基因工程综合实验开题报告格式

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1、项目名称：基因工程菌中Taq聚合酶的提取及活性鉴定DNA探针的标记与Southern杂交学 院：生命科学学院专业年级：12生技2班成员及学号：陈光煜3125413118任勇杰3125313131吴艺委3125413128吴少烽31254131162015 年 4 月 12 日一、立题意义及国内外的研究现状与存在问题实验二TaqDNA聚合酶是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，最早于1976年首次从水生栖热 菌中分离得到。由于TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性，Saiki等于1988年将该酶成功地 用于PCR技术Taq酶在PCR反应中所起的作用是利用其聚合酶活性以DNA为 模板，将dNTP中的脱

2、氧单核苷酸逐个加到3-0H末端；同时利用其外切酶活性 即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5端水解 核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链 替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。VentTM DNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent） 中分离的超级嗜热菌-能生长于98C中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的， 故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100C高温且2h 以上仍有活力，并且具有3-5外切酶活性的校正能

3、力，错误扩增的机率比Taq酶 降低一倍。近年，经过基因改造的Hot St ar t Taq DNA聚合酶，因其低温时酶没有活性, 94C-95C加热后开始反应，从而抑制了低温条件下的非特异性扩增，大大提高了 PCR 反应的特异性，同时Hot Start Taq DNA聚合酶能为PCR反应提供更高的产量及灵敏度、 特异性，已逐渐成为PCR技术的主流。不过，Taq聚合酶的缺点之一为催化DNA合成时 的相对低保真性。它缺乏3-5核酸外切酶的即时校正机制，出错率为1/9000。实验三探针标记：目前作为探针的标记物有两大类：一类是同位素，一类是非同位素PCR标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq酶的作用

4、下，将DIG-11 -dUTP掺入到新 合成的DNA链中，适用于100bp10kb的DNA探针的标记：PCR标记方法是目前较先进的 标记方法，可用于制备高比活性的DNA探针,较其他标记方法而言，不但经济、快速， 而且具有模板用量少（210ng），纯度不高的模板也可用于标记的优点，需要优化的条件 少，标记探针的灵敏度、产量都较高 ，因此被广泛应用于基因组 Southern印迹， Northern印迹，文库筛选，斑点/狭缝印迹，原位杂交等。随机引物标记，即本实验采用的同位素标记方法，是以六聚寡核苷酸为引物，待标 记的DNA为模板，在DNA聚合酶Klenow片段作用下，将DIG -11- dUTP掺

5、入到新合成 的DNA链中，适用于100bp2kb的DNA探针的标记。随机引物标记法对模板纯度要求 很高，而且所需模板量较大，耗时较长，制备后的探针需纯化后才可用于杂交分析，否 则会造成较高的杂交背景。随机引物法标记的探针不具备上述PCR标记法的优点。Southern印迹杂交又称凝胶电泳压印杂交技术，是进行基因组DNA特定序列定位的 通用方法。该技术是1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温迈 勒萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）创建。具有一定同源性的两条核酸单链在一定的 条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶

6、电泳分离经 限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙 膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行 杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交 技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固 相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与 同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸 纤维膜上。印迹方法如电转法

7、、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、 ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中 某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 当前，使用0. 4 mol L NaOH溶液将琼脂糖凝胶上的DNA在变性的同时转移到尼龙膜上, 晾干膜后无需固定就可以直接用于杂交。预杂交液和杂交液选用Church缓冲系统，该 缓冲系统中仅需10 g L BSA作为封闭剂即可。整个洗膜过程可简化为一种溶液、2 3次洗涤。碱变性及转移后的尼龙膜，也可以用于地高辛（DIG）等非放射性检测系统, 并可耐多轮杂交和洗脱。本方法可

8、适用于包括高等植物基因组在内的多种生物材料的 DNA检测。Southern印迹杂交最大的不足是操作程序繁琐，对基因组DNA的提取、纯化、酶 切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需要反复摸索。二本课题的主要研究内容和方法、步骤、预期结果实验二主要研究内容：TaqDNA聚合酶的提取及活性鉴定方法：透析袋处理提纯、SDS-PAGE检测提取纯化的TaqDNA聚合酶纯度步骤：（一）活化和诱导（1）划线分离，37C过夜（2）挑取单菌落接种到适量LB培养基的试管中（含6080 口 g/mL氨苄青霉素 AMP100）, 37C振荡培养过夜。（3）以1: 100 （ v/v）的比例转接到同样的培养基中，37C、

9、200r/min继续培养到 0D600值约为0.81.0 （对数中期，大约6.57.5h）（4）加入IPTG至终浓度为2.0mmol/L，继续振荡培养，诱导12 h。（二）重组Taq DNA聚合酶的提取和纯化收集菌体（3500g离心10min）!每40 mL菌液离心后加入4 mL洗脱缓冲液，重悬（加入比例10:1）!3500 g离心3 min重新收集菌体!加入2mL预裂解缓冲液，重悬，室温放置15 min （20:1）!加入2 mL裂解缓冲液（现配现用），75C孵育1 h （20:1）!然后将裂解混合液转移到离心管，4C 15000g离心15 min20min!转移上清至新的离心管中，加入1.

