酶联免疫吸附试验的影响因素

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1、酶 联 免 疫 吸 附 试 验 的影 响 因 素 检 验 科 实 验 过 程 中 的 影 响 因 素终 止 与 读 数结 果 的 判 读试 剂加 样温 育 样 本 洗 板显 色 一 、 标 本 排 泄 物血 清 唾 液 尿 液 、 粪 便分 泌 物体 液 血 清 标 本 脂 血 标 本溶 血 标 本标 本 的 保 存标 本 的 离 心采 血 试 管 采 血 试 管 1.使 用 非 抗 凝 标 本 （ 血 清 ） ； 肝 素 抗 凝 血 浆 会 增 加 OD值 ;EDTA、 酶 抑制 剂 (如 NaN3)可 抑 制 ELISA检 测 系 统 中 辣 根过 氧 化 物 酶 活 性 ; 2.最 好

2、使 用 一 次 性 玻 璃 试 管 或 真 空 采 血 管 . 标 本 采 集 后 ， 应 先 将 标 本 37 放 置 30-60分 钟 后 采 用 3000r /min离 心 15-20分 钟 ， 取 上 清 液 加 样 。标 本 的 离 心 标 本 的 离 心 强 行 离 心 分 离 血 清 ， 会 使 血 清 中 仍 残留 部 分 纤 维 蛋 白 原 ， 在 ELISA测 定 过 程 中 可以 形 成 肉 眼 可 见 的 纤 维 蛋 白 块 或 附 着 在 酶标 板 孔 壁 内 使 酶 标 记 物 不 易 洗 掉 ， 易 造 成假 阳 （ 阴 ） 性 结 果 。 标 本 的 保 存 1

3、. 一 周 - 2 4 保 存 ； 2. 超 过 一 周 - 建 议 -20 保 存 。 3. 冰 冻 血 清 融 解 后 ， 蛋 白 质 会 出 现 局 部 浓 缩 而 分 布 不 均 ， 加 样 前 应 充 分 混 匀 。 标 本 的 保 存 4. 混 浊 或 有 沉 淀 的 血 清 标 本 应 先 离 心 或 过 滤 ， 澄 清 后 再 检 测 。 5. 作 多 次 检 测 ， 宜 少 量 分 装 冰 存 ; 6. 血 清 标 本 宜 在 新 鲜 时 检 测 尽 量 避 免 细 菌 污 染 。 避 免 细 菌 污 染 A.如 有 细 菌 污 染 ， 菌 体 中 可 能 含 有 内 源 性

4、的 HRP会 产 生 假 阳 性 ； B.细 菌 的 生 长 ， 其 所 分 泌 的 一 些 酶 可 能 会对 抗 原 抗 体 等 蛋 白 产 生 分 解 作 用 （ 如 明 胶酶 等 蛋 白 水 解 酶 ） ； C.一 些 细 菌 的 内 源 性 酶 如 大 肠 杆 菌 的 -半 乳 糖 苷 酶 本 身 会 对 用 相 应 酶 作 标 记 的 测定 方 法 产 生 非 特 异 性 干 扰 。 溶 血 标 本 1. ELISA以 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 抗 原 或 抗 体 ； 2. 红 细 胞 破 坏 后 可 释 放 出 大 量 的 具 有 过 氧 化 物 酶 活 性 的 血 红

5、蛋 白 ； 3. 残 留 的 过 氧 化 物 酶 催 化 底 物 产 生 非 特 性 显 色 导 致 结 果 假 阳 性 。 脂 血 标 本 1. 脂 质 小 粒 粘 附 在 反 应 孔 内 壁 ； 2. 非 离 子 型 洗 涤 剂 很 难 洗 掉 反 应 板 上 干 扰 性 物 质 的 非 特 异 性 吸 附 ， 引 起 吸 光 度 A值 升 高 ， 易 造 成 假 阳 性 结 果 。 餐 后 抽 血 、 高 甘 油 三 脂 血 症 患 者 、 标 本 离 心 时 间 、 离心 速 度 不 合 适 等 ， 都 可 使 分 离 的 血 清 标 本 中 残 留 着 大 量 的脂 质 小 粒 。

