多重不对称扩增介绍

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1、多 重 不 对 称 PCR 黄桃生（生物芯片组） 多重不对称PCR多 重 PCR(Multiplex PCR)不 对 称 PCR（ Asymmetric PCR）获 得 大 量 不 同 片 段 的 单 链 DNA（ SSDNA） 多重PCR 又 称 多 重 引 物 PCR或 复 合PCR， 它 是 在 同 一 PCR反应 体 系 里 加 上 二 对 以 上 引物 ， 同 时 扩 增 出 多 个 核 酸片 段 的 PCR反 应 ， 其 反 应原 理 ， 反 应 试 剂 和 操 作 过程 与 一 般 PCR相 同 . 1、 扩 增 单 一 基 因 中 多 个 片段 （ 华 法 林 检 测 ） 2、

2、 扩 增 不 同 基 因 中 多 个 片段 （ HPV分 型 ） 多重PCR技术优点高 效 性 ： 在 同 一 PCR反 应 管 内 同 时 检 出 多 种 病原 微 生 物 ， 或 对 有 多 个 型 别 的 目 的 基 因 进 行 分型 ， 特 别 是 用 一 滴 血 就 可 检 测 多 种 病 原 体 。系 统 性 ： 多 重 PCR很 适 宜 于 成 组 病 原 体 的 检 测 ，如 肝 炎 病 毒 ， 肠 道 致 病 性 细 菌 ， 性 病 ， 无 芽 胞厌 氧 菌 等 同 时 检 测 。经 济 简 便 性 ： 多 种 病 原 体 在 同 一 反 应 管 内 同 时检 出 ， 将 大

3、 大 的 节 省 时 间 ， 节 省 试 剂 ， 节 约 经费 开 支 ， 为 临 床 提 供 更 多 更 准 确 的 诊 断 信 息 。 多重PCR技术难点反 应 原 理 ， 反 应 试 剂 和 操 作 过 程 与 一 般 PCR相同 .难 点 主 要 体 现 在 前 期 引 物 设 计 过 程 中 反 应体 系 的 平 衡 反应体系不平衡 反 应 体 系 的 不 平 衡 导 致 在 前 期 的 几 轮 反 应 中 某 些 优 势 引 物 及 其模 板 迅 速 扩 增 ， 获 得 大 量 的 扩 增 产 物 ， 而 这 些 扩 增 产 物 同 时 又是 DNA聚 合 酶 的 良 好 抑 制

4、剂 （ SantaLucia, 2007） 。 所 以 ， 随 着扩 增 产 物 的 大 量 出 现 ， 聚 合 酶 的 聚 合 能 力 被 越 来 越 强 烈 的 抑 制住 了 ， 因 此 ， 前 期 处 于 劣 势 的 引 物 及 其 模 板 ， 这 时 就 更 加 举 步维 艰 ， 最 终 导 致 扩 增 产 物 量 非 常 之 小 ， 以 至 于 无 法 检 测 。 正 所谓 强 者 更 强 、 弱 者 更 弱 。导 致 不 平 衡 的 原 因 ： 1、 引 物 特 异 性 ； 2、 最 佳 退 火 温 度 不 一 致 ； 3、 引 物 二 聚 体 ； 4、 模 板 量 不 同 ； 5

5、、 引 物 扩 增 效 率 引物特异性如 果 引 物 与 体 系 中 其 他 非 目 的 基 因 片 段 结 合 能力 更 强 ， 那 么 目 的 基 因 结 合 引 物 的 能 力 就 会 受到 竞 争 ， 从 而 导 致 扩 增 效 率 下 降 。严 格 blast验 证 最佳退火温度不一致将 多 对 引 物 放 置 入 一 个 体 系 中 扩 增 ， 由 于 进 行PCR反 应 的 退 火 温 度 相 同 ， 所 以 要 求 每 一 对 引物 的 最 佳 退 火 温 度 接 近 。前 期 引 物 设 计 时 减 少 最 佳 退 火 温 度 的 差 异 ， 最佳 退 火 温 度 的 差 异

6、 不 超 过 35 为 宜 。 引物二聚体 包 括 引 物 间 的 二 聚 体以 及 引 物 自 身 所 形 成的 发 卡 结 构 ， 还 有 一类 是 第 三 方 DNA介 导的 二 聚 体 ， 这 些 二 聚体 和 非 特 异 引 物 一 样都 会 干 扰 引 物 与 目 标结 合 位 点 的 竞 争 ， 影响 扩 增 效 率 。 针 对 不 同 对 引 物 之 间二 聚 体 ， 目 前 可 以 采用 Visual OMP6软 件（ 7天 试 用 版 ） 进 行 验证 。 引物扩增效率这 个 因 素 很 重 要 ， 但 也 很 笼 统 ， 它 也 许 包 含 了上 面 提 到 的 几 个