10、2g硫酸铵（每毫升上清液加0. 3g，终浓度30%）, 室温迅速混匀，4C静置过夜（有文献说室温放置更佳）!15000g离心15 min20min，将蛋白沉淀物重新悬浮至800 口 L洗脱缓冲液（50:1）!在储存透析液（现配现用）中透析（需前处理）至少12 h。透析后，用储存缓冲液 1： 1稀释，储存于-20 C（三）Taq DNA聚合酶的活性PCR测定以提取的Taq DNA聚合酶和商品Taq DNA聚合酶分别进行PCR扩增（PCR体系和条件 见实验“目的基因PCR扩增产物的克隆”），比较扩增效果，并拍照。（四）Taq DNA聚合酶的分子量及纯度检测以商品Taq DNA聚合酶为对照，用4 %

11、浓缩胶和12 %分离胶的十二脘基磺酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测提取纯化的Taq DNA聚合酶的纯度，各取20 口 L加入等 量的2X上样缓冲液，100C加热3min，冷却后即可上样，同时将低分子量蛋白标准品作 平行处理。预期结果：提取的Taq DNA聚合酶和商品Taq DNA聚合酶分别进行PCR扩增，扩增 效果无明显差异。提取的Taq DNA聚合酶通过十二脘基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳跑出来的条带与 商品酶的结果无明显差异。实验三主要研究内容：DNA探针的标记与Southern杂交方法：放射性同位素标记DNA探针、Southern杂交步骤：一、放射性同位素标记DNA探针（

12、随机引物标记）在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动DNA的合成。如 果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的随机序列（如6碱 基引物则有46 =4096种），可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，四种核 苷酸底物中有一种是用同位素标记的，因而可产生均匀一致高比活放射性探针。同位素 标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比,The klenow fragment去除了 E.coli DNA polymerase I的5 3 的外切酶活性，具有5 3 的聚合酶活性及3 5 外切 酶活性。二、Southern 杂交（PCR-Sou

13、thern 杂交）（一）探针模板的制备利用PCR方法对杂交目的基因进行PCR扩增，并回收PCR产物，以供探针制备和杂 交。注意：PCR时应多做几管，以便增加PCR产物的回收量。（二）探针的制备(1) 向一个反应管仲中加入lg模板DNA (线性或超螺旋)和高压灭菌的双蒸水， 终体积达16 口 L。(2) 沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全变性对于 标记的有效性是十分重要的。(3) 充分混合DIG-High Prime (1号管)，并取4 口 L加入到变性DNA中，混合并 简单离心，37C孵育1小时或者过夜。注意：较长的孵育时间(最高达20h)能够提高地 高辛标记D

14、NA的产量。(4) 加入 2 口 L 0.2M EDTA (pH8.0)和/或 65C加热 10min 终止反应。(三) 转膜和固定(1) 选取有代表性的植物基因，进行PCR特异扩增，然后将PCR产物点样于浓度为 1.5%的琼脂糖凝胶上，在3V/cm的电压下电泳1h。(2) 电泳完毕后，将凝胶用ddH2O漂洗两次，用锋利刀片切去凝胶多余的部分，并 在凝胶左上角切去一角作为标记。(3) 将凝胶转入数倍体积的变性液中，温和摇动45min，使DNA变性。(4) 将凝胶转入去离子水中漂洗片刻，转入中和液室温温和振荡5min使之中和， 更换中和液再浸泡15min。(5) 浸泡的同时，准备一块长和宽均大于

15、凝胶的玻璃板，上面用滤纸覆盖，充当吸 液灯芯。将盖有滤纸的玻璃置于一塑料盒上(宽于玻璃板)，内注入足量2XSSC溶液， 液面略低于玻璃板，待滤纸充分浸湿后用玻棒赶尽气泡。(6) 用刀片裁一张硝酸纤维素滤膜，长和宽分别比凝胶大1mm。随后将裁好的滤膜 用去离子水彻底浸湿，剪去一角后在2XSSC溶液中浸泡1520min。(7) 从中和液中取出凝胶，翻转以使其背面向上，后放于玻璃板上滤纸的中央位置, 赶尽气泡，并用parafilm膜封住凝胶边缘，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝 胶上方的纸层中。(8) 在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条 边缘应刚好超过凝胶上部