6、二 、 试 剂1.试 剂 盒 保 存 于 2-82.使 用 前 应 先 将 检 测 试 剂 盒 放 置 室 温 平 衡 15-30 分 钟 ， 保 证 酶 等 液 体 的 初 始 反 应 温 度 及 活 性 剂 的 溶 解 。3.观 察 外 包 装 和 内 组 份 有 无 漏 液 。 三 、 加 样仔 细 注 意 加 样 全 部 过 程移 液 器 的 使 用 及 时 放 入 孵 育 箱标 本 较 多 时 ， 请 分 批 操 作试 剂 的 滴 加 加 样 过 程 应 注 意 ： A. 加 样 不 可 太 快 ； B. 要 避 免 加 在 孔 壁 上 部 ； C. 不 可 溅 出 ； D. 避 免

7、 产 生 气 泡 ； E. 尽 可 能 使 用 同 一 加 样 器 ， 装 紧 枪 头 ， 加 样 后 充 分 混 匀 。 试 剂 的 滴 加 从 滴 瓶 中 滴 加 ， 应 注 意 滴 加 的 角 度 和速 度 。 滴 加 太 快 ， 很 容 易 出 现 重 复 滴 加 或 加在 两 孔 之 间 的 现 象 ， 这 样 就 会 在 孔 内 的 非包 被 区 出 现 非 特 异 吸 附 ， 从 而 引 起 非 特 异显 色 。 移 液 器 的 使 用移 液 的 方 法 及 注 意 事 项枪 头 的 装 配量 程 的 调 节 量 程 的 调 节 1.从 大 体 积 调 为 小 体 积 2.从 小

8、 体 积 调 为 大 体 积 在 该 过 程 中 ， 千 万 不 要 将 按 钮 旋 出 量程 ， 否 则 会 卡 住 内 部 机 械 装 置 而 损 坏 了 移液 枪 枪 头 （ 吸 液 嘴 ） 的 装 配 使 劲 地 在 枪 头 盒 子 上 敲 几 下 错 误 将 移 液 枪 （ 器 ） 垂 直 插 入 枪 头 中 ， 稍 微用 力 左 右 微 微 转 动 即 可 使 其 紧 密 结 合 正 确 枪 头 卡 紧 的 标 志 是 略 为 超 过 O型 环 ， 并 可以 看 到 连 接 部 分 形 成 清 晰 的 密 封 圈 。 移 液 的 方 法 前 进 移 液 法 反 向 移 液 法 一

9、般 用 于 转 移 高 粘 液 体 、 生 物 活 性 液 体 、 易 起 泡 液体 或 极 微 量 的 液 体 ， 其 原 理 就 是 先 吸 入 多 于 设 置 量 程 的 液体 ， 转 移 液 体 的 时 候 不 用 吹 出 残 余 的 液 体 。 重 复 操 作 移 液 法 适 用 于 快 速 、 简 便 地 重 复 转 移 等 量 的 同 种 液 体 。 全 血 移 液 法 移 液 的 注 意 事 项 1.吸 取 液 体 时 ， 移 液 器 保 持 竖 直 状 态 ， 将 枪 头 插 入 液 面 下 1厘 米 。 注 意 吸 液 体 时 ， 一 定 要 缓 慢 平 稳 的 松开 拇

10、指 ， 绝 不 允 许 突 然 松 开 ， 以 防 将 溶 液吸 入 过 快 而 冲 入 移 液 器 内 腐 蚀 柱 塞 而 造 成漏 气 。 移 液 的 注 意 事 项 2.设 定 加 样 体 积 ， 不 能 大 于 加 样 枪 标 定 的 移 液 范 围 3.加 样 吸 嘴 的 洁 净 和 装 配 4.吸 取 液 体 和 排 出 液 体 动 作 都 一 定 要 慢 。 移 液 的 注 意 事 项 5.加 样 枪 严 禁 吸 取 有 强 挥 发 性 、 强 腐 蚀 性 的 液 体 （ 如 浓 酸 、 浓 碱 、 有 机 物 等 ） 6.不 要 用 大 量 程 的 加 样 枪 移 取 小 体

11、积 的 液 体 ， 以 免 影 响 准 确 度 。 移 液 的 注 意 事 项 7.如 不 使 用 ， 要 把 移 液 枪 的 量 程 调 至 最大 值 的 刻 度 ， 使 弹 簧 处 于 松 弛 状 态 以 保护 弹 簧 ， 并 将 其 竖 直 挂 在 移 液 枪 架 上 。 8.表 面 清 洁 ： 用 10%的 次 氯 酸 钠 溶 液 或70%的 酒 精 溶 液 清 洁 后 ， 自 然 晾 干 。 9.微 量 加 样 枪 必 须 按 要 求 定 期 进 行 校 准 。 四 、 温 育 1. 抗 原 抗 体 反 应 必 须 在 一 定 的 温 度 条 件 下 反 应 一 定 的 时 间 。2

