实验二血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定by陈蔚

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1、实 验 二 血 清 球 蛋 白 的 分离 纯 化 与 鉴 定 层 析 技 术实 验 原 理实 验 思 路实 验 流 程 及 操 作 注 意 事 项 层 析 技 术1 层 析 法 ： 又 称 色 谱 法， 是 一 种 广 泛 运 用 的 物 质分 离 纯 化 、 分 析 鉴 定 技 术. 2. 依 据 ： 混 合 物 中 各 组分 的 理 化 性 质 差 异 吸 附力 、 分 子 形 状 、 大 小 、 酸碱 性 或 分 子 极 性 、 分 子 亲和 力 以 及 分 配 系 数 。 固 定 相 固 定 不 动流 动 相 对 固 定 相 作 单 向 相 对 运 动 ，推 动 样 品 中 各 组 分

2、 通 过 固 定 相 向 前 移动 。 各 组 分 理 化 性 质 不 同 ， 对 流 动 相和 固 定 相 具 有 不 同 的 作 用 力 ， 因 此 在流 动 相 推 动 样 品 通 过 固 定 相 的 过 程 中， 通 过 不 断 地 吸 附 、 解 吸 、 吸 附 、 解吸 作 用 ， 造 成 混 合 物 中 各 组 分 在 固 定相 中 的 迁 移 距 离 不 等 ， 达 到 分 离 。3 基 本 原 理 ： 固 定 相 和 流 动 相 4 分 类 ： 流 动 相 的 物 理 状 态 ： 气 相 和 液 相 气 液 /固 ， 液 固 /液 方 式 ： 纸 、 薄 层 、 柱 原 理

3、： 吸 附 、 分 配 、 凝 胶 、 离 子 交换 、 亲 和 、 金 属 螯 合 、 疏 水 、 反 相 5 凝 胶 层 析(凝 胶 过 滤 、 凝 胶 色 谱 、 分子 筛 层 析 、 分 子 排 阻 层 析 ) 定 义 ： 指 混 合 物 随 流 动 相流 经 固 定 相 的 层 析 柱 时 ， 混合 物 中 各 组 分 按 其 分 子 大 小不 同 而 被 分 离 的 技 术 。 基 本 原 理 ：固 定 相 ： 凝 胶 ， 惰 性 三 维 空 间 多 孔网 状 结 构 ， 故 称 分 子 筛 ， 包 括 琼 脂糖 、 交 联 葡 聚 糖 、 聚 丙 烯 酰 胺 、 琼脂 糖 -葡

4、聚 糖 复 合 凝 胶 。流 动 相 ： 洗 脱 液 交 联 葡 聚 糖 凝 胶多 聚 葡 萄 糖 与 环 氧 丙 烷 交 联 而 成 ， 网 状 结 构珠 状 颗 粒 ， 商 品 名 为 Sephadex G系 列G 交 联 度 ： G后 面 的 阿 拉 伯 数 字 表 示 不 同 的规 格 型 号 ， 有 G-10， G-15， G-25， G-50， G-75， G-100， G-150， 和 G-200八 种 ， 具 体 含 义为 凝 胶 得 水 值 的 10倍 或 吸 水 量 （ g） /10g干 胶交 联 度 与 孔 径 大 小 成 反 比 ： 交 联 度 越 大 ， 孔径 越 小

5、 ， 吸 水 性 小 ； 交 联 度 越 小 ， 孔 径 越 大， 吸 水 性 大 。 因 此 ， “ G” 反 映 凝 胶 的 交 联 程度 ， 膨 胀 程 度 及 分 部 范 围 。 长 链 状 葡 聚 糖 分 子 间 以 环 氧 丙 烷 连 接 凝 胶 层 析 的 基 本 原 理样 品 加 于 柱 上 ， 样 品 随 洗 脱 液 的 流动 而 向 下 移 动 ， 同 时 作 垂 直 向 下 运动 和 不 定 向 扩 散 运 动 小 分 子 可 进入 凝 胶 空 内 部 ， 流 程 长 ， 速 度 慢 ，后 流 出 ； 大 分 子 不 能 进 入 凝 胶 空 内部 ， 颗 粒 间 移 动

6、， 流 程 短 ， 先 流 出大 小 分 子 彼 此 分 开 l 分 子 大 小 不 同 混 合 物 上 柱 ； 2 洗 脱 开 始 ， 小 分 子扩 散 进 人 凝 胶 颗 粒 内 ， 大 分 子 被 排 阻 于 颗 粒 之 外； 3 大 小 分 子 分 开 ： 4大 分 子 行 程 较 短 ， 已 洗 脱 出层 析 柱 ， 小 分 子 尚 在 进 行 中 数 学 模 型 Vo Vi VtVi 凝 胶 孔 内 水 （ 内 水 ）Vo 颗 粒 间 水 （ 外 水 ）Vg 凝 胶 体 积总 体 积 Vt= Vi +Vo+Vg Kd 分 配 系 数 ： 精 确 衡 量 混 合 物中 某 一 待 分