7、因 素 ， 但 更 多 的 因 素 还 不 清 楚 。引 物 的 扩 增 效 率 到 目 前 为 止 ， 还 没 有 一 个 可 以明 确 的 定 量 计 算 方 法 。目 前 也 有 文 章 提 出 使 用 统 计 学 方 法 ， 利 用 qPCR的 数 据 建 立 一 个 模 型 ， 来 预 测 引 物 与 目 标 序 列的 扩 增 效 率 。 http:/srvgen.upct.es/efficiency.html 不对称PCR 用 不 等 量 的 一 对 引 物 进 行 模 板 的 扩 增 ， PCR扩 增 后 产 生大 量 的 单 链 DNA。 这 对 引 物 分 别 称 为 非 限

8、 制 性 引 物 和 限制 性 引 物 。 在 扩 增 过 程 前 10-20个 循 环 ， 其 扩 增 产 物 主 要 是 双 链 DNA，但 当 限 制 性 引 物 (低 浓 度 引 物 )消 耗 殆 尽 ， 不 再 引 导 扩 增 ，而 非 限 制 性 引 物 (高 浓 度 引 物 )引 导 的 PCR会 继 续 进 行 ， 从而 就 会 产 生 大 量 的 单 链 DNA。 不对称PCR优缺点优点可 以 获 得 大 量 SSDNA，快 速 进 行 下 游 操 作 。比 如 直 接 进 行 测 序 ，或 者 下 游 杂 交 检 测 无需 经 过 变 性 这 一 步 骤 。缺点 前 期 1

9、0-20循 环 相 当 于 对称 扩 增 ， 单 链 DNA在 此之 后 才 会 出 现 ， 从 而 导致 PCR扩 增 循 环 数 增 加 ，灵 敏 度 较 对 称 性 扩 增 低 。 不 对 称 扩 增 对 于 低 拷 贝样 本 的 扩 增 较 难 ， 对 于病 原 体 检 测 需 要 更 详 尽的 PCR设 计 和 优 化 。 不对称PCR设计 设 计 不 对 称 PCR引 物 时 ， 限 制 性 引 物 的 Tm值 较 非 限制 性 引 物 Tm值 高 46 ， 扩 增 效 果 更 佳 。 不 对 称 PCR设 计 在 于 控 制 限 制 性 引 物 （ 低 浓 度 引 物 ）的 绝

10、对 量 ， 限 制 性 引 物 过 多 或 过 少 ， 均 不 利 于SSDNA的 制 备 。 限 制 性 引 物 量 可 以 考 虑 设 置 在 0.8-1.5P之 间 。 设 置 限 制 性 引 物 量 后 ， 再 通 过 实 验 验 证 限 制 性 引 物浓 度 和 非 限 制 性 引 物 浓 度 的 比 例 ， 目 前 常 用 比 例 1:3、1:5、 1:10、 1:15、 1:20进 行 优 化 ， 一 般 情 况 下 ， 1:10、1:20比 例 情 况 下 效 果 可 能 更 佳 。 增加单链的方法1、 纳 米 金 微 粒 介 导 不 对 称 扩 增 纳 米 金 颗 粒 可 以

11、 增 强 PCR扩 增 效 率 和 特 异 性 ， 有 可能 是 由 于 金 纳 米 颗 粒 与 单 链 引 物 之 间 特 异 性 结 合 ， 类似 单 链 结 合 蛋 白 SSB功 能 ， 一 直 PCR非 特 异 性 扩 增 ，更 重 要 的 可 能 是 ， 金 纳 米 颗 粒 的 热 效 率 和 热 传 导 ， 在液 相 中 ， 纳 米 颗 粒 可 以 快 速 传 递 热 量 并 且 与 周 围 环 境在 10200ps内 形 成 热 平 衡 ， 增 强 扩 增 效 率 。 通 过 金 纳米 颗 粒 介 导 进 行 的 不 对 称 PCR， 可 以 获 得 与 普 通 不 对称 PCR

12、更 好 的 效 果 。2、 LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR) 多重不对称PCR重要影响因素引 物 二 聚 体引 物 特 异 性 主 要 是 导 致 不 对 称 PCR限 制 性 引 物 和 非 限 制 性 引物 比 例 的 改 变 ， 或 者 限 制 性 引 物 绝 对 量 的 改 变 ，从 而 导 致 扩 增 差 异 化 或 者 扩 增 失 败 。 多重不对称PCR设计软件PrimerPlex（ 付 费 ） 一 款 设 计 特 征 寡 核 苷 酸片 断 、 用 于 同 时 分 析 100种 核 酸 序 列 的 工 具 。Mpprimer（ 开 放 、 在 线 ） 最 多 一 次 可 以 设计 6对 引 物 、 基 于 PP3内 核 。PP5/Oligo 6+ OMP 6（ 目 前 芯 片 组 设 计 多 重 不对 称 扩 增 采 用 的 软 件 ） 多重不对称PCR步骤引 物 设 计（PP5/OLIGO6) BLAST验 证 引物 特 异 性 OMP软 件 验 证引 物 二 聚 体 评价每 对 引 物 进 行单 扩 并 验 证 不对 称 扩 增 引 物最 佳 比 例将 所 有 引 物 并入 一 贯 体 系 进行 实 验 验 证选 出 出 现 问题 的 引 物 进行 重 新 设 计