12、. 温 育 所 需 时 间 与 温 度 成 反 比 。3. 最 为 常 用 的 温 育 温 度 有 37 和 室 温 ， 其 次 是 43 和 2 8 。 实 际 操 作 中 应 注 意 ： 温 育 温 度 的 选 择足 够 的 反 应 时 间“ 边 缘 效 应 ” 的 排 除 温 育 温 度 的 选 择 1.微 孔 板 从 室 温 拿 至 水 浴 箱 或 温 箱 中 时 ， 孔 内 温 度 从 室 温 升 至 37 ， 需 要 一 定 的 时 间 ； 2.在 临 床 实 验 室 中 ， 通 常 是 将 微 孔 板 一 放 入 温 箱 即 开 始 计 时 ， 这 样 就 很 容 易 造 成 实

13、 际 测 定 中 温 育 时 间 不 够 ， 弱 阳 性 样 本 测 不 出 来 的 问 题 。 “ 边 缘 效 应 ” 的 排 除1.“ 边 缘 效 应 ” ， 即 外 周 孔 显 色 较 中 心 孔 深 ;2.有 研 究 证 实 在 温 育 中 的 热 力 学 梯 度 可 能 是 根 本 原 因 。3.聚 苯 乙 烯 本 身 为 不 良 热 导 体 ， 板 从 室 （ 通 常 在 25 左 右 ） 置 于 37 温 箱 ， 板 升 温 时 ， 在 外 周 孔 与 中 心 孔 之 间 可 能 存 在 一 热 力 学 梯 度 。 总 而 言 之 ， 在 临 床 ELISA测 定 中 ， 要保

14、证 好 的 测 定 效 果 ， 应 尽 量 采 用 水 浴 。 温 育 中 让 微 孔 板 浮 于 水 面 上 （ 浸 入1/3） ， 或 将 浸 透 水 的 沙 布 放 入 一 大 饭 盒中 形 成 湿 盒 ， 然 后 放 于 温 箱 中 ， 这 样 可 使微 孔 板 板 孔 底 部 直 接 与 37 水 或 湿 布 接 触 ，而 且 水 浴 箱 或 湿 盒 内 温 度 较 高 ， 可 使 反 应溶 液 的 温 度 迅 速 与 温 室 平 衡 。 五 、 洗 板 血 清 中 残 留 的 纤 维 蛋 白 丝 或 洗 涤 液析 出 的 结 晶 易 使 洗 板 机 针 孔 全 阻 塞 或 半阻 塞

15、 ， 造 成 未 结 合 标 记 酶 洗 脱 不 彻 底 ，导 致 “ 花 板 ” 造 成 假 阳 性 或 假 阴 性 。 洗 板 的 注 意 事 项1. 要 有 适 当 的 浸 泡 时 间 （ 30-60秒 ） 。2. 洗 板 机 吸 液 要 彻 底 ， 残 余 量 低 于 5ul。3. 洗 液 应 调 至 适 当 的 注 出 量 ， 每 孔 应 在 350ul-450ul之 间 ， 但 不 要 溢 出 孔 外 。 4.洗 板 次 数 应 与 说 明 书 要 求 一 致 ， 尽 量 不 要 私 自 增 加 或 减 少 洗 板 次 数 。5.稀 释 洗 液 应 使 用 蒸 馏 水 或 去 离

16、子 水 ， pH 值 不 宜 过 酸 或 过 碱 ， 保 证 配 出 的 洗 液 pH 值 为 7.4 0.2， 水 质 宜 新 鲜 ， 长 菌 或 有 沉 淀 不 宜 使 用 ， 且 用 非 金 属 容 器 保 存 。 6. 由 于 洗 涤 液 系 高 浓 度 磷 酸 盐 ， 会 形 成 结 晶 ， 配 制 洗 液 时 应 完 全 溶 解 。7. 稀 释 好 的 洗 液 4 下 可 保 存 3 5天 。8. 洗 板 后 ， 拍 干 包 被 板 ， 应 垂 直 扣 在 备 好 的 干 净 吸 水 纸 或 毛 巾 上 ， 且 每 次 拍 板 应 换 掉 前 次 拍 过 的 毛 巾 或 吸 水 纸