16、加样孔一线的边缘，用玻棒赶尽滤膜与凝胶间的气泡。(9) 用2XSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的滤纸，放于硝酸纤维素滤膜上方， 用玻棒赶尽气泡。(10) 切一叠(58cm高)略小于滤纸的上方，上部放置玻璃板和重物。转移824h， 其间及时更换滤纸并补充2XSSC溶液。(11) 转移结束后，去除滤纸，翻转凝胶和滤膜，经凝胶的一面朝上，置于一张干 的滤纸上，用铅笔轻轻地在滤膜上标记加样孔的位置。然后将滤膜在6XSSC溶液中于室 温浸泡5min,然后将其置于一滤纸上于室温晾干30min以上，随后在80C烘烤30min2h, 然后将滤膜用两层滤纸包好放于28C下备用。(四) 分子杂交(1) 配制预杂交

17、液，每平方厘米硝酸纤维素膜约需预交液0.2ml。(2) 将含有靶DNA的硝酸纤维素膜漂浮于6XSSC液面上使由上而下完全湿润后， 使滤膜在液体内浸泡2min。(3) 将滤膜封入杂交袋，留一小口，按照每平方厘米硝酸纤维素膜加入0.2ml预交 液，赶尽气泡后，严密封口，外面再套一个杂交袋后放入恒温水浴摇床中，42C轻轻摇 动，预杂交30min或过夜。(4) 预杂交的同时，68C预热杂交液，并按2025ng/ml取出5ul探针于沸水浴中 变性5min，然后迅速置于冰上冷却3min，加入到预热好的杂交液中。(5) 将预杂交液倒掉，迅速向袋中加入预热的杂交液(含标记探针)，赶尽气泡后 封好，再套一个杂交

18、袋并封口后于42C杂交过夜。(6) 取出滤膜，于滤膜漂洗缓冲液I中漂洗2X5min。(7) 取出滤膜，于经6568C预热的滤膜漂洗缓冲液II中漂洗2X15min同时于 6568C不断搅动。(五) 免疫检测杂交和严谨洗涤后，将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗1-5min；在100mL封阻液中孵育30min；在20mL抗体溶液中孵育30min；用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min；在20mL检测缓冲液中平衡2-5min；将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上(或者杂交袋)，向膜上加入2mL 的新鲜配制的底物显色液。均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。保持膜静止，避光。 15-25C中孵育到有

19、颜色出现为止；三、研究工作时间安排及具体进度周一（5.4）：进行实验二前的各项准备工作，配制LB培养基、洗脱缓冲液（4C）、 裂解缓冲液、储存缓冲液、储存透析液；将Tris-HCl（pH7.9） 0.5mol/L、EDTA 0.5mol/L、 KC1 lmol/L、甘油、无菌水高压灭菌；将 IPTG 100mmol/L ； DTT 0.648mol/L； AMP 100mmol/L；过滤除菌，-20C保存；并进行透析袋使用前处理；活化和诱导：（1）划线 分离，37C过夜（2）挑取单菌落接种到适量LB培养基的试管中（含6080 u g/mL氨苄 青霉素AMP100）, 37C振荡培养过夜。（3）

20、以1: 100 （ v/v）的比例转接到同样的培养基中， 37C、200r/min继续培养到0D600值约为0.81.0 （对数中期，大约6.57.5h） （4）加入 IPTG至终浓度为2.0mmol/L，继续振荡培养，诱导12 h。周二（5.5）：进行重组Taq DNA聚合酶的提取和纯化：收集菌体（3500g离心10min） f每40 mL菌液离心后加入4 mL洗脱缓冲液，重悬（加入比例10:1）3500 g离心3 min 重新收集菌体f加入2mL预裂解缓冲液，重悬，室温放置15 min （20:1）加入2 mL 裂解缓冲液（现配现用），75C孵育1 h （20:1）然后将裂解混合液转移到离

21、心管，4C 15000g离心15 min20min转移上清至新的离心管中，加入1.2g硫酸铵（每毫升上清液 加0.3g，终浓度30%），室温迅速混匀，4C静置过夜一15000g离心15 min20min，将蛋 白沉淀物重新悬浮至800 UL洗脱缓冲液（50:1）在储存透析液（现配现用）中透析（需 前处理）至少12 h。透析后，用储存缓冲液1: 1稀释，储存于-20C周三（5.6）下午：进行Taq DNA聚合酶的活性PCR测定：以提取的Taq DNA聚合 酶和商品Taq DNA聚合酶分别进行PCR扩增，比较扩增效果,并拍照。同时进行Taq DNA 聚合酶的分子量及纯度检测：以商品Taq DNA聚