7、 离 成 分 在 凝 胶 柱 内 的 洗脱 行 为 ， 反 映 物 质 分 子 进 入 凝 胶 颗粒 的 程 度 ， 是 溶 质 分 子 大 小 的 一 个函 数Ve 洗 脱 体 积 ： 分 离 物 被 洗 脱 时所 用 的 洗 脱 液 体 积 Ve=Vo+Kd Vi 洗 脱 曲 线 ： 以 洗 脱 体 积 为 横 坐 标， 各 物 质 浓 度 /吸 光 度 为 纵 坐 标 作图 （ 1） 完 全 被 排 阻 的 极 端 大 分 子 ， Ve=Vo， Kd=0（ 2） 中 等 分 子 ， Ve=Vo+Kd Vi， 0Kd1 影 响 因 素*层 析 柱 的 选 择 及 装 填 ：柱 大 小 分

8、离 样 品 量凝 胶 型 号 分 辨 率 ： 各 种 分 子 筛 的孔 隙 大 小 分 布 有 一 定 范 围 ， 有 最 大极 限 和 最 小 极 限 。 凝 胶 分 离 范 围 之外 的 分 子 ， 难 以 分 离 。 如 大 小 不 同的 两 种 全 排 阻 分 子 /完 全 渗 透 分 子 。*洗 脱 液 ： 溶 解 待 分 离 物 质 ， 不 变 性*加 样 量 ： 1% 5%*凝 胶 的 再 生 凝 胶 型 号 颗 粒 大 小 （ m) 溶 胀 体 积 (ml/g) 分 离 范 围 （ Mr）G-10 40 120 2 3 7 102G-15 50 150 2.5 3.5 1.5

9、103G-25 50 150 4 6 1 103 5 103G-50 40 120 9 11 1.5 103 3 104G-75 40 120 12 15 3 103 8 104G-100 40 120 15 20 4 10 3 1 105 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 层 析 介 质 的 有 关 技 术 参 数 实 验 原 理透 析 及 超 滤 法盐 析 、 有 机 溶 剂 /免 疫 沉 淀电 泳凝 胶 层 析离 子 交 换 层 析超 离 心 共 性 ：*生 命 高 分 子 ： 透 析 、 超 滤 、 超 离 心 、 凝 胶层 析*蛋 白 质 溶 液 是 亲 水 胶 体 ： 稳 定 因 素 为

10、 水 化膜 和 电 荷 盐 析 /有 机 溶 剂 沉 淀*两 性 电 解 质 和 等 电 点 ： pH pI， 蛋 白 质 带负 电 ； 反 之 带 正 电 电 泳 、 离 子 交 换 层 析 *有 一 定 的 功 能 ： 抗 原 性 免 疫 沉 淀 个 性 ： 蛋 白 质 的 分 子 量 、 等 电 点 、 亲 水 程 度、 形 状 不 同分 离 依 据 ： 蛋 白 质 理 化 性 质 的 共 性 和 个 性 清 蛋 白 pI=4.9 57% 72% 1 2% 5% 2 pI6 4% 9% 6.5% 12% pI=7.3 2% 20%球 蛋 白 实 验 思 路两 步 盐 析 去 除 杂 蛋

11、白凝 胶 层 析 脱 盐交 联 葡 聚 糖 吸 水 浓 缩醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 鉴 定 上午完成下 午完 成先粗后细 分 段 盐 析 ：常 用 中 性 盐 ： 硫 酸 铵 、 硫 酸 镁 、 硫 酸 钠 、 氯 化 钠、 磷 酸 钠 等 。 硫 酸 铵 ： 温 度 系 数 小 ， 溶 解 度 大 ， 蛋 白 谱 广 ， 分段 盐 析 效 果 好 ， 不 易 引 起 变 性 。 溶 液 pH约 4.55.5， 可 用 硫 酸 /氨 水 按 需 要 调 节 pH值 。分 段 盐 析 ： 各 种 蛋 白 大 小 、 亲 水 程 度 、 pI不 同 ，所 需 的 盐 浓 度 、 pH也

12、不 一 样 。 如 清 蛋 白 分 子 小 ，亲 水 性 强 ， 需 高 盐 浓 度 才 沉 淀 ， 球 蛋 白 分 子 大 ，亲 水 性 弱 ， 较 低 盐 浓 度 即 可 沉 淀 。 因 此 调 节 盐 浓度 及 pH可 使 各 种 蛋 白 质 分 段 沉 淀 。实 验 流 程 及 操 作 注 意 事 项 影 响 因 素 ： 温 度 ： 温 度 与 溶 解 度 成 正 比 。 一 般 室温 即 可 ,少 数 温 度 敏 感 型 蛋 白 质 需 4度 操作 ， 而 血 红 蛋 白 、 肌 红 蛋 白 、 清 蛋 白 在25度 比 0度 时 溶 解 度 低 ， 更 易 盐 析 。 pH值 ：

