实验六抗体效价的Elisa测定
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1、实验二 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.目 的 要 求(1)学 习 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 的 基 本 原 理 。 (2)掌 握 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 技 术 , 抗 体 的 效 价 测 定 及酶 联 免 疫 测 定 仪 的 使 用 。 2.基 本 原 理免 疫 酶 技 术 :酶 标 Ab/Ag,酶 结 合 物 的 酶 在 免 疫 反 应 后 ,作 用 于 厎 物 后 显 色 , 根 据 颜 色 的 有 无 和 深 浅 , 定 量 测 定Ab/Ag。免 疫 反 应 : 一 次 或 数 次 具 Ag,Ab特 异 的 免 疫 学 反 应酶 促 反 应 : 只 进 行 一 次 显
2、 示 出 生 物 放 大 作 用 , 灵 敏 度 ng,pg 60年 代 初 期 , Averam eas & Ram 等建 立 了 免 疫 酶 技 术 (immunoenzymatic techniques) 利 用 特 殊 的 交 联 剂 研 制 出 辣 根 过 氧 化 物 酶 -人 血 清 白蛋 白 及 酸 性 磷 酸 酯 酶 -抗 体 , 统 称 为 酶 标 记 物 或 酶 结合 物 , 用 于 抗 原 或 抗 体 的 示 踪 、 定 位 或 定 量 测 定 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (enzyme-linked immunosorbent assay简 称 为 Elisa)-是
3、 在 免 疫 酶 技 术 (immunoenzymatic techniques)的 基 础 上 发 展 起 来 的 一 种 新 型 的 免 疫 测 定 技术 。 本 法 兼 有 灵 敏 度 高 和 特 异 性 强 两 方 面 的 优 点 。 1974年 Voller等用 聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 作 为 免 疫 吸 附 剂 吸 附 抗 体 (抗原 ), 再 与 相 应 的 酶 标 记 物 结 合操 作 更 方 便 , 易 重 复灵 敏 度 可 高 达 ng( 10-9g) 至 pg(10-12g), (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 免 疫 标
4、 记 技 术 应 用 各 种 液 相 和 固 相 免 疫分 析 方 法 , 对 体 液 中 的 半抗 原 、 抗 原 或 抗 体 进 行 定性 和 定 量 测 定标 记 抗 体 或 抗 原 荧 光 素 、 放 射 性 同 位 素 、 酶 、铁 蛋 白 、 胶 体 金 及 化 学 (或 生 物 )发 光 剂镜 检 观 察 或 进 行 自动 化 测 定 荧 光 显 微 镜 , 射 线 测 量 仪 , 酶 标检 测 仪 , 电 子 显 微 镜 和 发 光 免 疫测 定 仪 等直 接 在 细 胞 、 亚 细 胞 、超 微 结 构 及 分 子 水 平 上 ,对 抗 原 抗 体 反 应 进 行 定性 和
5、定 位 研 究 酶 -性 能 稳 定 、 经 济 易 得 、 底 物 无 色 、 产 物 显 色 ,便 于 检 测常 用 的 酶 :碱 性 磷 酸 酯 酶 、 辣 根 过 氧 化 物 酶 (horserad peroxidase简 称 HRP)、 葡 萄 糖 氧 化 酶 、 半 乳 糖 苷 酶 等 。酶 标 技 术 戊 二 醛 法 , 过 碘 酸 氧 化 法将 酶 与 Ab交 联 在 一 起Ag-Ab-抗 Ab-HRP TMB+H2O2产 物 ( 黄 色 , OD450)+H2O 图 一 直 接 型 Elisa 图 二 间 接 型 Elisa 图 三 双 抗 体 夹 心 型 ELISA 图 四
6、 固 相 抗 体 竞 争 型 ELISA未 知 抗 原 量 =A( 1) -A( 2) 每 次 反 应 后 都 要 反 复 洗 涤 ?1. 保 证 反 应 的 定 量 反 应2. 防 止 重 叠 反 应 , 引 起 非 特 异 现 象 。 Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain an
7、tibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody. HIV (human immuno
8、deficiency virus) detection positive negative Positive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Protein protein interaction-ELISA1. Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait prote
9、in - 2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein 4. 操 作 方 法4.1 包 被 特 异 性 抗 原 :固 体 抗 原 (如 蛋 白 质 )用 包 被 液 稀 释 至 10O g/ml,每 凹 孔 加 100 L, 加 盖 置 4 过 夜 (37 2h)【 已 完 成 】 次 日 倾 去 凹 孔 内 液 体 , 用 滴 管 取 洗 涤 液 在 每 孔 中 加 满 稀 释
10、 /洗 涤液 洗 涤 3次 , 首 次 洗 涤 静 置 2min后 倾 去 , 后 两 次 静 置 1min。 将 反 应 板 扣放 在 滤 纸 上 , 以 除 净 液 体 。4.2 封 闭 : 每 孔 中 加 满 封 闭 液 ( 约 300ul多 ) , 加 盖 或 用 封 口 膜 封 板 ,置 37 恒 温 箱 60min, 倾 去 孔 内 液 体 , 按 上 法 洗 涤 3次 。 4.3 加 待 测 血 清 (内 含 抗 体 )、 阴 性 血清 (无 抗 体 )及 稀 释 液 (PBS/Tween):待 测 血 清 按 倍 比 法 用 稀 释 液 稀 释(1:100、 1:200等 ),