22、合酶为对照，用4 %浓缩胶和12 %分离 胶的十二脘基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测提取纯化的Taq DNA聚合酶 的纯度，各取20 uL加入等量的2X上样缓冲液，100C加热3min,冷却后即可上样，同 时将低分子量蛋白标准品作平行处理。周六（5.9）上午：配制实验所需溶液，有母液、转膜和固定所需工作液、杂交工作 溶液、免疫检测工作液。周六（5.9）下午：进行探针模板的制备（利用PCR方法）、探针的制备（过夜孵育）周日（5.10）：进行转膜（转移8h）以及固定（烘烤30min）,以及部分的分子杂交 （预杂交30min，杂交过夜。周一（5.11）：进行分子杂交剩余步骤，以及

23、进行免疫检测（显色）。、预期所需药品和仪器名称及数清单实验二旋涡混合器，移液枪，枪头，1.5ml微量离心管，40或50ml离心管，双面离心管架, 台式冷冻离心机，紫外分光光度剂，水浴锅，制冰机，PH计，恒温摇床，磁力搅拌器， 电泳仪，梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，烧杯，针筒，滤头，培养皿，试剂瓶。实验材料(1) 菌种：含Taq DNA聚合酶基因的E.coli工程菌(2) 酵母提取物，蛋白胨，NaCl,琼脂粉，AMP (氨苄青霉素)，葡萄糖，EDTA (乙二胺 四乙酸)，Tris (三羟甲基氨基甲烷)，溶菌酶，盐酸，氯化钾，PMSF (苯甲基磺酰氟)， 吐温-20, NP-40(乙基苯基聚乙二醇)

24、，DTT(二硫苏糖醇)，甘油，IPTG,无水酒精。实验三尼龙膜，DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I实验材料1. 杂交母液的配制(1) 5M NaCl：称取292.2g NaCl溶于800ml ddH 0中，定容至1L，高压灭菌。2(2) 10M NaOH:称取 80g NaOH 溶于 140ml ddH 0 中，定容于 200ml。2(3) 20XSSC：称取 175.3gNaCl、88.2g 柠檬酸钠溶于 800ml ddH 0 中，用 10M 的 NaOH2调pH7.0,定容至1L。(4) 1M Tris-HCl：

25、称取 121.1g Tris 加入 800ml ddH 0 中，边搅拌边加入 40ml 浓2 HCl，最后用稀HCl调pH8.0,定容至1L，高压灭菌。(5) 1M马来酸：称取23.2g马来酸溶于200ml ddH 0中，高压灭菌。2(6) 10%SDS:称取 10g SDS 溶于 100ml ddH 0 中。2(7) 0.5M EDTA：称取 29.22g EDTA 溶于 100ml ddH 0 中调 pH8.0,定容至 200ml,2 咼压灭菌。2. 转膜和固定所需工作液(1) 变性液(1.5M NaCl, 0.5M Na0H)： 500ml ddH 0 中加入 300ml 5M NaCl

26、 和 50ml 102 Na0H，定容至1L即可。(2) 中和液(1M Tris-HCl pH7.4, 1.5MnaCl)： 400ml ddH 0 加入 300ml 5M NaCl,2称取121.1g Tris,边搅拌加加入40ml浓HCl,最后稀HCl调pH7.4,定容至1L,高压 灭菌。(3) 2XSSC:将20XSSC按照1:10稀释即可，定容至1L,高压灭菌。(4) 6XSSC：取300ml 20XSSC稀释至1L，高压灭菌。(5) 0.2M EDTA:取 40ml 0.5M EDTA 稀释至 100ml,高压灭菌。(6) 滤膜漂洗缓冲液 I(2XSSC,0.1%SDS)：在 800ml ddH O 中加入 100ml 20XSSC2和10ml 10%SDS，定容至1L,高压灭菌。(7) 滤膜漂洗缓冲液II(0.5XSSC, 0.1%SDS)：在 800ml ddH O 中加入 25ml 20XSSC2和10ml SDS，定容至1L,高压灭菌。3杂交工作溶液的制备预杂交液：分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶(7号瓶)中， 然后立即在37C条件下搅拌5min进行溶解。杂交液：预杂交液和探针混合。4.免疫检测工作液的制备洗涤缓冲液、马来酸缓冲液、检测缓冲液、TE缓冲液、封阻溶液、抗体溶液、底物显 色液五、指导教师意见