17、 ， 避 免 交 叉 污 染 。 9. 操 作 洗 板 机 过 程 中 要 不 时 观 察 洗 板 机 针 孔 内 洗 液 的 通 畅 状 况 ， 及 时 纠 正 ， 洗 板 机 不 用 时 应 用 去 离 子 水 清 洗 几 遍 后 关 机 。10.每 周 要 进 行 保 养 清 洗 。 六 、 显 色 注 意 事 项 ：1. 检 查 底 物 溶 液 的 有 效 性 ；2. 试 剂 显 色 时 先 加 A液 ， 后 加 B液 ， 二 者 不 要 颠 倒 。3. 前 后 加 入 的 间 隔 时 间 不 超 过 10分 钟 。 4. 若 把 A液 和 B液 先 混 合 ， 再 加 样 显 色 ，

18、 需 要 求 二 者 等 体 积 混 合 。5. A、 B液 应 避 免 接 触 污 染 物 。6. 不 同 厂 家 显 色 液 不 得 混 用 。 七 、 终 止 和 读 数 肉 眼 判 断 结 果 时 ， 显 色 浅 不 易 观 察 ，影 响 结 果 的 准 确 性 ， 必 须 使 用 酶 标 仪 检 测结 果 ， 以 保 证 结 果 一 致 性 。 注 意 事 项1、 酶 标 仪 的 波 长 是 否 合 适 或 滤 光 片 是 否 正 确 。2、 单 波 长 或 双 波 长 比 色 选 择 的 问 题 。 ELISA测 定 比 色 时 ， 最 好 是 使 用 双 波 长 比 色 3、 加

19、 完 终 止 液 后 30分 钟 内 读 取 数 据 。4、 保 证 酶 标 板 的 底 部 是 清 洁 干 燥 的 。 双 波 长 比 色 ？ 双 波 长 比 色 测 定 能 排 除 由 微 滴 板 本 身 、 板孔 内 标 本 的 非 特 异 吸 收 、 指 纹 、 刮 痕 、 灰 尘 等对 特 异 显 色 测 定 吸 光 度 的 影 响 ， 一 般 不 必 设 空白 孔 。 ELISA测 定 中 单 个 空 白 孔 的 非 特 异 吸 收 上有 一 定 程 度 的 不 确 定 性 ；在 ELISA测 定 比 色 时 ， 最 好 是 使 用 双 波 长 比 色 。 八 、 结 果 的 判

20、读灰 区 的 定 义 灰 区 又 称 灰 色 带 反 应 。 就 是 把 OD值在 Cut off值 正 负 20%这 个 范 围 内 的 标 本称 为 灰 区 标 本 。 这 个 范 围 称 为 灰 区 。 灰 区 的 处 理1.灰 区 是 客 观 存 在 的 ， 没 有 不 存 在 灰 区 的 试 剂 ， 我 们 只 是 尽 量 减 少 灰 区 的 出 现 比 例 。2.减 少 灰 区 最 有 效 的 方 法 就 是 尽 量 将 板 洗 涤 干 净 。3.严 格 控 制 温 育 时 间 。 其 他 的 影 响 1. 干 扰 物 质 的 影 响 常 见 的 干 扰 物 质 如 类 风 湿 因

21、 子 、 甲 胎 蛋 白 、 某 些 自 身 抗 体 等 ， 都 会 使 结 果 造 成 假 阳 性 。2. 药 物 的 影 响 如 高 效 价 的 乙 肝 免 疫 球 蛋 白 等 。 思 考 题 为 什 么 多 次 实 验 重 复 性 差 （ 相 同 样 本 两 次 测 定 结 果 不 一 致 ） ？ 多 次 实 验 重 复 性 差 （ 相 同 样 本 两 次 测 定 结 果 不 一 致 ） A. 血 清 标 本 未 完 全 凝 固 即 加 入 ； B. 不 同 批 号 试 剂 盒 中 组 分 混 用 ； C. 加 样 ； D. 温 育 时 间 、 洗 板 、 显 色 时 间 不 一 致 ； E. 孔 内 有 污 染 物 ； F. 显 色 液 滴 加 出 现 问 题 ； G. 酶 标 仪 滤 光 片 错 误 ,测 量 波 长 不 一 致 .