11、 阴 性 血 清 也 稀 释成 1:100, 取 不 同 稀 释 度 的 待 测 血 清 ,阴 性 血 清 及 稀 释 液 (PBS/Tween)各1OO L加 至 相 应 的 凹 孔 中 , 加 盖 或 封板 , 置 37 恒 温 箱 1h, 使 抗 体 与 固 相抗 原 进 行 特 异 性 结 合 , 反 复 洗 涤 3次 。 12345678 PBS/Tween1:100阴 性 血 清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000 阳 性 血 清 4.4 加 酶 标 抗 体 :加 入 HRP-抗 体 (抗 抗 体 , 本 实 验 中 已
12、经 根 据 说 明 书稀 释 一 千 倍 ), 每 孔 加 l00 L, 封 板 后 置 37 温 育 lh, 按 上 法 至少 洗 涤 5次 , 最 后 用 蒸 馏 水 洗 涤 2次 , 扣 在 滤 纸 上 吸 干 水 分 。4.5 显 色 : 首 先 按 每 10mLOPD应 用 液 加 入 0.15mLH2O2处 理 。 每 孔 加 入OPD应 用 液 1OOuL、 反 应 板 置 室 温 暗 处 5 30min。 当 显 示 明 显 黄色 时 应 及 时 终 止 反 应 。4.6 终 止 反 应 :每 孔 加 入 10O L 2mol/L H2SO4。 由 黄 色 变 为 橙 色 。稳
13、 定 3 5min即 可 比 色 测 定 。 4.7 检 测 : 用 酶 联 免 疫 测 定 仪 , 以 PBS/Tween孔 为 对 照 、 测 波 长 为49Onm时 各 孔 光 吸 收 ( A) 。1. 计 算 阳 性 血 清 与 阴 性 血 清 A值 之 比 (Positive/negative, P/N),当 P/N 2.1时 为 阳 性 , P/N2.1而 1.5为 可 疑 , P/N1.5为 阴性 。 用 目 测 法 则 以 较 阴 性 对 照 深 色 的 最 高 稀 释 度 作 为 抗 体 效 价 。2. 用 “ ” “ ” 表 示 , 超 过 规 定 吸 收 值 ( 0.2
14、0.4) 的 标 本 均属 阳 性 。 注 意 事 项 (1)聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 应 选 择 高 质 量 、 非 特 异 性 吸 附 小 的 产 品 。 包被 物 应 具 有 较 高 的 纯 度 , 其 浓 度 一 般 在 1 100 g之 间 , 在 偏 碱 条 件 下 易 吸附 于 反 应 板 的 凹 孔 中 , 4 放 置 过 夜 较 理 想 , 若 暂 时 不 用 , 可 加 入 终 浓 度 为0.02% NaN3, 4 贮 存 , 也 可 倾 去 包 被 液 , 干 燥 后 置 硅 胶 干 燥 器 中 , 室 温 存放 3个 月 以 上 不 影 响 测 定 效 果 。
15、 (2)反 应 各 步 均 应 充 分 洗 涤 , 以 除 去 残 留 物 , 减 少 非 特 异 性 吸 附 。 为 使结 果 重 复 应 固 定 洗 涤 次 数 及 放 置 时 间 , 切 忌 相 互 污 染 。 (3)为 使 显 色 反 应 便 于 比 较 , 显 色 后 置 室 温 暗 处 的 时 间 应 一 致 , 终 止 反应 3 5min后 应 立 即 比 色 。 必 要 时 可 设 阳 性 对 照 , 以 固 定 显 色 及 终 止 时 间 。 (4)待 测 抗 体 或 抗 原 与 酶 标 抗 体 应 具 有 相 同 的 免 疫 特 异 性 , 否 则 无 法 结合 。 自 动
16、 酶 标 仪 ( Elx800UV) 使 用 程 序1 开 机 , 进 行 System self-test2 按 “ DEFINE” 键 , 进 入 “ SELECT ASSAY NUMBER” , 用“ NUMERIC” 或 “ OPTION” 键 输 入 测 试 号 ( 注 : assay 01 为 quick read, 最 大 测 试 号 为 55) ; 按 “ ENTER” 键 修 改测 试 的 “ NAME” ; 再 按 “ ENTER” 键 进 入 下 列 菜 单 :按 “ METHOD” 键 选 择 测 试 的 波 长 类 型 ( Single或 Dual) 、波 长 大 小
17、 (340、 405、 450、 490或 630nm)、 微 孔 板 类 型 (96孔 、 48孔 或 24孔 )。按 “ MAP” 键 选 择 阅 读 方 式 (Auto或 Manual) 、 阅 读 方 向( Down或 Across) 、 重 复 方 向 ( Down或 Across) 、 阅 读 起始 位 置 ( 输 入 编 号 ) 、 空 白 Map( Air、 Full、 Const、Column、 P-Down、 P-Across) 。 3 按 “ READ” 键 , 酶 标 板 推 进 入 仪 器 , 开 始 读 数 并计 数 , 打 印 机 输 出 数 据 。 4 按 “ MAIN MENU” 键 回 到 主 菜 单 , 关 闭 电 源 。 酶 标 板 的 清 洗 : 采 用 ELx50TM型 微 孔 板 洗 板 机 , 注射 泵 驱 动 的 液 体 输 送 , 条 状 单 排 清 洗 或 全 板 清 洗 免 疫 检 测 灵 敏 度 辣 根 过 氧 化 物 酶 : 10 20pg 碱 性 磷 酸 酶 : 10 50pg 免 疫 金 : 1 25pg 125I: 50 100pg放 射 自 显 影 术 : 将 含 放 射 性 同 位 素 置 X感 光 胶 片 上感 光 , 随 后 经 显 影 , 定 影 , 即 可 呈 现 出 斑 点 或 谱 带
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