13、大 多 数 蛋 白 质 在 pI时 溶 解 度 最低 。 pH=pI效 果 更 好 。 蛋 白 质 浓 度 ： 浓 度 高 时 产 生 共 沉 。 盐析 前 血 清 加 等 量 生 理 盐 水 稀 释 ， 控 制 蛋白 质 含 量 在 2.5-3.0%。 凝 胶 层 析 脱 盐 ： 常 用 透 析 ， 需 时 较 长， 最 好 低 温 。 也 可 用 葡 萄 糖 凝 胶 G-25/50过 柱 ， 用 时 较 短 。固 定 相 ： sephadex G-25流 动 相 ： pH7.4的 0.01M磷 酸 盐 缓 冲 液 （0.9%NaCl）原 理 同 前 ， 蛋 白 质 大 分 子 ， 硫 酸

14、铵 小 分子 。 浓 缩 ： sephadex G-25吸 水 ， 利用 高 分 子 性 质 。 注 意 事 项 ：1 硫 酸 铵 的 滴 加 ， 边 摇 边 逐 滴 加 入2 流 洗 柱 子 ： 3 4个 柱 长3 上 样 ： 转 圈 滴 加 ， 起 跑 线 一 致4 防 止 柱 上 液 层 干 涸5 洗 脱 液 收 集 无 需 分 部 ， 用 载 玻 片 检测 蛋 白 ， 无 纳 氏 试 剂6 G-25干 胶 用 纸 条 少 量 多 次 加 入 ， 液层 高 PI PH=PI PHPI电 泳 用 于 分 离 物 质 的 原 理 ： 蛋 白 质 为 两 性 电 解 质 ， 有 一 定 的 等

15、 电点 ， 在 大 于 其 等 电 点 的 溶 液 中 带 负 电， 在 电 场 中 向 阳 极 移 动 ， 由 于 各 种 蛋白 质 的 分 子 大 小 与 结 构 不 同 ， 所 带 表面 电 荷 的 多 少 不 同 ， 因 而 在 电 场 中 向阳 极 移 动 的 速 度 不 同 。 经 过 一 定 的 电泳 时 间 后 可 形 成 许 多 蛋 白 质 区 带 ， 每一 个 区 带 代 表 一 组 迁 移 率 相 近 似 的 蛋白 质 。 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳介 质 ： 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 ， 纤 维 素 的羟 基 经 乙 酰 化 所 形 成 的 纤 维 素 醋 酸

16、酯 。 溶 于 有 机 溶 剂 后 涂 成 薄 膜 ， 具均 一 的 泡 沫 状 结 构 ， 有 强 渗 透 性 。 电 泳 缓 冲 液 ： pH8.6的 巴 比 妥 缓 冲液 清 蛋 白 pI=4.9 57% 72% 1 2% 5% 2 pI6 4% 9% 6.5% 12% pI=7.3 2% 20%球 蛋 白 清 蛋 白 1 2 清 蛋 白 （ albumin， A） ： 38 48g/L球 蛋 白 （ globulin， G） ： 15 30g/LA/G： 正 常 值 1.5 2.5 清 蛋 白12 加 样 线加 样 线 纯 化 蛋 白对 照 样 品 【 操 作 步 骤 】1 点 样 ：

17、 取 经 巴 比 妥 缓 冲 液 浸 透 的 2 8cm薄 膜 ， 滤纸 吸 去 表 面 多 余 水 分 ， 在 无 光 泽 面 距 一 端 2cm处 用 铅笔 划 一 加 样 线 ， 写 上 编 号 。 小 滤 纸 片 蘸 取 血 清 /样 品， 垂 直 压 在 加 样 线 上 ， 待 样 品 渗 入 薄 膜 ， 无 光 泽 面 向下 平 贴 在 电 泳 槽 支 架 的 盐 桥 上 ， 静 置 5 10分 钟 平 衡。 点 样 端 置 阴 极 ， 盖 上 盖 子 。2 通 电 ： 接 通 电 源 ， 调 节 电 压 为 40 50V， 通 电 2 2.5h， 关 闭 电 源 ， 停 止 电 泳 。3 染 色 ： 薄 膜 浸 入 氨 基 黑 B染 色 液 2 5分 钟 。4 漂 洗 ： 取 出 薄 膜 在 漂 洗 液 中 漂 洗 4 5次 ， 至 无 蛋白 区 完 全 脱 色 为 止 。 取 出 ， 用 滤 纸 吸 干 液 体 。 观 察 。 5） 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 在 临 床 上 的 应 用 实 验 二 血 清 球 蛋 白 的 分离 纯 化 与 鉴 定 实 验 二 血 清 球 蛋 白 的 分离 纯 化 与 鉴 定