础上，发现传统的靶向聚合 物胶束的设计思路是：(1)采用传统的两亲性聚合物材料,例如脂质类、PEG-PLG

10、A 或普朗尼克系列等；(2)靶向分子多采用多肽、单抗等，通过受体介导的途径进行 靶向递送。然而，传统的聚合物胶束在实际应用中面临很多问题，例如，其在血液中抗稀 释能力差40-46，易于发生药物泄露，使药物被快速代谢或降解；靶向能力提高 程度非常有限等。针对上述问题，在第二部分的研究中，我们主要提出2个策略： 策略1：开发高效、高亲和力的靶向分子；策略2：聚合物材料本身进行共价交 联，内核形成抗药物泄露的“智能屏障”。首先，为实现策略1，我们设计并合成得到一种小分子化合物，氧化型抗坏血 酸(dehydroascorbic acid, DHA)。DHA是BBB上以及大多数恶性肿瘤细胞表面 高表达的

11、葡萄糖转运体 1 (fac ilitat ive glucose t ranspor ter1,GLUT 1)的底物， 能够特异性识别GLUT1,并通过GLUT1进行转运。本文第三章介绍了 2位炔丙基取代的DHA的合成路线以及对化合物结构的表 征,并在体外BCECs和体内对其脑靶向性进行研究,实验结果证实，合成得到的DHA通过Na+非依赖型的GLUT1向细胞内转运，与文献报道一致,并证实DHA在体 内能够跨越BBB向脑组织蓄积。其次，为实现策略2,本文第四章设计合成得到一 种两亲性三嵌段的聚氨基酸类高分子材料,聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸 (PEG-pLys-pPhe)。其中,PEG链提供亲

12、水端，一方面，可形成聚合物胶束的外壳，延长胶束体内 循环时间;另一方面,PEG的外端可以进行叠氮功能化，与炔丙基化的DHA通过 Click反应进行连接。聚赖氨酸嵌段(pLys),由于其侧链具有活性的伯胺基团，可 以与含有与伯胺反应基团的交联剂发生反应，从而形成环境敏感的交联聚合物胶 束。聚苯丙氨酸嵌段(pPhe),提供疏水内核，用于包载疏水性药物。聚氨基酸类高 分子材料作为一种可生物降解的高分子材料，具有易被机体吸收、代谢、生物相 容性好等特点。我们将策略1与策略2进行结合(如Fig.1T所示)，本文第五章选取DHA作 为脑靶向分子，通过在处方中调整DHA-PEG-pLys-pPhe与PEG-

13、pLys-pPhe的比例， 采用透析法得到不同修饰度的DHA-PLysP聚合物胶束,进一步进行二硫键交联后, 即得到DHA-PLys(s-s)P聚合物胶束。该聚合物胶束内核中形成具有抗药物泄露 的“智能屏障”，它可以有效防止药物在体循环中泄露，然而当进入靶细胞后，在 胞浆高浓度GSH作用下，二硫键屏障消失，药物释放出来发挥作用。实验证实，该聚合物胶束具有高度的结构稳定性，并在体外表现出胞浆内谷 胱甘肽(glu tat hione, GSH)敏感的药物释放特性。体外细胞摄取实验表 明，DHA-PLys(s-s)P在BCECs上的摄取效率远高于未修饰组。体内分布实验结果提示,DHA能够促进聚合物胶

14、束跨越BBB,并进一步被脑实 质细胞摄取。综合上述结果，说明将DHA修饰于聚合物胶束表面后,DHA仍保持着 高效的GLUT1识别和结合能力,而且DHA-PLys(s-s)P可以高效地递送药物跨越 BBB,进入脑实质细胞再释放药物。由于其在体循环中稳定性增加,可以有助于提高药物的递送效率。经过第三、 四、五章的研究，我们成功构建了 DHA修饰的智能型聚合物胶束，其表现出高效的 跨越BBB向脑内蓄积的能力。本文第六章主要采用疏水性抗真菌药物伊曲康唑(it raconazole, ITZ)作为 模型药物，用DHA修饰的聚合物胶束包载ITZ,得到DHA-PLys(s-s)P/ITZ,并对其 体内药动学

15、行为和组织分布进行考察，结果显示,DHA可以存进聚合物胶束入脑； 另外，由于该聚合物胶束在体循环中非常稳定,可以有效降低ITZ被酶代谢成 HO-ITZ,并进一步代谢成没有活性的成分。在二者共同作用下，可有效提高脑内的 药物浓度。在模型鼠上评价DHA-PLys(s-s)P/ITZ聚合物胶束的抗CNS感染的治疗效果， 结果显示,DHA修饰的载ITZ智能型聚合物胶束能够有效治疗CNS感染，并显著延 长感染小鼠的存活时间。据文献报道,肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一, 就是高水平的葡萄糖摄取和糖代谢。研究证实,恶性肿瘤细胞的葡萄糖需求量远高于正常细胞,葡萄糖分子是肿 瘤细胞重要的能量来源。因此,GLUT1成为肿瘤细胞转运和代谢葡萄糖的重要通 路,其在大部分的肿瘤细胞表面过表达。前期实验已经证实,DHA由于能特异性识别BBB上表达的GLUT1,而促进聚合 物胶束向脑内积累。本文第七章研究,我们尝试采用构建的DHA-PLys(s-s)P聚合 物胶束，递送疏水性的抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)用于脑胶质瘤的治疗, 分别在细胞水平和动物水平全面地评价其肿瘤靶向性与抗肿瘤活性。体内外结果证实,DHA修饰的聚合物胶束能够促进PTX在肿瘤边缘甚至肿瘤 中心区域蓄积并进入肿瘤细胞,进而有效诱导脑胶质瘤细胞产生凋亡,并延长荷 瘤小鼠的存活时间。